P-19-amPEG的质谱图如图4所示。
[0058] 实施例2
[0059] 本实施例涉及实施例1制备获得的CLP-19-amPEG和Ac-CLP-19-amPEG对部分人源 病菌的抑制试验。
[0060] 1.实验菌株
[0061] 实验所用菌株为用标准菌大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213、铜 绿假单胞菌ATCC27853。
[0062] 2.培养基和试剂
[0063] Mue 11 er-Hinton (MH)培养基（液体、固体），中国药品生物制品检定所产品（批号 010925);磷酸盐缓冲液（O3BS):磷酸氢二钾8.17g，磷酸二氢钾0.87g，加入蒸馏水lOOOmL， 用0·IN NaOH调pH为6.0。
[0064] 3.仪器
[0065] 多点接种仪（日本仓光株式会社生产）
[0066] 电子天平（Sartorius，德国）
[0067] pHi十(Beckman 21，USA)
[0068] 可调移液器（eppendorf，USA)
[0069] 4.实验方法 [0070] 4.1供试液制备
[0071]精密分别称取待测多肽样品于2mL容量瓶中，分别用pH6.0磷酸盐缓冲液(PBS)溶 解，配成主药含量为3840mg/L储备液。
[0072] 4.2试验菌液制备
[0073] 实验前，从保存菌种的半固体培养基(或料面)上取适量的菌苔，接种在MH培养基 上，于37°C培养16-18h，再挑取新鲜的单个菌落接种在MH肉汤培养基中，于37°C增菌培养 16-18h，取出，每管菌液用MH肉汤培养基分别稀释为0.5麦氏比浊标准（含菌量10〃CFU/ mL)，保持菌液最终接种量为每点1044CFU。
[0074] 4.3最低抑菌浓度（(MIC)测定
[0075]采用琼脂二倍稀释法，将药物含量为3840mg/L的储备液用pH6.0PBS倍比稀释成系 列浓度，分别取ImL放入直径90_的平皿中，加入14mL熔化的MH琼脂培养基，混匀，即得主药 含量分别为256，128,64,32，16,8,4,2，l，0.5,0.25,0.125mg/L的系列琼脂平皿，待琼脂凝 固后，用多点接种仪在含药琼脂平皿及空白琼脂平皿表面点种细菌，37°C孵育24h观察结 果，未见细菌生长的平皿内的最小药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。实验结果见下表1(肽 CLP-19-amPEG，Ac-CLP-19-amPEG 和 CLP-19 对部分人源病菌的抑制试验(MIC:mg/L))。
[0076] 表 1
[0077]
[0078] 实验结果表明，以相同重量给药时，多数情况下经amPEG修饰的CLP-19-amPEG和 Ac-CLP-19-amPEG对于大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌具有较强的抑菌活性，且抑菌活性相 似;但其对金黄色葡萄球菌的抑菌活性较差。
[0079] 实施例3
[0080] 本实施例涉及本发明经amPEG修饰的变构肽CLP-19-amPEG和Ac-CLP-19-amPEG对 LPS致炎的RAW264.7细胞的影响。由于细胞受到内毒素 LPS攻击时，会主动应激发生炎症反 应，产生一系列炎症因子如肿瘤坏死因子TNF-a、白细胞介素 IL-6，IL-8等。为明确CLP-19和 经amPEG修饰的变构肽对LPS致炎的RAW264.7细胞的TNF-a水平的影响，开展本实验。
[00811 1.1材料与主要仪器
[0082] 1 · 1 · 1合成肽：CLP-19-amPEG、Ac-CLP-19-amPEG、CLP-19、amPEG(分子量500)
[0083] 1.1.2其它试剂
[0084] 细胞株:RAW264.7细胞株由第三军医大学免疫学教研室提供；
[0085] LPS 7261: Sigma公司产品;MDEM培养液：Invitrogen公司产品；
[0086] 定量PCR试剂盒= BIO-RAD公司产品；
[0087] 1.1.3主要仪器
[0088] 恒温孵育箱：Thermo Forma Model 3111 电子天平：Sartorius BP61
[0089] 96孔细胞培养板：corning移液枪:eppendorf
[0090] 定量PCR仪:BIO-RAD CFX-96
[0091]倒置显微镜:OLYMPUS CX31 [0092] 1.1.4主要试剂
[0093] 氯仿、异丙醇、无水乙醇TRIZOL
[0094] 反转录试剂BIO-RAD iScript? cDNA Synthesis Kit
[0095] 定量试剂BIO-RAD SsoFast? EvaGreen Supermix
[0096] 1.2实验方法
[0097] 1.2.1细胞试验：
[0098] 培养RAW264.7细胞，调整细胞悬液浓度为lx IOfVml，取Iml于6孔板内，置37°C， 5%⑶2培养箱培养过夜；用PBS清洗1次后加入LPS(终浓度100ng/ml)或LPS与多肽0^-19_ amPEG、Ac-CLP-19-amPEG、CLP-19(终浓度均为 20μg/ml)，置 37°C，5%C02 培养箱继续培养 4h 后，提取细胞RNA，检测TNF-a含量;每组设3复孔。
[0099] 1 · 2 · 2RNA 提取及反转 cDNA:
[0100] RNA提取按照TRIZOL-氯仿-异丙醇-乙醇提取法，最后每个样品用25μ1 DEPC水溶 解后，取ΙμL检测RNA浓度、纯度。取Iyg总RNA反转成cDNA，反转体系为：5x iScript reaction mix,4μ1；iScript reverse transcriptase，ΙμL;RNA template,lyg；Nuclease-free water，up to 20yl;，25°C5min，42°C30min，85°C5min，hold at 4°C;反转完成后样品 加入Nuclease-free water 20μ1，混合均勾，_20°C保存，备用。
[0101] 1 · 2 · 3TNF_a 定量检测：
[0102]以反转的cDNA为模板，以β-actin为内参，用定量PCR试剂盒检测样品中TNF-a在不 同浓度处理下表达变化情况。步骤按照试剂盒说明书操作，简要如下，定量体系为：2x SsoFast EvaGreen supermix，10μ1!Forward primer 0·3μ1!Reverse primer 0·3μ1;cDNA 2μ1 ;RNase-free water 7.4μ1;混合均勾后，定量检测，每组设3复孔。定量PCR循环扩增程 序为：94°C5min，94°C30sec，57°C30sec，72°C30sec，ReadPlate，Goto2to44cycles， Melt Curve;定量软件分析结果。
[0103] 1.2.4实验结果
[0104]合成肽抗炎效应试验结果见附图5。
[0105]实验结果分析:多肽PAP-2对LPS诱导的细胞活化具有不同程度抑制作用，呈现出 浓度依耐性。其中在高浓度（l〇〇μg/ml)，具有抑制作用，而2#尽管具有一定的活性但结果不 具有量效关系，其活性有待进一步研究。
[0106] 实施例4
[0107] 本实施例涉及采用生物传感器检测CLP-19-amPEG、Ac-CLP-19-amPEG、CLP-19、 amPEG与LPS的亲和力。
[0108] 1.材料
[0109] 本方案采用CN200710092699.9中所述，测定实施例1和2中制备的多肽与LPS的亲 和力
[0110] 2.方法
[0111] 2.1生物传感器疏水样品池 LPS的包被
[0112] 根据Thereto公司疏水样品池的包被流程，将LPS包被在疏水样品池中，并计算包 被的LPS量。具体步骤如下:根据包被的要求，仪器包被温度设定为22°C，搅拌速率设定为85 次/sec，数据采集设定为2次/sec;放入疏水样品池，异丙醇清洗50μ1χ5,收集数据曲线 Imin; PBS/AE清洗60μ1χ7，采集数据IOmin;异丙醇清洗50μ1χ7，采集数据曲线Imin;加入 2mg/ml的LPS氯仿溶液20ul (用前超声lOsec)，留置lmin;PBS/AE清洗50μ1χ7,采集数据 5min;lMHCl清洗50μlx5，留置lmin ;PBS/AE清洗6μlx7，采集数据5min;10mMNa0H清洗50μ 1x5，留置Imin; PBS/AE清洗60μ1χ7，采集数据5min，计算包被值；5mg/ml BSA90yl，保留 5min; PBS/AE清洗60μ1χ5，保留Imin;检查包被后的共根图形。
[0113] 2.2多肽样品与LPS的亲和力测定
[0114] 用PBS(pH7.0)配制模拟肽进行生物传感器检测。以不同的模拟肽溶液为流动相， 分别与疏水样品池中的LPS进行结合、解离、再生反应。具体步