犬用干细胞分泌因子注射剂的制作方法

本发明涉及犬干细胞技术领域，特别涉及一种干细胞分泌因子注射剂及其制备方法和应用。

背景技术：

间充质干细胞(MSCs)是存在于骨髓、脂肪、脐带或胎盘中的具有高度自我更新能力和多相分化潜能的成体干细胞，又称为基质干细胞或间充质祖细胞。造血干细胞(HSCs)是血液系统中的成体干细胞，来源于骨髓、脐带血、胎盘，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。MSCs和HSCs不仅具有高度可塑性和强大的分化潜能，而且具有易获得、易培养、低免疫原性等特性，在修复和治疗神经系统损伤、肝肾损伤、血液系统疾病、糖尿病、骨损伤、免疫性疾病和心血管疾病等方面具有一定的优势，近年来在基础研究领域、临床组织器官修复领域和疾病治疗领域呈现出极为诱人的前景。

MSCs和HSCs不但可以产生或分泌大量的生物活性因子，而且MSCs内也含有丰富的生物活性物质，这些干细胞生物活性因子或物质可有效调控机体细胞信号传导、活化机体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞等。例如MSCs和HSCs可以分泌干细胞生长因子 ( SCF )、神经生长因子 ( NGF )、基质细胞源性生长因子 ( SDF )、血管内皮细胞生长因子 ( VEGF )、碱性成纤维细胞生长因子 ( bFGF )、胰岛素样生长因子 ( IGF )、表皮生长因子( EGF )、白介素-6 与白介素-7( IL-6 与 IL-7 )、巨核细胞集落刺激因子( M-CSF )、肿瘤坏死因子 ( TNF )、干扰素 ( IFN ) 等80余种活性因子，这些干细胞活性因子具有支持干/祖细胞的增殖与分化、化学趋化、免疫调节、抗细胞凋亡、促进血管发生、抗瘢痕等功能。他们通过自分泌或旁分泌的方式，改善机体局部微环境，促进内源性干细胞向受损部位进行迁移和分化，挽救濒临凋亡的组织细胞，从而达到修复组织器官、恢复各组织器官功能的目的。

技术实现要素：

本发明提供了一种犬干细胞注射剂的制备方法及其应用。该犬干细胞注射剂在治疗犬贫血、犬白细胞减少症、犬非感染性中枢神经系统损伤、肝功能损伤、肾功能损伤、糖尿病、犬退行性关节炎、关节软骨缺损等疾病具有独特优势，显著缩短疗程，提高患犬生活质量且无任何副作用，同时对于体质衰弱的老年犬也具有增强体质和抗病力的作用。

本发明犬用干细胞分泌因子注射剂，其特征在于其注射剂中含有犬干细胞分泌因子原液，该原液由A液和B液按3:1的体积比混合而成；其中，A液为犬干细胞裂解液，B液为犬MSCs和HSCs无血清培养上清液融化、混合、低温分离、超滤和浓缩后形成。

所述的犬用干细胞分泌因子注射剂，其特征在于犬干细胞分泌因子原液中，按质量，加入原液0.5%-1%的甘氨酸，0.2%-0.5%的黄芪多糖，0.3%-0.6%的香菇多糖。

所述的犬用干细胞分泌因子注射剂，其特征在于按质量，加入原液0.15%-0.2%的甲钴胺，0.3-0.5%的维生素B1，0.05-0.1%的维生素B12。

所述的犬干细胞分泌因子注射剂是注射液或是注射用冻干粉。

所述的犬干细胞分泌因子注射用冻干粉是用真空冷冻干燥机经真空浓缩、喷雾干燥，得到犬干细胞分泌因子冻干粉。使用时注射用生理盐水进行稀释，每100ml生理盐水中添加犬干细胞分泌因子注射用冻干粉80mg。

所述的犬用干细胞分泌因子注射剂，其特征在于该犬干细胞分泌因子原液是通过以下的步骤制备而得：

（1）犬干细胞裂解液的制备：将体外培养获得的MSCs和HSCs混合密封于冻存管中，经超低温液氮反复冻融至细胞破碎，再经中空纤维超滤柱超滤，再用滤膜过滤，使其无菌，测定蛋白浓度，调整浓度为0.5mg/ml，标记为A液；

（2）将收集后的犬MSCs和HSCs无血清培养上清液融化、混合、低温分离、超滤和浓缩；利用超滤膜过滤浓缩，再经中空纤维超滤柱超滤，将超滤后的液体进行浓缩，用滤膜过滤，使其无菌，测定蛋白浓度，定浓度为0.5mg/ml，4℃保存，标记为B液；

（3）将上述A液和B液按3：1的体积比混合，得到犬干细胞分泌因子原液。

本发明的犬干细胞分泌因子注射液或冻干粉既可以静脉滴注，也可以局部注射，如脊髓穿刺或关节腔注射。将本发明的犬干细胞分泌因子注射液或冻干粉在全国试点宠物医院进行推广试用，应用在犬贫血、犬白细胞减少症、犬非感染性中枢神经系统损伤、肝功能损伤、肾功能损伤、糖尿病、犬退行性关节炎、关节软骨缺损等疾病的治疗，等300余例进行治疗，相对于常规治疗，本发明的犬干细胞分泌因子注射液/冻干粉治愈率明显上升，生活质量显著提高；所有病例未出现任何不适症状，无毒副作用，安全性好。

附图说明

图1为犬干细胞分泌因子原液蛋白分析图；

图中，M为蛋白Marker；1为第一代犬干细胞分泌因子；2为第二代犬干细胞分泌因子；3为第三代犬干细胞分泌因子；4为第四代犬干细胞分泌因子；X为大分子蛋白；Y为主要蛋白；Z为小分子蛋白。

图2为大分子蛋白多肽图谱；

图3为主要蛋白多肽图谱；

图4为小分子蛋白多肽图谱。

具体实施方式

实施例1：犬用干细胞分泌因子注射液，通过以下的方法制备：

1、在本发明中所述的MSCs包括从犬骨髓、脂肪、脐带或胎盘中分离培养的犬间充质干细胞，用流式细胞术鉴定干细胞表面分子CD44阳性，CD34阴性。所述的HSCs包括从犬骨髓、脐带血、胎盘中分离培养的犬造血干细胞，用流式细胞术鉴定干细胞表面分子CD34阳性，CD44阴性。中国专利申请号201410405353.X，公开号104152409A，以骨髓为来源，公开了犬MSCs和HSCs的获得方法。

2、用无血清培养液对MSCs和HSCs进行培养，每六天对培养MSCs的上清液进行半量换液，收集培养后的上清液，测定干细胞分泌因子的各种成份和活性，浓缩后即为干细胞分泌因子。

3、制备犬干细胞分泌因子原液

（1）犬干细胞裂解液的制备：将体外培养获得的MSCs浓度调整为1×10⁷个/ml，HSCs浓度调整为1×10⁷个/ml，各取0.5ml混合密封于冻存管中，经超低温液氮反复冻融5－7次至细胞破碎，再经截留分子量为50KD中空纤维超滤柱超滤，便可获得高纯度的干细胞内生物活性物质群或组合物即为MSCs裂解液；用孔径为0.22 µm的滤膜过滤，使其无菌，测定蛋白浓度，调整浓度为0.5mg/ml，标记为A液。

（2）将收集后的犬MSCs和HSCs无血清培养上清液融化、混合、低温分离、超滤和浓缩；超滤和浓缩的处理方法为：利用3K的超滤膜过滤，体积浓缩 1/10，保留生物活性物质，再经截留分子量为50KD中空纤维超滤柱超滤，将超滤后的液体进行浓缩，即可得到含有丰富干细胞生物活性因子的组合物；用孔径为0.22 µm的滤膜过滤，使其无菌，测定蛋白浓度，定浓度为0.5mg/ml，4℃保存，标记为B液。将上述30 ml的A液和10 ml的B液混合，得到犬干细胞分泌因子原液。

（3）将步骤（2）得到的犬干细胞分泌因子原液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，分析结果显示于图1中。

（4）将步骤（3）中各蛋白条带按分子量大小分别运用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)检测，结果如图2，图3，图4所示，表明成功获得了具有多种活性因子成份的犬干细胞分泌因子原液。

4、干细胞分泌因子注射液的制备

将所获得的犬干细胞分泌因子原液中，加入原液质量0.5%-1%的甘氨酸，其目的是清除机体内自由基，促进干细胞分泌因子的旁分泌作用。加入原液质量0.2%-0.5%的黄芪多糖，加入原液质量0.3%-0.6%的香菇多糖，以延长干细胞分泌因子的持续作用时间，同时增强机体非特异性免疫功能。

5、用NaHCO₃调整干细胞分泌因子注射液pH值为7.2-7.5。

实施例2：用于治疗犬非感染性中枢神经系统损伤的犬干细胞分泌因子注射液，则在犬干细胞分泌因子原液中加入原液质量0.15%-0.2%的甲钴胺，加入原液质量0.3-0.5%的维生素B1，加入原液质量0.05-0.1%的维生素B12，以提供营养神经的活性物质，增强干细胞分泌因子调动神经干细胞到受损的神经部位进行修复。其他制备步骤与实施例1相同。

实施例3：犬用干细胞分泌因子注射用冻干粉，是将实施例1的注射液用真空冷冻干燥机经真空浓缩、喷雾干燥，得到犬干细胞分泌因子冻干粉。使用时注射用生理盐水进行稀释，每100ml生理盐水中添加犬干细胞分泌因子注射用冻干粉80mg

以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对犬干细胞分泌因子注射液/冻干粉做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。