一种抗内毒素的偶联生物分子及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学领域，具体的涉及一种抗内毒素的偶联生物分子及其制备和 应用
【背景技术】
[0002] 内毒素 （endotoxin )，又称脂多糖(Lipopo Iy saccharide，LPS)是革兰氏阴性菌细 胞外膜的主要成分之一，在细胞增殖或死亡的时候会释放到细胞外环境中。游离的LPS可被 LPS结合蛋白（LPS binding protein，LBP)识别并形成复合物，与宿主细胞膜上的模式识别 受体(PRR) - To 11样受体4 (TLR4)、MD-2和CD4复合物结合，引起MyD88-依赖性和MyD88-非依 赖性信号通路激活。在巨噬细胞中，该通路可促进多种炎症因子释放，例如:TNF-a[10-12]， IL-li3[13-16]和IL-6等。正常情况下，LPS被宿主细胞识别后引起的免疫反应可受精确调 控，包括细胞因子产生和释放、补体激活和其他后续生物学效应。这些反应可提高机体对有 害病原体侵袭的抵御、杀灭和清除能力。但大量LPS产生和累积会过度刺激TLR介导的免疫 应答，导致炎症因子失控性表达和释放，引起严重的细胞和组织损伤;且过量炎症因子会导 致机体发生临床常见危重病症一脓毒症(Sepsis)，有资料显示该病症的死亡率可达50%以 上。目前，国内外众多科研团队针对有效预防和治疗LPS所致脓毒症方面做了大量的探索和 研究，但目前尚无一种安全有效的特异性中和LPS的制剂。
[0003] 宿主防御肽(Host defense peptides，HDPs)是由多细胞有机体免疫系统产生的 一类阳离子小肽，有着广泛的生物学活性，例如:直接杀灭病原微生物、调节机体免疫系统 和其他生物学反应作用。目前，大量研究均表明：HDPs具有调节过量细菌感染诱发的宿主免 疫系统过度炎症反应作用，因此非常有希望作为脓毒症预防和治疗的新型药物应用到临床 实践中。大量源于动物、植物甚至细菌的HDPs被提取和研究;其中较成功的有多粘菌素 B、细 菌穿透蛋白，CAP-18和黄蜂毒素肽等，他们均显示出强大的体外中和LPS作用和体内提高致 死剂量脓毒症休克模型小鼠生存率的作用。
[0004] 源于海洋节肢动物中国鲎和美洲鲎蓝色血液中的HDPs-鲎抗内毒素因子(LiimUus anti-LPS factor，LALF)，因具有抑制LPS诱导的炎症连锁反应作用而受到我们关注。课题 组前期分析研究了 LALF的核心功能区域(第31到52氨基酸残基），对其结构进行优化、改造 和活性筛选后得到一段具有优良抗LPS作用的新型环状肽-CLP-19XLP-19由19个氨基酸残 基组成，首尾环化，具有阳离子、两亲性结构。CLP-19活性研究表明：CLP-19具有直接中和内 毒素的作用，并能显著提高内毒素休克小鼠模型和急性腹膜炎小鼠的生存率。但是其生物 半衰期不足lh，存在生产成本高、绝对用量大等问题。
[0005] 因此，有必要提供一种新的具有更长的半衰期、更低廉的成本、和更少用量的宿主 防御肽分子，以用来治疗或预防内毒素脓毒症、脓毒症性休克等疾病或症状。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的，在于提供一类半衰期长、成本低、用量少的预防或治疗内毒 素脓毒症、脓毒症性休克等疾病或症状的偶联生物分子。
[0007] 本发明的第二个目的在于提供制备所述抗内毒素的偶联生物分子的方法。
[0008] 本发明的第三个目的在于提供上述偶联物分子及其氮端衍生物的医学应用。
[0009] 为了达到本发明的第一个目的，本发明的发明人选取中国专利200510057195.4中 的（RREMP) :CRKPT FRRLK WKIKF KFKC作为母体分子(重新命名为:CLP-19)，对其碳端进行 amPEG修饰，从而提供了一种抗内毒素的偶联生物分子，所述偶联生物分子为通式（1)所示 化合物，
[0010] Y-CLP-19-amPEG(l)
[0011] 其中，CLP-19为鲎抗内毒素因子模拟肽分子;Y选自氢、酰基、CI-C18的烷基、芳基 苄基和烯丙基中的一种;amPEG的分子量为500-20000Da。
[0012]可选的，Y为氢、酰基。
[0013] 可选的，amPEG的分子量为500_2000Da。
[0014] 本发明还提供了所述偶联生物分子的药用盐。
[0015] 在本发明中，所述的药用盐为药物可接受的盐形式。"药物可接受的盐"指适合于 与人或动物的组织接触，无过多的毒性、刺激、变态反应等。药物可接受的盐是本领域熟知 的。这种盐可以在本发明的化合物肽的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将游离的碱 或酸与适当的有机或无机酸或碱反应单独制备。代表性酸加成盐包括但不限于醋酸、三氟 乙酸、二己酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、庚酸盐、己 酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、草酸盐、丙酸 盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐。优选的，所述盐为所述偶联生物分子的醋 酸盐、三氟乙酸盐，特别优选的，所述盐为所述偶联生物分子的醋酸盐。
[0016] 本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括本发明所述的偶 联生物分子或其药用盐。可选的，所述药物组合物还包括药物可接受的载体。所述药物组合 物的形式可以为注射液或微乳液。可以根据药物组合物的形式选择使用本领域常用的药物 可接受的载体物质。在所述药物组合物中，活性成分的含量不低于85%。所述载体物质的种 类包括但不限于生理盐水。
[0017] 本发明还提供了该偶联生物分子在制备细菌杀灭药物或内毒素血症治疗药物中 的应用
[0018] 本发明还提供了所述偶联生物分子的合成方法，包括以下步骤：
[0019] (1)母体树脂 Fmoc-CLP-19-CTC 合成
[0020] 称取多肽合成氨基酸树脂倒入合成柱中，加入溶剂溶胀，以10 %-50 %的DMF溶液 脱除多肽合成氨基酸树脂的Fmoc保护基团；依照CLP-19的氨基酸序列进行后续偶联，循环 完成整个CLP-19肽链的合成，得到母体肽树脂Fmoc-CLP-19-CTC;
[0021 ] (2)氮端衍生物Y-CLP-19-CTC制备
[0022] 将Fmoc-CLP-19-CTC母体肽树脂倒入合成柱中，加入溶剂溶胀，抽干后加入20%-50 %六氢吡啶的DMF溶液脱除Fmoc，洗涤后加入酰基化试剂的DMF溶液，搅拌或通氮气或振 荡，控温;偶联完成后，除去反应液，以001、1^0!1、01^、001、01^依次洗涤，抽干，从合成柱中 取出合成的CLP-19肽衍生物树脂，置于冻干机中冻干，得Y-CLP-19-CTC;
[0023] (3)采用逐步合成法或片段合成法进行Y-CLP-19-amPEG分子的合成。
[0024] 可选的，所述逐步合成法包括以下步骤：
[0025] (1)全保护 Y-CLP-19-amPEG 的制备
[0026] 脱除Fmoc步骤:在圆底烧瓶中加入Fmoc-AAn…AAl-amPEG，其中η取自1-14的整数， 再加入15-50 %六氢吡啶的DCM溶液，控温搅拌30-60min;旋蒸后用无水乙醚析出沉淀，抽滤 获得DCM-Et0H/Et20后重结晶2次，用P2O5真空干燥获得去Fmoc保护的AAn…AAl-amPEG，其中 η取自1-13的整数；
[0027] 偶联步骤:在圆底烧瓶中加入AAn-AAl-amPEG，其中η取自1-13的整数;保护氨基 酸Fmoc-AAx-OH，其中X取自2-19的整数;催化剂DMAP和DCM，溶解后加入DIC; 20-40°C油浴中 电磁搅拌，TLC检测反应过程;反应停止后进行旋蒸，用无水乙醚析出沉淀，对沉淀进行抽滤 并用无水乙醚洗涤3次，再用DCM/Et 20或DCM_Et0H/Et20重结晶2次，茚三酮监测，应与空白颜 色相同或相似，用P 2O5真空干燥获得全保护的肽树脂Fm〇c-AArr"AA卜amPEG，其中η取自1-14 的整数，称重计算收率；
[0028] 重复上述脱除Fmoc、偶联操作，实现14个氨基酸的偶联，得到全保护Fmoc-CLP-19-amPEG，称重计算收率；
[0029] (2)CLP-19_amPEG 制备
[0030] A.Fmoc-CLP-19-amPEG制备：全保护Fmoc-CLP-19-amPEG lg，冰冷下加入IOml各组 分体积比为90:5:3:2的裂解试剂TFA/Thioanisole/EDT/anisole，电磁搅拌2-4h，氮气吹去 大部分TFA，用无水乙醚沉淀后离心;DCM溶样，无水乙醚沉淀，离心分出固体;再重复2次，冻 干，得到侧链无保护Fmoc-CLP-19-amPEG粗品，HPLC纯化、冻干、得到纯品，用氨基酸组成分 析等方法确证结构；
[0031 ] B.CLP-19-amPEG制备:将Ig全保护Fmoc-CLP-19-amPEG除去Fmoc保护基后，按上述 A法裂解去侧链保护，沉降、离心、重结晶后得到全保护的-CLP-19-amPEG粗品；该粗品以适 量水溶解后用乙醚沉降，离心得固体;再重复2次，得较纯品；