专利名称：一种制备抗体-美登素类生物碱药物偶联物的方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体-美登素生物碱类药物偶联物的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术：
随着靶向治疗药物的开发，癌症的治疗取得了显著的进步。近几年来，研究人员利用癌细胞表面选择性表达的细胞受体和抗原，开发了许多抗体药物，这些抗体可以与肿瘤细胞进行特异性结合。在此基础上，将细胞毒素分子，比如细菌和植物毒素、放射性核素和某些化学治疗药物与抗体进行化学连接，得到抗体-药物偶联物，这类抗体-药物偶联物在与肿瘤细胞结合后释放药物或激活药物的细胞毒活性，将肿瘤细胞杀灭。抗体-药物偶联物的特异性可以降低对正常细胞的毒性，因此提高了药物在患者体内的耐受性。美登素(Maytansine)首先是由Kupchan等人从东非灌木齿叶美登木(Maytenusserrata)中分离出来。美登素生物碱是一类高度细胞毒性的药物，据研究，它的毒性要比传统的癌症化疗药物如甲氨蝶呤、柔红霉素等的细胞毒性要强100至1000倍，参见US3896111。之后，发现一些微生物也可以产生美登素生物碱，如美登木醇(maytansinol)和美登木醇的C-3酯，参见US4151042。美登素是有丝分裂抑制剂，已报道，用美登素处理的L1210细胞，导致67%的积累在有丝分裂期，而未被处理的对照细胞显示范围在3.2%至5.8%之间。用海胆卵和蛤卵的研究显示，美登素通过抑制微管蛋白的聚合而干扰微管的形成，从而抑制有丝分裂。参见Remillard,189Sciencel002_1005 (1975)。由于美登素生物碱的高度细胞毒性，预示它们在治疗癌症中有作用，不过，美登素生物碱的临床试验并不令人满意 ，主要是由于它们的副作用。对中枢神经系统和胃肠症状的副作用导致患者拒绝进一步治疗，并且美登素生物碱似乎和周围神经病相关，该周围神经病可能是累积的(Issel at207)o通过制备抗体-美登素生物碱偶联物可以定向将药物传送至靶细胞位点，从而降低对正常组织和细胞的毒性，降低美登素生物碱的副作用。CN101087611A报道了用不可切割接头连接抗体与美登素生物碱制备的偶联物和用可切割接头连接抗体与美登素生物碱制备的偶联物相比，两者具有相同的体外和体内抗肿瘤活性，但是前者在血浆清除率和毒性方面显示了显著的降低。US5208020和US5416064等公开了制备抗体-美登素生物碱偶联物的方法，首先用双功能连接剂与单克隆抗体偶联，利用S印hadex G25色谱柱纯化连接上连接剂的单克隆抗体，再将连接有连接剂的单克隆抗体与过量的含巯基的化学毒素偶联，再次利用Sephadex G25色谱柱纯化。CN101087611A也公开了与US5208020、US5416064相同的方式制备抗体-美登素生物碱偶联物的方法，即先将双功能连接剂与单克隆抗体偶联，纯化获得第一混合物，再与化学毒素偶联，进行纯化获得偶联物。利用这种方式获得的抗体-药物偶联物纯度低并且不稳定。例如，CN101087611A实施例中公开的曲妥珠-SMCC-DMl偶联物的纯度只有95%左右，并且蛋白聚体物的含量占到了 4.2%以上，这种高聚物的存在在治疗过程中存在引起较高免疫源性的风险。CN102596922A公开了一种新的双功能连接剂，即在传统的双功能连接剂上并入亲水性的PEG间隔物将其修饰为亲水性连接体。利用这种连接剂偶联得到的抗体-药物偶联物可以允许每个抗体分子偶联最多15个药物分子，从而提高了连接效率。同时，也公开了一种新的抗体-药物偶联的方法，即先将双功能连接剂和化学药物连接，在将其和单克隆抗体连接。利用这种偶联方法减少了偶联中的纯化步骤，提高了产物收率，同时也大大降低了抗体-药物偶联物的异质性。但是，利用该专利文件公开的方案合成亲水性的双功能连接剂是一件比较繁琐的化学反应过程，可能会限制此种双功能连接剂的应用。且CN102596922A公开的偶联方法合成曲妥珠-SMCC-DMl，利用TSK-GEL尺寸排阻层析(流动相含有15%的异丙醇，可以更好的将偶联物单体与聚体分开)分析发现仍然含有高达4%的偶联物聚体。并且，为了获得合适偶联率，即偶联物中药物与抗体的摩尔比，一般需要在反应时加入6-10倍过量的药物，例如，在曲妥珠-SMCC-DMl制备中，需要投入7-9倍过量的药物，一般在7.5-8.5倍之间，使成本增加。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种高偶联效率制备抗体-美登素生物碱偶联物的偶联方法，该方法制备获得的偶联物具有合适的偶联率、高的纯度和低的内毒素含量。本发明的详细技术方案如下:一种抗体-美登素类生物碱药物偶联物的制备方法，包括以下步骤:( I)抗体置换缓冲液利用超滤浓缩或者脱盐层析的方式置换抗体原液至反应缓冲液中，反应缓冲液中含有0.02% 0.p/ov/v的表面活性剂，浓缩至抗体浓度在20 30mg/ml ;得置换后的抗体；所述的抗体原液单克隆抗体的原液；(2)制备美登素生物碱类药物母液取连接有双功能连接剂的美登素生物碱类药物，即双功能连接剂-美登素生物碱，用有机溶剂溶解，制备含有10mg/ml美登素生物碱药物的母液。(3)偶联反应按双功能链接剂-美登素生物碱与抗体的摩尔比为5 6:1的比例，将第(I)步中得到的置换后的抗体与第(2)步中得到的美登素生物碱母液混合，进行偶联反应，反应温度20 30°C，反应时间I 4小时；(4)阴离子交换层析将上述反应液上样至阴离子交换层析柱进行纯化；首先用平衡缓冲液平衡阴离子层析柱，然后上样，层析柱载量为30-50mg/ml，上样流速为75-lOOcm/h，收集流穿液，上样完毕后，再用平衡缓冲液冲洗阴离子层析柱，直至收集完毕；(5)脱盐层析将上述 阴离子交换层析收集的流穿液进行S印hadex G25脱盐层析柱纯化；脱盐缓冲液平衡脱盐层析柱，脱盐缓冲液含有0.02 0.1% (v/v)的表面活性剂，将阴离子交换层析的收集液上样至脱盐层析柱，流速为2 5cm/h，收集第一个出峰样品，即为所制备的抗体-美登素生物碱类药物偶联物。根据本发明优选的，步骤(I)所述的抗体原液选自曲妥珠单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗。根据本发明优选的，步骤(I)所述的置换抗体原液的反应缓冲液选自磷酸钠盐缓冲液、磷酸钾盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液或者磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，缓冲液pH6.0
9.0 根据本发明优选的，步骤(I)所述的超滤浓缩或者脱盐层析的方式可以采用现有技术，例如可以通过Pellicon系统进行超滤浓缩，或采用S印hadex G25凝胶层析柱进行脱盐层析。根据本发明优选的，步骤(I)所述的表面活性剂主要是指非离子型表面活性剂，优选脂肪酸山梨坦类和聚山梨酯类，其中脂肪酸山梨坦类优选司盘40、司盘60;聚山梨酯类优选吐温20、吐温40、吐温60和吐温80，表面活性剂的用量为0.02% 0.1% (v/v)。根据本发明优选的，步骤(2)所述的有机溶剂选自二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)或乙醇(EtOH)。根据本发明优选的，步骤(3)所述的双功能连接剂选自N-琥珀酸酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酸酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸酯)(LC-SMCC)，均可购自苏州昊帆生物技术公司。根据本发明优选的，步骤(3)所述的美登素生物碱类药物是由安丝菌素P-3合成的。合成美登素生物碱药物的方法参照文献J Med.Chem.2006，49，4392-4408的方法进行。安丝菌素P-3可市购。例如购自妍域生物培养基公司。根据本发明优选的，步骤(3)所述的连接有双功能连接剂的美登素生物碱类药物可以参照CN102596922A的
段提供的方法合成。根据本发明优选的，步骤(4)所述的阴离子交换层析的层析介质选自QSepharose > DEAE Sepharose、Capto Q> Capto DEAE > Cap to Adhere,优选使用 Capto Adhere。根据本发明优选的，步骤(4)所述的阴离子交换层析所用的平衡缓冲液可以与步骤(I)所用的反应缓冲液相同，也可以选择不同的缓冲液；阴离子交换层析所用的平衡缓冲液可以选自磷酸钠盐缓冲液、磷酸钾盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液或者磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，缓冲液中仍需要添加0.02% 0.1% (v/v)的表面活性剂。所述表面活性剂与步骤(I)的表面活性剂相同。根据本发明优选的，步骤(5)所述的脱盐层析使用的脱盐缓冲液选择柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸缓冲液或磷酸盐缓冲液，缓冲液中含有0.02% 0.1% (v/v)的表面活性剂。所述表面活性剂与步骤(I)的表面活性剂相同。在本发明中，步骤(4)所述的阴离子交换层析采用穿出模式，即所需要得到的抗体-药物偶联物单体流穿，抗体-药物偶联物聚体被吸附在阴离子层析柱上；为了提高阴离子交换层析纯化的效果，本发明选择了较低的线性流速，一般为75 lOOcm/h，层析载量30 50mg/ml。在本发明中，步骤(5)所述的脱盐层析为S印hadex G25色谱柱纯化，为有效的将未反应的美登素生物碱类药物、有机溶剂等和抗体-美登素生物碱药物偶联物分开，选择了较低的线性流速，一般为2 5cm/h。本发明方法中所述的“抗体”可以为任何免疫球蛋白，任何免疫球蛋白片段如Fab、F (ab’)2、dsFv、sFv、双抗体和三链抗体，或者免疫球蛋白嵌合体，它们可以与细胞表面上的抗原结合。抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体，最优选择为单克隆抗体。单克隆抗体是指均质的抗体分子，其对特定的抗原为特异性的。一般通过B淋巴细胞单克隆产生。本方法中优选抗体为人源化单克隆抗体，比如包括huN901、huMy9-6、huB4、huC242、曲妥珠单抗、帕尼单抗和利妥昔单抗等。本发明方法中使用的细胞毒性剂为美登素生物碱，选自DMl (化学名称为N2’-脱乙酰-N2’ -3-巯基-1氧代丙基)-美登素)，DM4 (化学名称为N2’ -脱乙酰-N2’ -4-甲基-4巯基-1氧代戊基)_美登素)。细胞毒性剂也可选其他合适的化学毒性药物，即可导致细胞死亡、引诱细胞死亡或者减少细胞生存力的任何化合物，合适的细胞毒性剂选自紫杉烷类、CC-1065和CC-1065类似物或多拉司他汀及类似物等。优选的所述美登素生物碱为DMl或DM4。本发明方法，优选的抗体-美登素类生物碱药物偶联物为:曲妥珠-SMCC-DM1、W尼-SMCC-DMl、西妥昔-SMCC-DMl。根据本发明，优选的技术方案一，曲妥珠-SMCC-DMl偶联物的制备方法，步骤如下:(I)利用S印hadex G25色谱柱纯化脱盐层析方式置换曲妥珠单抗原液至反应缓冲液，反应缓冲液组成为0.1M磷酸钠盐，pH7.5，含0.05%v/v的吐温20 ;浓缩抗体浓度至20mg/ml，制得置换的曲妥珠抗体；(2)称取SMCC-DM1，用二甲基乙酰胺(DMA)充分溶解制备10mg/ml的SMCC-DMl母液；(3)按SMCC-DMl与抗体的摩尔比为5 5.5: 1，在步骤(I)所制备的曲妥珠单抗中加入步骤(2)配制的SMCC-DMl母液，开始偶联反应，反应温度为25°C，反应时间为1.5h ；(4)将上述反应液上样Capto Adhere阴离子交换层析柱。层析柱先用步骤(I)中相应的反应缓冲液进行平衡，然后将步骤(3)反应完毕后的反应液上样，流速为75cm/h，载量为35mg/ml，收集流穿样品，上样完毕后，用相应的反应缓冲液冲洗，至收集完毕；(5)将上述经阴离子交换层析的收集液分别进行S印hadex G25脱盐层析。脱盐层析柱先用脱盐缓冲液平衡，流速为3cm/h。所用的脱盐缓冲液为20mM琥珀酸，0.05%吐温20，pH5.5。上样完毕后，用同样的缓冲液冲洗，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品，即为制备的曲妥珠-SMCC-DMl偶联物。本发明优选技术方案二，帕尼-SMCC-DMl偶联物的制备方法，如实施例3所述。本发明优选技术方案三，西妥昔-SMCC-DMl偶联物的制备方法，如实施例4所述。 在单克隆抗体纯化过程中，一般采用阴离子交换层析的流穿模式去除单抗聚体，因为单抗聚体一般要比单体带有更多电荷而容易被吸附在阴离子交换介质上。偶联反应中产生的偶联物聚体也可通过阴离子交换层析去除。另外，阴离子交换层析还具有去除内毒素的作用，降低了临床用药时的隐患。本发明技术方案的特点:在抗体置换缓冲液步骤即采用加入表面活性剂的缓冲液，这样在后续的偶联反应体系中，可以增加增加药物的亲水性，提高偶联反应的效率，从而降低偶联反应的投料比。同时，在后续纯化步骤中加入表面活性剂的缓冲液也可以有效的降低抗体-药物偶联物因为药物疏水性而产生偶联物聚体的几率。在抗体纯化步骤中，增加了一步阴离子交换层析步骤，和没有增加阴离子交换层析的偶联工艺相比，可以提高终产品的纯度，降低了产品中内毒素含量，而对偶联率和总收率几乎无影响。本发明的优良效果在于:1、在制备抗体-美登素生物碱偶联物的反应缓冲液以及之后的纯化缓冲液中添加了表面活性剂，从而使制备抗体-美登素生物碱偶联物具有较高的效率，以曲妥珠-SMCC-DMl为例，在同等比例下进行偶联反应，添加表面活性剂的偶联反应的投料比与未添加表面活性的投料比相比，投料比可由1:7.5降低至1:6，大大提高了偶联反应的效率，降低了成本。2、通过增加一步阴离子交换层析使制备的抗体-美登素生物碱偶联物具有较高的纯度和较低的内毒素含量。以曲妥珠-SMCC-DMl为例，SEC-HPLC纯度达到98%以上，形成的抗体-药物偶联物聚体小于2% ;产品内毒素含量由现有技术的0.8EU/mg降低为0.2EU/mg，抗体-药物偶联物中游离药物的水平小于2% (相对于总药物)。
具体实施例方式偶联率的测定方法:测定偶联率是指测定每个单抗分子上连接有美登素生物碱类药物的数量，即美登素生物碱类药物摩尔数与单抗摩尔数的比值。可采用紫外分光光度法和质谱分析法两种方法测定。紫外分光光度法:通过测定抗体-美登素生物碱类偶联物在252nM和280nM处的紫外吸收值，并通过朗伯比尔定律进行计算得出偶联率；质谱分析法:对抗体-美登素生物碱偶联物进行ES1-MS分析，可以获得连接不用个数药物的峰型图，根据各个峰的面积进行计算得出偶联率。通过两种方法获得的偶联率具有很好的一致性。偶联物浓度测定:采用紫外分光光度法，测定出在252nM和280nM处的紫外吸收值，通过朗伯比尔定 律即可计算出抗体和药物的浓度；本发明中所述的偶联物浓度是单抗浓度与连接到单抗上的美登素生物碱药物的总和。SEC-HPLC分析:利用GLK3000高效分子筛柱对抗体-美登素生物碱药物进行分析，流动相选用20mM PB，15%异丙醇，pH7.0。按照面积归一法计算偶联物聚体和偶联物单体所占的比例。内毒素含量检测:参照《中国药典2010版三部》附录ΠΙ E细菌内毒素检查法进行。以下通过实施例进一步说明本发明，但是，应当理解，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应将其理解为用于以任何形式限制本发明。在本文中，除非另外说明，所用试剂均为市售产品。实施例中的连接有双功能连接剂的美登素生物碱类药物(即双功能连接剂-美登素生物碱)为SMCC-DMl。SMCC购自苏州昊帆生物技术公司，DMl是通过安丝菌素P_3参照文献JMed.Chem.2006, 49，4392-4408的方法进行合成的，其中安丝菌素P_3购自妍域生物培养基公司。SMCC-DMl参照CN102596922A的
段提供的方法合成。实施例中的产品采用“抗体-双功能连接剂-美登素生物碱”的表达方式。实施例1、制备曲妥珠-SMCC-DMl偶联物，验证加入表面活性剂后对偶联效率的影响。曲妥珠-SMCC-DMl偶联物的制备方法，步骤如下:
( I)抗体置换缓冲液利用脱盐层析(S印hadex G25)方式置换曲妥珠单抗原液至反应缓冲液Al (0.1M磷酸钠盐，pH7.5)中，并浓缩抗体浓度至20mg/ml,制备曲妥珠抗体Al ；利用脱盐层析(S印hadex G25)方式置换曲妥珠单抗原液至反应缓冲液A2 (0.1M磷酸钠盐，pH7.5，0.05%v/v吐温20)中，并浓缩抗体浓度至20mg/ml,制备曲妥珠抗体A2 ；(2 )制备 SMCC-DMl 母液称取SMCC-DMl，用二甲基乙酰胺(DMA)充分溶解制备10mg/ml的SMCC-DMl母液；(3)偶联反应在步骤(I)所制备的曲妥珠单抗中加入步骤(2)配制的SMCC-DMl母液，开始偶联反应，反应温度为2 5°C，反应时间为1.5h ;反应分为三组进行:a:使用反应缓冲液Al和曲妥珠抗体Al，反应中加入7.5倍过量摩尔比的SMCC-DMl 母液；b:使用反应缓冲液A2和曲妥珠抗体A2，反应中加入7.5倍过量摩尔比的SMCC-DMl 母液；c:使用反应缓冲液A2和曲妥珠抗体A2，反应中加入5.5倍过量摩尔比的SMCC-DMl 母液；(4)阴离子交换层析分别将上述a、b、c三组反应液上样Capto Adhere阴离子交换层析柱。层析柱先用步骤(I)中相应的反应缓冲液进行平衡，然后将步骤(3)反应完毕后的反应液上样，流速为75cm/h，载量为35mg/ml，收集流穿样品，上样完毕后，用相应的反应缓冲液冲洗，至收集完毕；(5)脱盐层析将上述三组经阴离子交换层析的收集液分别进行S印hadex G25脱盐层析。脱盐层析柱先用脱盐缓冲液平衡，流速为3cm/h。a组样品所用的脱盐缓冲液为20mM琥珀酸，PH5.5，b组和c组样品所用的缓冲液为20mM琥珀酸，0.05%v/v吐温20，pH5.5。上样完毕后，各组分别用相应的缓冲液冲洗，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品，即为制备的曲妥珠-SMCC-DMl偶联物。将获得的曲妥珠-SMCC-DMl偶联物利用紫外分光光度法(分别测定偶联物在252nm和280nm的吸光度)计算产品的浓度和偶联率，同时也使用质谱分析法计算产品的偶联率，并进行对比，数据见表I。表I添加表面活性剂对偶联效率的影响
WuI产品浓度(mg/ml)[HI偶联率(紫外法) I偶联率(质谱法)
曲妥珠 -SMCC-DMla~ 6.5089.5%~ 3 213.19
曲妥珠 -SMCC-DMlb~ 6.2390.05% 4.304.37
曲妥珠 -SMCC-DMIc~ 6 3687.6%~ &2Γθ6LUUBUJ /yv衣丄HJ以有，彐現作欲补义系十1孙一疋里tfJ衣凹低 土介1J U.UD7o tfJH工脑Δ )
可以有效的提高偶联效率。相同摩尔投料比可以获得较高的偶联率，同时降低摩尔投料比为5.5时即可获得3.5左右偶联率的抗体-药物偶联物。实施例2、在偶联工艺中加入阴离子交换层析可以降低偶联物聚体的含量和内毒
素含量。曲妥珠-SMCC-DMl偶联物的制备，步骤如下:(I)抗体置换缓冲液:首先利用脱盐层析(Sephadex G25)方式置换曲妥珠抗体原液至反应缓冲液(0.1M磷酸钠盐，pH7.5, 0.05%v/v吐温20)中，浓缩抗体浓度至20mg/ml ；(2)制备SMCC-DMl母液:称取与步骤(I)中曲妥珠单抗摩尔比5.5倍的SMCC-DMl，用二甲基乙酰胺(DMA)充分溶解制备10mg/ml的SMCC-DMl母液；(3)偶联反应:在步骤(I)所制备的曲妥珠单抗中加入步骤(2)配制的SMCC-DMl母液，开始偶联反应，反应温度为25°C，反应时间为1.5h;将反应液分为d、e两组，d组只进行脱盐层析，e组先进行阴离子交换层析，再进行脱盐层析；(4)阴离子交换层析将上述e组反应液上样Capto Adhere阴离子交换层析柱。层析柱先用步骤(I)中的反应缓冲液进行平衡,然后上 样相应的反应液,流速为75cm/h,载量为35mg/ml,收集流穿样品，上样完毕后，用反应缓冲液冲洗，至收集完毕；(5)脱盐层析将上述e组阴离子交换层析的收集液和d组的反应液分别进行S印hadex G25脱盐层析。脱盐层析柱先用脱盐缓冲液平衡，流速为3cm/h，所用的缓冲液为20mM琥珀酸，
0.05%v/v吐温20，pH5.5。平衡完毕后上样，用缓冲液继续冲洗，根据UV280吸收值收集出峰样品，即为制备的曲妥珠-SMCC-DMl偶联物。将获得的曲妥珠-SMCC-DMl偶联物利用紫外分光光度法(分别测定偶联物在252nm和280nm的吸光度)计算产品的浓度和偶联率，同时利用SEC-HPLC检测产品的纯度，利用鲎试剂法检测产品中内毒素含量。表2阴离子交换层析对偶联物的影响
权利要求
1.一种抗体-美登素类生物碱药物偶联物的制备方法，包括以下步骤 (1)抗体置换缓冲液 利用超滤浓缩或者脱盐层析的方式置换抗体原液至反应缓冲液中，反应缓冲液中含有O.02% O. 1%ν/ν的表面活性剂，浓缩至抗体浓度在20 30mg/ml ;得置换后的抗体； 所述的抗体原液单克隆抗体的原液； (2)制备美登素生物碱类药物母液 取连接有双功能连接剂的美登素生物碱类药物，即双功能连接剂-美登素生物碱，用有机溶剂溶解，制备含有10mg/ml美登素生物碱药物的母液； 优选的，所述美登素生物碱为DMl或DM4 ； (3)偶联反应 按双功能链接剂-美登素生物碱与抗体的摩尔比为5 6:1的比例，将第(I)步中得到的置换后的抗体与第(2)步中得到的美登素生物碱母液混合，进行偶联反应，反应温度20 30°C，反应时间I 4小时； (4)阴离子交换层析 将上述反应液上样至阴离子交换层析柱进行纯化；首先用平衡缓冲液平衡阴离子层析柱，然后上样，层析柱载量为30-50mg/ml，上样流速为75-lOOcm/h，收集流穿液，上样完毕后，再用平衡缓冲液冲洗阴离子层析柱，直至收集完毕； (5)脱盐层析 将上述阴离子交换层析收集的流穿液进行S印hadex G25脱盐层析柱纯化；脱盐缓冲液平衡脱盐层析柱，脱盐缓冲液含有O. 02 O. 1%ν/ν的表面活性剂，将阴离子交换层析的收集液上样至脱盐层析柱，流速为2 5cm/h，收集第一个出峰样品，即为所制备的抗体-美登素生物碱类药物偶联物。
2.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤(I)所述的抗体原液选自曲妥珠单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗。
3.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤(I)所述的置换抗体原液的反应缓冲液选自磷酸钠盐缓冲液、磷酸钾盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液或者磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，缓冲液PH6. O 9. O。
4.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤(I)所述的超滤浓缩或者脱盐层析的方式可以采用现有技术，例如可以通过Pellicon系统进行超滤浓缩，或采用Sephadex G25凝胶层析柱进行脱盐层析。
5.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤(I)所述的表面活性剂为司盘40、司盘60、吐温20、吐温40、吐温60和吐温80。
6.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的有机溶剂选自二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)或乙醇(EtOH)。
7.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述的双功能连接剂选自N-琥珀酸酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酸酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-I-羧基-(6-酰氨基己酸酯)(LC-SMCC)。
8.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤(4)所述的阴离子交换层析的层析介质选自 Q Sepharose、DEAE Sepharose、Capto Q、Capto DEAE 或 Capto Adhere ；优选的，步骤(4)所述的阴离子交换层析所用的平衡缓冲液与步骤(I)所用的反应缓冲液相同。
9.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤(5)所述的脱盐层析使用的脱盐缓冲液选择柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸缓冲液或磷酸盐缓冲液，缓冲液中含有O.02% O. 1%ν/ν的表面活性剂；所述表面活性剂与步骤(I)的表面活性剂相同。
10.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤如下 (1)利用Sephadex G25色谱柱纯化脱盐层析方式置换曲妥珠单抗原液至反应缓冲液，反应缓冲液组成为O. IM磷酸钠盐，pH7. 5，含O. 05%v/v的吐温20 ;浓缩抗体浓度至20mg/ml，制得置换的曲妥珠抗体； (2)称取SMCC-DMl，用二甲基乙酰胺(DMA)充分溶解制备10mg/ml的SMCC-DMl母液； (3)按SMCC-DMl与抗体的摩尔比为5 5.5: 1，在步骤(I)所制备的曲妥珠单抗中加入步骤(2)配制的SMCC-DMl母液，开始偶联反应，反应温度为25°C，反应时间为I. 5h ； (4)将上述反应液上样CaptoAdhere阴离子交换层析柱。层析柱先用步骤(I)中相应的反应缓冲液进行平衡，然后将步骤(3)反应完毕后的反应液上样，流速为75cm/h，载量为35mg/ml，收集流穿样品，上样完毕后，用相应的反应缓冲液冲洗，至收集完毕； (5)将上述经阴离子交换层析的收集液分别进行S印hadex G25脱盐层析。脱盐层析柱先用脱盐缓冲液平衡，流速为3cm/h。所用的脱盐缓冲液为20mM琥珀酸，O. 05%吐温20，PH5. 5 ;上样完毕后，用同样的缓冲液冲洗，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品，即为制备的曲妥珠-SMCC-DMl偶联物。
全文摘要
本发明涉及一种制备抗体-美登素类生物碱药物偶联物的方法。该方法包括抗体置换至反应缓冲液中，双功能连接剂-美登素生物碱用有机溶剂溶解制得美登素生物碱药物的母液；按比例将置换的抗体与美登素生物碱母液混合，进行偶联反应，反应温度20～30℃，反应时间1～4小时；反应液进行阴离子交换层析，收集的流穿液进行SephadexTM G25脱盐层析柱纯化，收集第一个出峰样品，即为所制备的抗体-美登素生物碱类药物偶联物。本发明方法制得的抗体-美登素类生物碱药物偶联物具有合适的偶联率、高的纯度和低的内毒素含量。
文档编号C07K1/107GK103254311SQ20131016888
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月9日 优先权日2013年5月9日
发明者孙丽霞, 张宗辉, 周凯松, 艾现伟, 杨亚南, 王庆民, 张新强 申请人:齐鲁制药有限公司