N104109191A的中国专利，将枯草芽孢杆菌发酵液离心得上清液1，再将 所得的上清液1用冰醋酸调节PH至4.5-5.5，静置1-2小时，得酸性沉淀后的样品； 将酸性沉淀后的样品离心得上清液2;将上清液2滤膜过滤，得过滤液； 将过滤液进行阴离子交换层析(柱填料为Capto 0,层析柱为BPG140/500)，得穿透液和 平衡液;其中阴离子交换层析的方法为：用含有50mM Tris、IMNaCl的水溶液和50mM Tris的 水溶液交替处理层析柱，再上样过滤液，收集穿透液，上样完毕后，用50mM Tris水溶液平 衡，得平衡液，将平衡液与穿透液合并； 将穿透液和平衡液进行第一次疏水层析(柱填料为Butyl HP，层析柱为BPG100/500)， 280nm检测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品1;其中，第一次 疏水层析的方法为：用超纯水洗脱，再用pH 5.0的含有50mM NaAc-HAc、1.5M NaCl的水溶液 平衡，平衡完毕，再将阴离子交换层析得到的穿透液和平衡液上样，上样完毕，用pH 5.0的 含有50mM NaAc-HAc、1.5M NaCl的水溶液继续平衡，平衡完毕，用pH 5.0的50mM NaAc-HAc 的水溶液进行洗脱，280nm检测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到 样品1; 将样品1进行阳离子交换层析（柱填料为CaptO Sp impres，层析柱为BPG100/500)， 280nm检测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品2;其中阳离子交 换层析的方法为：用pH 5.0的含有50mM NaAc-HAc、1.5M NaCl的水溶液洗脱，再用pH5.0的 50mM NaAc-HAc缓冲液平衡，平衡完毕，将样品1上样，分段收集穿透，检测其是否含有目的 抗菌肽，继续用pH 5.0的50mM NaAc-HAc缓冲液平衡，平衡完毕，用pH5.0的含有50mM NaAc-HAc，IM NaCl的水溶液洗脱，280nm收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样 品2;其中，第二次疏水层析的方法为:超纯水洗脱，再用pH 5.0的50mM NaAc-HAc，1.5MNaCl 水溶液平衡，平衡完毕，将样品2上样，上样完毕，用pH 5.0的50mM NaAc-HAc，1.5M NaCl水 溶液继续平衡，平衡完毕，用超纯水进行洗脱，280nm收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽 的洗脱峰，得到样品3; 将样品2进行第二次疏水层析(柱填料为Butyl HP，层析柱为BPG100/500)，280nm检测 并收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品3，将样品3超滤换液得到枯草 菌素抗菌肽;其中，第二次疏水层析的方法为:超纯水洗脱，再用pH 5.0的50mM NaAc-HAc， 1.5MNaCl水溶液平衡，平衡完毕，将样品2上样，上样完毕，用pH 5.0的50mM NaAc-HAc，1.5M NaCl水溶液继续平衡，平衡完毕，用超纯水进行洗脱，280nm收集洗脱峰，收集鉴定含有目的 抗菌肽的洗脱峰，得到样品3; 将样品3超滤换液，干燥得到对照品； 其中，对照品1以制备例1制备的杆菌肽发酵液(有效活菌数达到I. I X IO9CFlVg)为原 料，对照品2以制备例2制备的杆菌肽发酵液(有效活菌数达到5.OX IO9CFlVg)为原料，对照 品3以购自中农颍泰生物技术有限公司的杆菌肽发酵液(其有效活菌数为13.1 X IO9CFlVg) 为原料。
[0037] 2、效价测试试验 (1)样品：以实施例1-4制备的样品为试验样，以对照品1-3为对照样。
[0038] (2)标准品及工作标准溶液的配制： 选用美国Alpharma公司生产的标示效价74U/mg的医药级杆菌肽锌为标准品； 将精密称取干燥后的标准品置于量瓶中，用0.OlM盐酸溶解并定容，制备成lOU/mL的储 备标准溶液，用该储备标准溶液为母液且以PH6.0的磷酸缓冲溶液为稀释液配制得到浓度 为0.64U/mL、0.80U/mL、1.0 OU/mL、1.25U/mL和1.56U/mL的工作标准溶液。
[0039] (3)样品溶液的制备 按样品的估计效价精确称取适量的试验样，用〇. OlM盐酸溶解并定容，制备成lOU/mL的 储备溶液，用该储备溶液为母液且以PH6.0的磷酸缓冲溶液为稀释液配制得到浓度为估计 效价为1.0U/mL的溶液。
[0040] (4)试验内容 ①制备藤黄微球菌普通斜面： 每支200 X 30mm试管中装入30-50mL溶化后未灭菌的培养基1(按美国药典配制），用棉 塞和牛皮纸塞住试管口，121°C灭菌15分钟，然后趁热取出以30°C角度斜放，带冷却凝固后 备用；自冰箱中取出菌种斜面，室温下放置20_30°C，待温度平衡后移入接种室;将培养基和 菌种从传递窗送入接种室;点燃酒精灯，在无菌条件下给每支装有琼脂斜面的试管接种;接 种完毕立即灼烧接种环，将接种环在火焰上往返几次灼烧小毒;将接种后的试管放入霉菌 培养箱于32-35°C培养24小时，取出，室温下放置1小时，待温度平衡后放入冰箱中于2-6°C 保存。
[0041 ]②制备藤黄微球菌菌悬液： 配制250mL培养基I放入500mL洛克氏瓶中，121°C灭菌15分钟，取出以30°C角度斜放，冷 却凝固制备成大斜面;将新鲜制备的藤黄微球菌普通斜面上的菌苔取下，放入装有2-3mL 0.9%灭菌生理盐水的5mL小试管中，晃动小试管，借助玻璃珠将菌苔打散，使之均匀分散在 溶液中；将小试管中的菌液倒入洛克氏瓶中，塞上棉塞，借助于玻璃珠使菌苔均匀分布在培 养基的表面，32-35°C下培养24吸收；向洛克氏瓶中加入50mL 0.9%灭菌生理盐水，借助于 玻璃珠将菌苔洗下，将菌液导入三角烧瓶中，摇晃三角烧瓶，借助于玻璃珠使菌苔分散均 匀，其溶液为储备菌悬液；用移液管移取ImL储备菌悬液放入小烧杯中，按1:35的体积比加 入0.9 %灭菌生理盐水稀释，混匀，用722分光光度计测稀释菌悬液在580nm处的透光度;若 透光度为15-20 %，则将4. OmL储备菌悬液加入到上层培养基中，如果透光度为21-30 %，则 将6. OmL储备菌悬液加入到上层培养基中；配制250mL上层培养基，灭菌后冷却至45-50°C， 加入储备菌悬液，混匀，得到藤黄微球菌菌悬液。
[0042]③制备双碟： 底层，配制1000 mL培养基11(参照美国药典），121°C灭菌15分钟； 上层，配制250mL培养基I，121°C灭菌15分钟，然后放在恒温水浴中，45-49°C恒温1小 时； 制备底层培养基，每个培养皿加入21mL培养基II，盖上陶瓦盖，待琼脂培养基凝固； 制备上层培养基，底层培养基凝固后，在其上每盘摊布4mL藤黄微球菌菌悬液，盖上陶 瓦盖使凝固。
[0043]④分析程序 (A) 双碟制备好后，每盘用牛津杯放置器放置6个牛津布，分布在半径为2.8cm的圆上， 间隔60°C; (B) 取多个上述制备的双碟，每3个双碟为一组，共分5组，标准曲线为第1-4组，样品或 对照品为第5组。将每碟6个牛津杯间隔的3个杯中各装每毫升含1.0单位的标准品稀释液， 即中心浓度，第二组的空杯中各装入0.80U/mL的标准品稀释液，依次将4种浓度的标准品稀 释液装入，共得中心浓度标准品稀释液45杯，其他四种浓度的标准品溶液各得9杯，全部双 碟盖上陶瓦圆盖后于32-35°C培养18-24小时； (C) 测定样品效价则是讲上述(B)中第五组剩余的3个双碟，各碟其他3杯中各装入估计 浓度1.0U/mL的样品溶液，盖上陶瓦圆盖，与标准曲线双碟在相同条件下同时培养； (D) 培养结束后，使用扫描仪扫描记录各双碟图像，测量各抑菌圈的直径； (E) 使用以下公式计算效价：
其中X代表效价，其单位为U/mg;A代表测定效价，其单位为U/mg;B代表样品重量，其单 位为mg。 (5)试验结果 试验结果如表2所示，研究发现试验样1-4的效价均较高，其均远高于中国药典标准 (55U/mg)，均已达医药级，且其适用于不同的原料来源；而对照样中只有对照样3是恰好能 达到中国药典标准(55U/mg)，其余两个对照样均未达到医药级标准。 表2效价试验结果统计
[0044] 3、含量及纯度测试 (1)色谱条件： 试剂:HPLC级甲醇、HPLC级水、KH2P〇4、0 · 2M K2HP〇4溶液； 色谱柱：GL Science，Inertsil C8-3.5y，250X4.6mm，Cat.No.:lAI13518; 流动相:溶剂A: pH=6.0缓冲溶液，溶剂B:甲醇;溶剂C:乙腈； 缓冲溶液制备:称取6 · 8g KH2PO4溶液调节pH调到6 · 0 ±0 · 05; 梯度:如表3所示； 平衡时间为15min，流速为1.0mL/min，检测器为254nm紫外灯照射，进样量为20yL。 表3 HPLC检测的流动相梯度
[0045]^(2)检测溶