医药级杆菌肽及其制备装置的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种杆菌肽，更具体地说，它涉及一种医药级杆菌肽及其制备装置。
【背景技术】
[0002] 杆菌肽(Bacitracin)是一种有效的窄谱多肽抗菌素，其抗菌谱与青霉素类似，对 革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌、螺旋体、放线菌有效。
[0003] 杆菌肽(Bacitracin)，又名枯草菌素、枯草菌肽，其为白色粉末，在水、乙醇、吡啶 中易溶，酸性或中性的杆菌肽水溶液相对较稳定，pH值5-7的溶液可稳定4周，在pH大于9的 溶液中存在时，室温下可迅速降解。研究发现，杆菌肽为多种氨基酸结合而成的不稳定的多 肽，含A、A1、B、0"G等多种组分，且其以杆菌肽A为主。目前公认杆菌肽A、B1和B2组分最具有 生物活性，其含有约杆菌肽混合物95 %的生物活性。杆菌肽A的分子式为C66Hiq3N17O16S，其为 一个十二肽，含有一个七元环。杆菌肽A含有一个由带-SH异亮氨酸的羧酸和半胖氨酸的-NH 2缩合形成的不寻常的噻唑邻环，一个在赖氨酸的ε _順2侧链和天门酰胺的C-端之间连接 形成的环状七肽结构，以及四个D-氨基酸包括D-谷氨酸、D-鸟氨酸、D-苯丙氨酸和D-天门冬 氨酸，其结构式如式I所示：
[0004] 目前，杆菌肽的工业化生产主要通过微生物发酵法制备，其以枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtil is)和B类地衣芽抱杆菌(Baci Ilus Iicheniformis)发酵液为原料来提 取分离制得。国内目前的杆菌肽产品质量参差不齐，且其以饲料级为主，其与中国药典中对 药用级杆菌肽的质量标准相比仍具有相当的差距。其中，中国药典对药用的杆菌肽的质量 标准见表1。 表1中国药典(2015)中杆菌肽质量标准
[0005] 美国专利US2498165公开了一种利用有机溶剂萃取杆菌肽的方法，这种方法利用 水、正丁酯之间的不互溶性、杆菌肽及其杂质在不同溶剂中的溶解度差异来萃取杆菌肽，这 种方法需要使用大量的溶剂且在成品中的溶剂残留难除去，且其收率低。
[0006][0007] 因此，开发出一种适用于多种原料来源的药用级的杆菌肽具有较大的应用前景。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种适用于多种原料来源的医 药级杆菌肽，其制备方法包括如下步骤： Sl，取杆菌肽发酵液进行酸化，经陶瓷膜过滤，得到陶瓷膜透出液； S2,将Sl的陶瓷膜透出液经阳离子交换层析，收集阳离子交换层析上柱液； S3，将S2的阳离子交换层析上柱液经阴离子交换，收集阴离子交换上柱液； S4，将S3的阴离子交换上柱液经金属螯合，收集金属螯合柱液； S5,将S4的金属螯合柱液经纳滤处理，得到末次纳滤产品液； S6，将S5的末次纳滤产品液溶解，并将溶解的末次纳滤产品液过滤处理，取其滤液进行 干燥、粉碎处理，即得医药级杆菌肽； 其中，Sl中的杆菌肽发酵液可用低含量的杆菌肽溶液代替； 所述末次纳滤处理的纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da。
[0009] 杆菌肽发酵液或低含量的杆菌肽溶液中含有目标杆菌肽、其他多肽类物质、糖类、 色素和多种代谢产物等，其混合物中杂质较多较难分离。将杆菌肽发酵液或低含量的杆菌 肽溶液，先经酸化处理，除了能保证杆菌肽的正常活性，还能除去一些碱性菌，同时能将体 系内的杆菌肽的物质完全溶解在发酵液的溶液中；将经酸化的杆菌肽发酵液或低含量的杆 菌肽溶液通过陶瓷膜过滤，一方面能除去一些大颗粒的物质，同时陶瓷膜的分离作用有利 于将部分大分子的多肽或其他大分子物和杆菌肽分离，陶瓷膜还能吸附发酵液中的色素， 有利于对杆菌肽发酵液或低含量的杆菌肽溶液进行初步的提纯，同时还能保护后续过程中 的色谱柱;将陶瓷膜透出液依次进行阳离子交换层析、阴离子交换，有利于提高杆菌肽A这 类两性化合物的纯度和含量;将阴离子交换上柱液经金属螯合再经纳滤处理，有利于除去 发酵液中的重金属含量，有利于保证产品的安全性，使之符合药用标准;将末次纳滤产品液 溶解，并将溶解的末次纳滤产品液过滤处理，重结晶再次除杂;通过上述多重的除杂过程， 其起到了较好的提纯的组合效果，得到的杆菌肽符合药用标准，且其不受发酵液来源的限 制，其具有较好的大生产化价值。
[0010] 作为优选，所述Sl中，陶瓷膜为活性氧化铝或氧化锆;所述陶瓷膜的孔径为0.1-I.0um〇
[0011] 活性氧化铝或氧化锆均成非对称膜结构，当杆菌肽发酵液通过其时，其能通过其 非对称膜结构进行提纯，有利于杆菌肽(杆菌肽A的分子量为1000-2000)这类低分子物质的 通过而阻止高分子量多肽等的通过。
[0012] 作为优选，所述S2中，阳离子交换层析中使用的阳离子交换层析柱为BPG100/500， 其阳离子交换层析的柱填料为Capto Sp impres，所述洗脱液为0.1-2.5M的NaCl水溶液和 pH=3 · 0-5 · 5 的NaAc-HAc 缓冲溶液； 所述S3中，阴离子交换中使用的阴离子交换柱为BPG140/500,其阴离子交换的柱填料 为Capto Q impreso
[0013] 通过Capto Sp impres的强阳离子交换，其在洗脱液为0.1-2.5M的NaCl水溶液和 pH=3.0-5.5的NaAc-HAc缓冲溶液时具有较好的洗脱作用，有利于将产品和杂质有效的分 离，同时还能溶解析出部分杂质有利于提纯，当NaCl水溶液和NaAc-HAc缓冲溶液的体积用 量比为1:50-200时其提纯的效果最佳;通过Capto Q impres的强阴离子交换，杂质被阴离 子交换树脂吸附，从而提高通过阴离子交换树脂后的样品的纯度和含量。
[0014]作为优选，所述S2中，所述收集阳离子交换层析上柱液的过程中，根据其洗脱时间 来收集阳离子交换层析后的目标产品液、目标产品和杂质的混合液、杂质液;取所述阳离子 交换层析后的目标产品和杂质的混合液经第一次纳滤处理，将纳滤处理后的滤液和阳离子 交换层析后的目标产品液合并即为阳离子交换层析上柱液;所述第一次纳滤处理的纳滤膜 的截留分子量为300Da-500Da。
[0015] 根据洗脱时间来判断目标产品和杂质的流出，直观方便，有利于控制产品的最终 质量;对目标产品和杂质的混合液进行纳滤处理，有利于在保证产品纯度和含量的同时提 尚广品的收率。
[0016] 作为优选，所述S3中，所述收集阴离子交换上柱液的过程中，先直接收集经阴离子 交换后的目标产品液;再取所述阴离子交换后的目标产品液，先成盐使其目标产品和杂质 发生共沉淀，再将共沉淀物溶解，即为阴离子交换上柱液;所述第二次纳滤处理的纳滤膜的 截留分子量为300Da-500Da。
[0017] 对阴离子交换后的目标产品液(含有部分和目标产品的结构相似的杂质），先成盐 使其目标产品和杂质发生共沉淀，使目标产品和杂质特别是和目标产品相似的物质析出， 这些与目标产品相似的物质的结构和性能均与目标产品相似，其较难除去，但当其成盐后， 目标产品的盐和目标产品相似物的盐性质之间相差相对较大，两者比重差和溶解度等会有 所加大，因此当再共沉淀物溶解的过程中，目标产品是完全溶解而其相似物是只能溶解极 少量，因此通过该法再经过纳滤处理后的样品能基本除去与其结构相似的物质，提高分离 的效果。
[0018] 作为优选，所述阴离子交换后的目标产品和杂质的混合液的成盐过程中，添加的 物质选自草酸或硫酸锌或氯化锌中的至少一种;所述共沉淀物溶解的过程中，添加的物质 为氨水或氢氧化钠水溶液。
[0019] 研究发现，杆菌肽的草酸或锌盐与其相似物的草酸或锌盐的性质相差较大，其容 易分离;杆菌肽的草酸或锌盐与其相似物的草酸或锌盐，添加氨水和氢氧化钠水溶液的过 程总，其目标产品是完全溶解而其相似物是只能溶解极少量，因此能提高产品的含量和纯 度;且杆菌肽及其杂质与草酸或锌盐的反应可逆、无毒无害。
[0020] 作为优选，所述S4中，金属螯合前，先将S3得到的阴离子交换上柱液经碱液处理至 pH为7.0-7.5;所述收集金属螯合柱液的过程中，通过金属螯合的液体经超滤后的滤液，即 为金属螯合柱液;所述超滤中，超滤膜的截留分子量为300Da-500Da。
[0021] 金属螯合前，先将S3得到的阴离子交换上柱液经碱液处理至pH为7.0-7.5，一方面 能保证金属螯合的效果，另一方面还能提高其分离效果，还能保证产品的品质;将金属螯合 的液体超滤，能快速除去金属螯合中产生的杂质，进一步提高分离效果。
[0022] 作为优选，所述S6中，将纳滤产品液溶解使用的溶剂为乙醇或水或其混合物;所述 过滤处理包括通过依次设置的0.45μπι过滤器过滤和0.22μπι过滤器过滤;所述干燥为冷冻干 燥，所述冷冻干燥的温度为-20°C_5°C;所述粉碎处理后的医药级杆菌肽的颗粒大小< IOy