(4)结合:快速加入滴度为2X 19 pfu/yL的文库噬菌体，50yL/孔，室温温和摇动3h;在这个过程中；
(5)洗涤:用TBST洗涤3次；
(6)洗脱:在每孔中加入10yL洗脱液，室温温和摇动60min;
(7)扩增:将第一轮筛选得到的噬菌体在大肠杆菌ER2738中进行扩增和纯化，得到次级肽库；
(8)包被标签蛋白hIgGl-Fc(10yg/mL)于96孔板，50yL/孔；
(9)快速加入1yL与靶蛋白rhLAG3-Fc结合的噬菌体克隆，室温温和摇动Ih;
(10)取出1yL测定其滴度，其余噬菌体克隆进行扩增，纯化得到的次级肽库后测定滴度；
经过3~5轮的亲和淘选，即可富集得到含目的多肽的噬菌体。
[0025]最后，对筛选所得的噬菌斑进行扩增，具体步骤为:
(1)将ER2738过夜培养菌液以1:100的比例接种于LB液体培养基，2mL/管分装到灭菌的试管中；
(2)选取最后一到两轮的淘选物滴度平板上的克隆，挑取单一蓝色噬菌斑到上述培养管中；
(3)将试管置于37°C摇床中、剧烈震荡培养5?6h；
(4)将上述培养物4°C、13000rpm、离心2min，再将上清转入新鲜离心管，此即为扩增的噬菌体贮液。
[0026]结果分析，即多肽序列的同源性分析
取上述噬菌斑扩增后的噬菌体贮液400yL进行噬菌体克隆DNA测序，同时根据此测序结果推导噬菌体克隆所编码的氨基酸序列，再通过DNAMAN软件对获得的氨基酸序列进行同源性分析。结果表明，在两种方法所得到的数个插入十二肽序列中，亲和肽N13是共有的，即是特异性的结合于LAG-3的，而亲和肽N13的序列为Asp-Asp-Phe-Arg-Val-Trp-Trp-Pro-Asn-Phe-Pro-Arg，即DDFRVffffPNFPR0
[0027]实施例2
本实施例主要就LAG-3亲和肽N13的人工合成制备方法简要介绍如下。
[0028]LAG-3亲和肽N13的制备方法，采用Fmoc固相多肽合成法制备而成，其技术原理是:选用Rink树脂与待合成肽C端的第一个Fmoc-氨基酸羧基以共价键形式连接，再以该氨基酸的N端作为该条多肽合成的起点，并让其与下一个氨基酸的羧基端发生脱水缩合反应，形成肽键;然后，将N端的Fmoc-氨基酸的保护基进行脱保护，再让第二个氨基酸的N端与后面的氨基酸的羧基反应;如此不断重复这一过程直至多肽合成完毕;最后再将合成的多肽从树脂上切割下来，经过乙醚沉淀与洗涤，得到粗肽，进一步提纯后即可获得亲和肽N13的纯品。
[0029]其具体合成过程详述如下:
首先，溶胀树脂:
(1)树脂的溶胀:称取约0.15gRink树脂置于多肽合成仪内，加入适量的DMF，浸泡约10min使树脂充分溶胀，用真空栗抽出合成仪中的DMF溶液；
(2)洗涤:DMF两次—MeOH(甲醇)三次—DCM(二氯甲烷)三次—DMF两次，摇床中震荡洗涤，每次洗涤两分钟，洗涤结束时用真空栗将液体抽干；
其次，添加第一个氨基酸:
(3)添加第一个氨基酸:计算首个氨基酸、HoBt、DIC的量，并将氨基酸和HoBt用少量的DMF溶解后加入合成仪中，再吸取DIC加入合成仪;室温下震荡反应5h;
(4)洗涤:同步骤(2);
(5 )测定取代值:在290nm的波长下，挑取树脂，烘干后称量树脂的质量，将树脂装入5mL的离心管中，加入3mL的脱保护液震荡1min，测定样品的OD值;取代值在0.3-0.4最佳；
(6)封头:向合成仪加入适量的封头液震摇20min，共两次；
(7)洗涤:同步骤(2);
第三，添加后续氨基酸:
(9)脱保护:加入适量的脱保护液，摇床室温震荡反应20min，共2次；
(10)洗涤:同步骤(2);
(11)茚检:挑取少量树脂放入茚检管，加入茚检试剂，沸水浴2min后，观察树脂颜色，若树脂为蓝色为正常；
(12)后续氨基酸的添加:计算并将称量的氨基酸和HOBt，用少量DMF溶解后加入多肽合成仪，加入DIC，置于摇床中，室温下震荡反应2.5 h;
(13)洗涤:同步骤(2)。
[0030](14)茚检:同步骤(11)，树脂为透明的亮黄色，且无蓝斑，则说明氨基酸缩合完全，可进行下一步反应；
(15)重复步骤(9)?(14)直至完成整条肽链的缩合反应； 第四，切割多肽:
(16)脱保护:同步骤(9);然后茚检:同步骤(11);再后洗涤，同步骤(2);
(17)切割:在通风橱中配置切割试剂并将其迅速倒入合成仪，搅拌器缓慢搅拌切割3h
左右；
反应完毕后，用真空抽滤栗将切割试剂抽滤至圆底烧瓶中，再用DCM把搅拌桨和树脂冲洗几遍，液体也移至圆底烧瓶中；
(18)旋转蒸发:把旋转蒸发仪的温度调整为65°C，将切割液旋转蒸发，以便去除TFA等有机溶剂；
(19)离心:将乙醚沉淀混合液，2000rpm离心2min，弃上清收集沉淀，用冰乙醚重悬洗涤沉淀5次；
(20)烘干:将收集的粗肽沉淀于37°C烘箱烘干，电子分析天平称重，然后将其密封并置于冰箱中-20°C保存。
[0031]对所收集的粗肽进一步纯化后即可进一步进行试验检测，纯化时可采用RP-HPLC进行粗肽的纯化，纯化体系为:乙腈，1%。;TFA=30%?50%;检测波长是228nm。
[0032]对纯化后的LAG-3亲和肽N13进行检测后，结果表明其纯度大于95%，可以较好用于后续实验。
[0033]对所制备的亲和肽N13进行进一步的质谱分析，其质谱鉴定结果如图1所示，ES1-MS质谱分析证实其分子量符合理论值，即亲和肽N13的分子量为1634.8 Da0
[0034]实施例3
以实施例2所制备的LAG-3亲和肽N13为例，本实施例主要对LAG-3亲和肽N13与LAG-3的亲和效果进行了体外阻断实验，结果表明其可以阻断LAG3/MHC-1I信号通路，相关实验情况介绍如下。
[0035](I)将THP-1细胞用20ng/mL的IFN-r刺激 12h，后冰上孵育Ant1-Human HLA-DR APC流式抗体，然后流式细胞仪检测发现其表面的配体HLA-DR分子表达量达到最高，并且细胞状态良好；
(2)将上述刺激过的THP-1细胞上孵育不同浓度的LAG3-FC融合蛋白，后冰上孵育Ant1-human IgGl-Fc PE抗体，用流式细胞仪检测得到上述刺THP-1细胞表面LAG3_Fc融合蛋白的结合量约为400ng;
(3用PBS将亲和肽N13溶解，配置浓度分别为0.1μM、0.5μM、lμM的肽溶液，然后与400ng的LAG3-Fc蛋白在冰上晃动孵育50min ；
(4 )把孵育后的上述混合液与THP-1细胞在冰上再共同孵育60min;
(5)离心后，弃上清，并加入荧光二抗，冰上避光孵育20min后洗涤，上流式细胞仪检测其荧光强度。
[0036]不同多肽浓度的实验结果如图2所示。从图2可以得知，与对照组(不加N13肽)相比较，N13肽在浓度(0.5?ΙμΜ)时所对应的峰图偏移程度较大，则显示出N13肽有较好的阻断效果，其中横坐标FL2-H表示平均荧光强度。
[0037]实施例4
以实施例2所制备的LAG-3亲和肽Ν13为例，本实施例主要对亲和肽Ν13在体内的抗肿瘤活性进行了动物体内实验，相关实验过程介绍如下。
[0038]采用荷CT26(结肠癌)的Balb/c小鼠进行了抑瘤率实验，于每只小鼠背部部位荷瘤细胞约2 X 17个，5天后随机分组。共分为NS(生理盐水，阴性对照组)、N18(无关肽对照组)、N13-H(LAG3亲和肽高剂量，2.0mg/kg)、N13-L(LAG3亲和肽低剂量，0.5mg/kg)，共4组，每组Balb/c小鼠8?10只。
[0039]给药时，上述肽均溶于生理盐水中制成相应浓度的多肽药物，-20°C分装保存备用。
[0040]各组均采用瘤旁给药方式，共给药7天。实验期间小鼠自由进食和饮水。停止给药后，继续观察小鼠的生存状况，得到荷瘤小鼠的生存期数据。
[0041]实验期间每隔一日测量小鼠体重及肿瘤的长径(a)、短径(b)，然后按公式(体积=jt/6 X a X b2)计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。
[0042]需要说明的是，N18肽是以rhLAG3-Fc为靶分子，通过噬菌体十二肽库筛选得到的，但经过鉴定得知它是一条假阳性肽，因此可作为阳性对照。
[0043]实验期间小鼠体重变化情况如图3所示。从图3中可以看出，LAG-3亲和肽N13给药组的体重变化在正常范围内，可以初步表明LAG-3亲和肽没有明显毒副作用。
[0044]实验期间小鼠体内肿瘤体积变化情况如图4所示。从图4中可以看出，亲和肽N13给药组的瘤体积比阴性对照生理盐水组和无关肽对照组都要小，而低浓度的亲和肽N13更有优势，此结果表明LAG-3亲和肽N13具有一定的抗肿瘤应用前景。
[0045]实验期间小鼠的生存率结果如图5所示。从图5中可以看出，LAG-3亲和肽N13能延长荷瘤小鼠的生存期，此结果表明LAG-3亲和肽N13作为肿瘤治疗的药物应用时，能够明显延长生物体的生存期，具有一定地抗肿瘤应用效果。
【主权项】
1.一种LAG-3亲和肽N13，其特征在于，该亲和肽包括12个氨基酸，分子量为1634.8Da,其序列如序列表SEQ ID N0.1所示，具体序列如下: Asp-Asp-Phe-Arg-Val-Trp-Trp-Pro-Asn-Phe-Pro-Arg,即DDFRVffffPNFPR02.权利要求1所述LAG-3亲和肽NI3的制备方法，其特征在于，采用Fmoc固相多肽合成法制备。3.权利要求1所述LAG-3亲和肽N13作为肿瘤治疗中药物的应用。
【专利摘要】本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种LAG-3亲和肽N13、制备方法及其在抗肿瘤方面的应用。该亲和肽包括12个氨基酸，分子量为1634.8Da，其序列具体DDFRVWWPNFPR。该肽可采用Fmoc固相多肽合成法制备，同时该肽可作为肿瘤治疗中的药物应用。本申请以真核蛋白rhLAG3-Fc为靶分子，以hIgG1-Fc为标签蛋白，通过噬菌体展示肽库高通量技术筛选出了LAG-3胞外段的亲和肽N13。针对该肽，进一步的体外信号通路阻断试验和小鼠荷瘤试验表明，该肽在肿瘤治疗、延长生物体生存期方面具有较好地应用前景，为生物体肿瘤的免疫治疗提供了新的可能。
【IPC分类】C07K7/08, A61K38/10, A61P35/00
【公开号】CN105504018
【申请号】CN201610019890
【发明人】高艳锋, 张璐宁, 李国栋, 祁元明, 翁海波
【申请人】郑州大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月13日