骤如下：将模拟肽配制为 IOOuM浓度液;生物传感器搅拌速率设定为98次/sec，数据采集设定为3次/sec，温度设定为 25C;包被LPS的疏水样品池加入50ul的pH 6.0，0.02M I3BS，冲洗5次，保留至基线平衡后吸 出；结合反应:加入PBS 45以，再加入5μ1待测样品，结合反应平衡后吸出待测样品；解离反 应:PBS冲洗50μ1χ3，解离反应平衡后吸出；再生反应:0.1 N的HCl 50μ1Χ3，再生反应平衡后 吸出;PBS冲洗50μ1Χ3，曲线回至基线后加入45ylPBS，开始新的循环;储存实验数据。
[0115] 3.结果
[0116] 3.1生物传感器疏水样品池的包被
[0117] LPS 055:B5在疏水样品池中的包被量为201.2arc second(A，B两点间差的绝对 值），为脂类物质在疏水样品池中包被量的理想范围。根据厂商提供的检测方法，包被后的 基线为锐利对称的单峰图形，证明所包被的LPS在疏水样品池中形成均匀的单层脂膜。
[0118] 3.2多肽样品与LPS的亲和力测定
[0119] 与LPS亲和力最强者为Ac-CLP-19-amTOG，最弱者为TOG，亲和力高低依次为八〇-CLP-19-amPEG(7.681uM)>CLP-19-amPEG(8.415uM)>CLP-19(16.243uM)>PEG(143.22uM)。
[0120] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种抗内毒素的偶联生物分子，其特征在于，所述偶联生物分子为通式（1)所示化合 物， Y-CLP-19-amPEG (1) 其中，CLP-19为鲎抗内毒素因子模拟肽分子;Y选自氢、酰基、C1-C18的烷基、芳基苄基 和烯丙基中的一种;amPEG的分子量为500-20000Da。2. 根据权利要求1所述的偶联生物分子，其特征在于，Y为氢或酰基。3. 根据权利要求1或2所述的偶联生物分子，其特征在于amPEG的分子量为500-2000Da。4. 权利要求1-3中任意一项所述的偶联生物分子的药用盐。5. -种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有权利要求1-3中任意一项所述 的偶联生物分子或权利要求4所述的药用盐。6. 权利要求1-3中任意一项所述的偶联生物分子或权利要求4所述的药用盐在制备细 菌杀灭药物或内毒素血症治疗药物中的应用。7. 权利要求1-3中任意一项所述的偶联生物分子的合成方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 母体树脂 Fmoc-CLP-19-CTC 合成： 称取多肽合成氨基酸树脂倒入合成柱中，加入溶剂溶胀，以10%_50%的DMF溶液脱除 多肽合成氨基酸树脂的Fmoc保护基团；依照CLP-19的氨基酸序列进行后续偶联，循环完成 整个CLP-19肽链的合成，得到母体肽树脂Fmoc-CLP-19-CTC; (2) 氮端衍生物Y-CLP-19-CTC制备： 将?111〇(3-〇^-19-(：1'(：母体肽树脂倒入合成柱中，加入溶剂溶胀，抽干后加入20%-50% 六氢吡啶的DMF溶液脱除Fmoc，洗涤后加入酰基化试剂的DMF溶液，搅拌或通氮气或振荡，控 温;偶联完成后，除去反应液，以001^ 60!1、01^、001、01^依次洗涤，抽干，从合成柱中取出合 成的0^-19肽衍生物树脂，置于冻干机中冻干，得￥-0^-19-(：1'(：; (3) 采用逐步合成法或片段合成法进行Y-CLP-19-amPEG分子的合成。8. 根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，所述逐步合成法包括以下步骤： (1) 全保护Y-CLP-19-amPEG的制备： 脱除Fmoc步骤:在圆底烧瓶中加入Fmoc-AAn…AAl-amPEG，其中η取自1-14的整数，再加 入15-50 %六氢吡啶的DCM溶液，控温搅拌30-60min;旋蒸后用无水乙醚析出沉淀，抽滤获得 DCM-Et0H/Et20后重结晶2次，用P2〇5真空干燥获得去Fmoc保护的AAn…AAl-amPEG，其中η取 自1-13的整数； 偶联步骤：在圆底烧瓶中加入AAn…ΑΑ1 -amPE G，其中η取自1 -13的整数;保护氨基酸 Fmoc-AAx-OH，其X取自2-19的整数;催化剂DMAP和DCM，溶解后加入DIC; 20-40°C油浴中电磁 搅拌，TLC检测反应过程;反应停止后进行旋蒸，用无水乙醚析出沉淀，对沉淀进行抽滤并用 无水乙醚洗涤3次，再用DCM/Et 20或DCM-Et0H/Et20重结晶2次，讳三酮监测，应与空白颜色相 同或相似，用P 2〇5真空干燥获得全保护的肽树脂Fmoc-AAn…AAl-amPEG，其中η取自1-14的整 数，称重计算收率； 重复上述脱除Fmoc、偶联操作，实现14个氨基酸的偶联，得到全保护Fmoc-CLP-19-amPEG，称重计算收率； (2) CLP-19-amPEG 制备 A. Fmoc-CLP-19-amPEG制备：全保护Fmoc-CLP-19-amPEG lg，冰冷下加入10ml各组分体 积比为90:5:3:2的裂解试剂了?4/1^〇 &11丨8〇16/^01'/&11丨8〇16，电磁搅拌2-411，氮气吹去大部 分TFA，用无水乙醚沉淀后离心;DCM溶样，无水乙醚沉淀，离心分出固体;再重复2次，冻干， 得到侧链无保护Fmoc-CLP-19-amPEG粗品，HPLC纯化、冻干、得到纯品，用氨基酸组成分析等 方法确证结构； B. CLP-19-amPEG制备：将lg全保护Fmoc-CLP-19-amPEG除去Fmoc保护基后，按上述A法 裂解去侧链保护，沉降、离心、重结晶后得到全保护的-CLP-19-amPEG粗品；该粗品以适量水 溶解后用乙醚沉降，离心得固体;再重复2次，得较纯品；HPLC纯化，冻干，得纯品；用氨基酸 组成分析等方法确证结构。9.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，所述片段合成法包括以下步骤： A. 脱除树脂:在母体肽树脂Fmoc-CLP-19-CTC加入三氟乙醇裂解试剂，15-30°C反应60-120min后过滤，以DCM、THF依次洗涤树脂，收集滤液，减压旋蒸到没有液体蒸出；加入H 20析 出白色固体后加入THF溶解，溶解后加饱和食盐水溶液进行分液，减压旋蒸THF层得白色固 体，真空干燥，得除去CTC树脂的全保护Fmoc-CLP-19-OH; B. 偶联amPEG:在全保护Fmoc-CLP-19-OH中加入DMF和THF，搅拌溶解后，加入体积比4-6 倍的HOBt，冰水冷却下加入体积比4-8倍的DIC;搅拌，加入含有体积比1-4倍的amPEG的DMF 溶液;撤除水浴，15_30°C搅拌18h后，置于25-40°C油浴搅拌反应，TLC跟踪反应进程;反应结 束后转入较大的圆底烧瓶，旋蒸除去THF，冷却后加入冷冻的无水Et 20,搅拌后静置;静置后 抽滤并用无水Et20洗涤，真空干燥获得产物;上述产物加入DCM，搅拌全溶后加入冷冻无水 Et2〇，搅拌后抽滤，无水Et2〇洗涤，真空干燥，得到全保护Fmoc-CLP-19-amPEG; ? ?除去?111〇(3全保护?1]1〇(3-〇^：)-19-&11^:^6，加/\^丨。61^(1;[116的0]\0 7溶液，25-40°〇油浴揽摔 反应，反应结束后转入较大的圆底烧瓶，加入冷冻的无水Et20，搅拌并抽滤，无水Et20洗涤， 真空干燥后加入EtOH，搅拌全溶后加入冷冻无水Et2〇，搅拌后抽滤，用无水Et2〇洗涤，真空干 燥，得到侧链全保护的CLP-19-amPEG; D.裂解去保护:冰冷下在侧链全保护CLP-19-amPEG中加入各组分体积比为94:3:2:1的 裂解试剂TFA/Thioanisole/EDT/anisole，电磁搅拌2-3h，氮气吹去大部分TFA，无水乙醚沉 降后离心；用DCM溶样，无水乙醚沉降，离心分出固体;再重复2次，冻干，得CLP-19-amPEG粗 品，HPLC纯化、冻干获得纯品。
【专利摘要】本发明涉及一种抗内毒素的偶联生物分子，所述偶联生物分子为通式Y-CLP-19-amPEG所示化合物，其中，CLP-19为鲎抗内毒素因子模拟肽分子；Y选自氢、酰基、C1-C18的烷基、芳基苄基和烯丙基中的一种；amPEG的分子量为500，1000，2000，4000，6000，12000或20000。用本发明所获得的经PEG修饰的CLP-19较未修饰CLP-19，其直接抗菌活性更优或相当，但前者显著提升了与LPS的亲和力，具有更好的中和LPS特性，较CLP-19具有显著的进步，有望开发成为新型的脓毒症治疗候选药物。
【IPC分类】C07K1/06, A61K47/48, C07K7/08, C07K1/04, A61P31/04, A61K38/10
【公开号】CN105504019
【申请号】CN201610020810
【发明人】刘耀, 夏培元, 吕军, 孙凤军, 李頔, 杨雅
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月13日