肝癌干细胞疫苗及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种肿瘤干细胞疫苗及其制备和应用。本发明所述的肝癌干细胞疫苗包括：按体积比为3:1:1混合的灭活的肝癌干细胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。本发明所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法，包括以下步骤：获得肝癌干细胞；将所述肝癌干细胞灭活；以及将灭活的肝癌干细胞冻融在生理盐水里，与佐剂甘露聚糖肽、脂肪乳混匀，从而获得所述的肝癌干细胞疫苗。本发明提供了根据本发明所述的制备方法获得的肝癌干细胞疫苗用于制备治疗肝癌的药物中的用途。本发明为肝癌的治疗及其疫苗的制备提供了一种新的途径，对肝癌患者具有积极地治疗效果，可增强患者的免疫功能，对延长患者的生存时间具有积极作用。
【专利说明】肝癌干细胞疫苗及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药工程技术，涉及一种肿瘤干细胞疫苗及其制备和应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是一种全身性的慢性疾病。在中晚期患者体内，不仅脏器中有影像学检 查时明显的团块肿瘤,在外周血中更有大量看不见的循环肿瘤细胞和肿瘤干细胞（Cancer stem cell，CSC)，随时准备定居在机体易感部位，发育成新的转移灶，这也是肿瘤无法根治 的原因。传统的肿瘤治疗包括4种主要疗法，即手术、化疗、放疗和免疫治疗。通常前三种疗 法治疗3-5年后，肿瘤都会发生周边脏器或远端脏器的转移。随着对CSC研究的深入，人们 已经明确复发和转移的原因不是手术做得不彻底，而是由于缺乏有效的控制、甚至消灭CSC 的方法。
[0003] CSC来自人类自体干细胞的恶变，具有低分化度和高扩增性等特点。这些干细胞可 抵抗几乎全部的传统化疗药物及放疗，可在传统治疗的同时即引起肿瘤肝复发和转移。这 种现象对于很多免疫治疗也不例外，原因是过去一直使用成熟肿瘤细胞作为抗原供免疫细 胞识别，而CSC不表达这些抗原，可逃避免疫攻击。所以，肿瘤的免疫治疗急需更新观念，将 治疗的主攻方向从成熟肿瘤细胞转变为CSC。
[0004] 目前国际公认的成熟的寻找CSC的方法是利用ALDEFLUOR/ALDH在人类肿瘤中寻 找。ALDH是所有干细胞中共有的一种酶，在肿瘤干细胞中高或强表达，而在普通干细胞中弱 或无表达。
[0005] 目前，为了获得肿瘤干细胞（CSC)，人们常通过大量培养普通的肿瘤细胞系，由单 瓶消化扩增至多瓶，再提取出其内的肿瘤干细胞。采用这种方法，其存在很多弊端：获取的 肿瘤干细胞数量有限，普通肿瘤细胞培养花费的人力与财力颇大，长期大量培养各种肿瘤 细胞会需要很多培养试剂、配置专人、容易污染致死，甚至出错；肿瘤干细胞培养存活率低； 培养普通肿瘤细胞因培养瓶或培养箱空间有限，获得的细胞数量也就不多，从中再抽取肿 瘤干细胞，得到的肿瘤干细胞量就更少，远无法满足需求。因此，开发一种操作简单、快捷的 有助于获取高产量的肿瘤干细胞（CSC)的制备方法也是非常有必要的。
[0006] 近年来，已经有关于肿瘤干细胞疫苗具有抗肿瘤疗效的报道，理论上灭活的肿瘤 干细胞可被直接作为疫苗，但是临床上的疗效很不理想，因此有必要研究和开发适合于临 床应用的肿瘤干细胞疫苗。
[0007] 原发性肝癌（primary carcinoma of liver,以下简称肝癌）是我国常见的恶性 肿瘤之一。据20世纪90年代统计，我国肝癌的年死亡率为20. 37/10万，在恶性肿瘤死亡 顺位中占第2位，在城市中仅次于肝癌；农村中仅次于胃癌。由于血清甲胎蛋白（AFP)的 临床应用和各种影像学技术的进步，特别是AFP和超声显像用于肝癌高危人群的监测，使 肝癌能够在无症状和体征的亚临床期作出诊断，加之外科手术技术的成熟，以及各种局部 治疗等非手术治疗方法的发展，使肝癌的预后较过去有了明显提高。传统的治疗肝癌的方 法是首选手术切除，但不是所有的肝癌患者都适合手术。只有心肝功能较好，肝脏肿瘤较局 限，没有转移条件的患者才适宜手术。加上我国肝癌患者多数有肝炎、肝硬化的病史，临床 有80%左右的患者因各种原因不能手术。肝癌具有侵袭性和难治愈的特点，治疗后仍有可 能复发或转移。而其起源、复发与转移的真正原因可能是存在于肝癌内极少数具有干细胞 的自我更新能力和多向分化潜能的细胞群，即肝癌干细胞，这些细胞具有化疗、放疗及缺氧 抵抗性，同时具有高致瘤性、高侵袭转移性，在肝癌的发生、发展乃至转移、复发中起着极 其重要作用。然而，放疗和化疗对存在于肿瘤中数量较少的干细胞样细胞群疗效甚微，经过 治疗后残存的肝癌干细胞的增殖足以促使肝癌复发和转移之一。目前尚缺乏有效的肝癌干 细胞疫苗，本领域技术人员在这方面亟待取得突破。
【发明内容】
[0008] 本发明的第一个方面是提供一种肝癌干细胞疫苗，对肝癌患者具有积极地治疗效 果，可增强患者的免疫功能。
[0009] 本发明所述的肝癌干细胞疫苗包括：按体积比为3:1:1混合的灭活的肝癌干细 胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。
[0010] 本发明的第二个方面提供一种肝癌干细胞疫苗的制备方法，可实现简单、快捷地 获取高产量、易于质量控制的肝癌干细胞，并制备出临床上有效的肝癌干细胞疫苗。
[0011] 本发明所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法，包括以下步骤：获得肝癌干细胞；将 所述肝癌干细胞灭活；将灭活的肝癌干细胞冻融在生理盐水里，与佐剂甘露聚糖肽、脂肪乳 混匀，从而获得所述的肝癌干细胞疫苗。
[0012] 根据本发明所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法的进一步特征，所述灭活包括：将 肝癌干细胞由-80°c至20°C反复冻融五次致死。
[0013] 根据本发明所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法的进一步特征，所述肝癌干细胞、 甘露聚糖肽和脂肪乳的混合比例为3:1:1 (体积比）。
[0014] 根据本发明所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法的进一步特征，所述的肝癌干细胞 是⑶133阳性肝癌干细胞。
[0015] 根据本发明所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法的进一步特征，所述的CD133阳性 肝癌干细胞是通过以下步骤制备的：
[0016] A.将液氮或_80°C保存的肝癌细胞于37°C水浴，快速溶化；
[0017] B.用8. Oml的含10% FBS的RPMI1640培养基混匀已融化的肝癌细胞悬液，于1500 转/分，离心8分钟；
[0018] C.弃上清，再吸取8. Oml培养基质混匀细胞沉淀，再1500转/分，离心8分钟，弃 上清，细胞沉淀用I. Oml培养基混匀，备用；
[0019] D.另取一个75cm2方瓶，加入14. Oml培养基质，将I. Oml上述制备的含肝癌细胞 悬液加入此方瓶中，于37°C，5% CO2孵育箱中培养；
[0020] E.肝癌细胞呈贴壁生长，经过3-4天，肝癌细胞生长至80%-95%单层时，弃上清， 用0. 5mM的EDTA，处理肝癌细胞大约3-5分钟，用倒置显微镜观察，当90%的肝癌细胞变圆 时，即可用弯管吹打并将消化的细胞转移到15ml离心管中，于1500转/分下，离心8分钟， 弃上清，计数，若细胞数不足，扩增至三个培养瓶，继续消化离心；
[0021] F.加入缓冲液重悬细胞，采用⑶133免疫磁珠分选系统从细胞液中分选出⑶133 阳性肝癌干细胞；
[0022] G.将前一步骤获得的⑶133阳性肝癌干细胞在DMEM/F12培养液中进行培养；
[0023] H. 37°C、5% CO2孵育箱中培养5-7天，从而获得足够用于制备肝癌干细胞疫苗的 ⑶133阳性肝癌干细胞。
[0024] 根据本发明所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法的进一步特征，所述步骤E中，在 加入EDTA的同时加入0. 25%胰酶I. Oml以消化肿瘤细胞。
[0025] 根据本发明所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法的进一步特征，所述步骤G中，在 DMEM/F12培养液中添加：生长因子rhEGF15?25ng/ml、rhbFGF5?15ng/ml、硫酸肝素2? 6ug/ml、胎牛血清0· 1?0· 2% (质量百分比）和青霉素-链霉素双抗0· 5?L 5% (质量 百分比）。
[0026] 根据本发明所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法的进一步特征，所述步骤H中， 所述足够用于制备肝癌干细胞疫苗的CD133阳性肝癌干细胞是培养至细胞个数达到 IXlO5?5X105/ml的CD133阳性肝癌干细胞。
[0027] 本发明的第三个方面提供了根据本发明所述的制备方法获得的肝癌干细胞疫苗 用于制备治疗肝癌的药物中的用途。
[0028] 本发明所述的肝癌干细胞疫苗剂及其制备方法具有以下特点和优点：
[0029] (1)本发明所述的肝癌干细胞疫苗中含有药学上可接受的佐剂甘露聚糖肽，能诱 导体内潜在的DC，进而增强摄取抗原能力，提升机体免疫功能；提升机体外周白细胞，增强 机体防御能力。
[0030] (2)本发明所述的肝癌干细胞疫苗中含有药学上可接受的佐剂脂肪乳，起到缓释 作用，让疫苗缓慢被吸收，延长疫苗作用的时间，增强疗效。
[0031] (3)本发明所述的肝癌干细胞疫苗中，肝癌干细胞与佐剂甘露聚糖肽和脂肪乳的 比例关系是优选的结果，例如，当临床皮下注射需求量为0. 5ml时，取肝癌干细胞0. 3ml、甘 露聚糖肽和脂肪乳各〇. lml，然后混匀。这样的比例能保证肿瘤干细胞浓度适中，过浓会影 响吸收，过稀则影响药效；同时0. 5ml的皮下注射量也在循证医学允许的皮下注射范围内 (皮下注射量小于Iml)。
[0032] (4)本发明将未老化的肿瘤细胞经过消化复苏培养、免疫磁珠分选来获得单个的 CD133阳性肿瘤干细胞CSC，具有操作简便、易于质控、获得的肝癌干细胞阳性率高的特点。
[0033] (5)本发明为肝癌的治疗及其疫苗的制备提供了一种新的途径，本发明所述的疫 苗对肝癌患者具有积极地治疗效果，可增强患者的免疫功能，对延长患者的生存时间具有 积极作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图IA为本发明所述方法得到的肝癌干细胞阳性率检测结果。
[0035] 图IB为采用现有方法制备肝癌干细胞的阳性率检测结果。
[0036] 图2是采用本发明所述方法制备得到的肝癌干细胞疫苗的治疗组和对照组的生 存时间曲线图。
[0037] 图3为注射肝癌干细胞疫苗后体液免疫应答的结果比较。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
[0039] 本文中，所述的肿瘤细胞是指传代2-3次的未老化肿瘤细胞。
[0040] 本文中所使用的所有专业与科学用语若未做特别说明，均与本领域技术人员所熟 悉的意义相同。本文中涉及的甘露聚糖肽及脂肪乳其获得是通过正规医院购买得到的， CD133免疫磁珠分选系统进行细胞分选的技术也是本【技术领域】的现有技术，具体可以采用 CD 133免疫磁珠分离试剂盒进行分选。
[0041] 实施例1 :肝癌干细胞疫苗的制备
[0042] 本实施例是以液氮中储存的肝癌细胞为原料来制备肝癌干细胞疫苗。
[0043] 1.将液氮或-80°C保存的肝癌细胞QGY-7701于37°C水浴，快速溶化；
[0044] 2.用8. Oml培养基（RPMI1640+10 % FBS)混匀已融化的肿瘤细胞悬液，于1500转 /分，离心8分钟；
[0045] 3.弃上清，再吸取8. Oml培养基质混匀细胞沉淀，再1500转/分，离心8分钟，弃 上清，细胞沉淀用I. Oml培养基混匀，备用；
[0046] 4.另取一个75cm2方瓶，加入14.0ml培养基质，将上述制备的含肿瘤细胞悬液 (LOml)加入此方瓶中，于37°C，5% CO2孵育箱中培养；
[0047] 5.肿瘤细胞呈贴壁生长，经过3-4天，肿瘤细胞生长至80%-95%单层时，弃上清， 用0. 5mM的EDTA (难消化的肿瘤细胞用0. 25 %胰酶I. Oml)，处理肿瘤细胞大约3-5分钟，用 倒置显微镜观察，当90%的肿瘤细胞变圆时，即可用弯管吹打并将消化的细胞转移到15ml 离心管中，于1500转/分下，离心8分钟，弃上清；
[0048] 6.向步骤（5)加入缓冲液重悬细胞，采用⑶133免疫磁珠分选系统从细胞液中分 选出CD133阳性肿瘤干细胞，按照每IO 7个细胞加入60ul缓冲液的量向其中加入缓冲液重 悬形成细胞液。所用缓冲液为PBS缓冲液，其中含有0. 5% BSA，2mM EDTA，pH为7. 2(文中 出现的缓冲液，若为特别说明，均采用该缓冲液）。
[0049] 7.采用CD133免疫磁珠分选系统从细胞液中分选出CD133阳性干细胞，免疫磁珠 分选系统是本【技术领域】的现有技术，采用CD133免疫磁珠分离试剂盒进行分选，可按照试 剂盒的操作说明进行，具体可参照如下步骤进行：
[0050] 7. 1向步骤（6)获得的细胞液中加入20ul受体阻断剂FcR/107细胞，再向其中加 入20ul CD133磁珠/IO7细胞；
[0051] 7. 2混匀后，在2-8°C冰箱内孵育15分钟，期间不停轻摇；
[0052] 7. 3 按每 IO7 个细胞加入 l-2ml PBS 缓冲液（含 0· 5% BSA，2mM EDTA，ρΗ7· 2)进 行清洗，以IOOOrpm离心5min，弃上清；
[0053] 7. 4离心后，向其中加入500ul Buffer重悬细胞，备用，以便进入分离阶段；
[0054] 7. 5预先将LS分离柱与分选器（分选磁铁）相匹配连接好；
[0055] 7. 6准备好冲洗的buffer液，其中MS柱：500ul，LS柱3ml ;
[0056] 7. 7加细胞悬液入LS柱，非标记的细胞（⑶133阴性细胞）自动流下；
[0057] 7. 8清洗柱子后，移去柱子，并将柱子固定在适合的收集管上；
[0058] 7. 9向柱子中加入buffer液进行洗柱，以冲去标记的细胞，收集洗液即得⑶133阳 性干细胞。
[0059] 8.⑶133阳性干细胞（CSC)培养：将步骤（7)获得的⑶133阳性干细胞在DMEM/ F12培养液中进行成团培养，其中，所述DMEM/F12培养液中添加有生长因子rhEGF20ng/ml、 rhbFGF10ng/ml、硫酸肝素4ug/ml、胎牛血清0.15% (质量）、青霉素-链霉素双抗1% (质 量）；
[0060] 9.步骤（8)中的干细胞培养至一定数目（IXlO5?5X105)后反复冻融，按照阳 性干细胞、甘露聚糖肽及脂肪乳按体积比为3:1:1的量混匀，得到肿瘤干细胞疫苗。
[0061] 经步骤（1)?（7)后获得的肝癌干细胞，将其培养至一定数量后，取IO6个细胞上 样，通过流式细胞仪检测其干细胞的阳性率，结果如图IA所示。而采用传统的肿瘤细胞培 养，其获得的结果如图IB所示。
[0062] 图IB的结果具体是这样获得的：肝癌细胞QGY_7701 (含CSC)，经复苏后，力口 RPMI1640液与10% FBS培养扩增，至一定数量后，抽提出CSC，取IO6个细胞上样，得到流式 图1B。
[0063] 由图1A、图IB可以看出，本实施例的方法获得的肿瘤干细胞产量更高，而且阳性 率更高，达到90%。
[0064] 实施例2 :注射肝癌干细胞疫苗后的疗效观察
[0065] 将实施例1制得肝癌干细胞疫苗应用于肝癌患者的治疗，其详细实验过程如下： 随机抽取30名肝癌患者，分为两组，其中15名接受实施例1制得的疫苗注射治疗，作为治 疗组；另15人不做疫苗处理，作为对照组。注射患者前抽取每个患者5ml血，检测外周血 淋巴细胞数目（T BNK检测试剂盒）和淋巴细胞功能（6colour T BNK With Trucount检测 试剂盒），经流式细胞仪检测得出报告单。治疗组的患者，通过皮下向肝癌患者体内输入疫 苗剂量500ul，间隔一周后，再次注射一次，即每个疗程周期是14天，隔周注射一次；治疗组 的患者不进行化疗、放疗及其他免疫治疗。对照组的患者进行常规化疗、放疗及其他免疫治 疗。在15天时，再次抽取每位患者5ml血，再次检测外周血淋巴细胞数目，与两周前对比， 结果如下表1所示。表1为治疗组在未注射疫苗与注射疫苗后淋巴细胞检测和淋巴细胞功 能检测结果的统计。
[0066] 表1 :为未注射疫苗与注射疫苗后（14天）免疫检测比较
[0067]
【权利要求】
1. 一种肝癌干细胞疫苗，其特征在于，包括：按体积比为3:1:1混合的灭活的肝癌干细 胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。
2. -种肝癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 获得肝癌干细胞； 将所述肝癌干细胞灭活；以及 将灭活的肝癌干细胞冻融在生理盐水里，与佐剂甘露聚糖肽、脂肪乳混匀，从而获得所 述的肝癌干细胞疫苗。
3. 根据权利要求2所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述灭活包括：将 肝癌干细胞由-80°C至20°C反复冻融五次致死。
4. 根据权利要求2所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于：所述肝癌干细胞、 甘露聚糖肽和脂肪乳的混合比例为3:1:1 (体积比）。
5. 根据权利要求2所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于：所述的肝癌干细 胞是⑶133阳性肝癌干细胞。
6. 根据权利要求5所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述的CD133阳性 肝癌干细胞是通过以下步骤制备的： A. 将液氮或_80°C保存的肝癌细胞于37°C水浴，快速溶化； B. 用8. Oml的含10% FBS的RPMI1640培养基混匀已融化的肝癌细胞悬液，于1500转 /分，离心8分钟； C. 弃上清，再吸取8. 0ml培养基质混匀细胞沉淀，再1500转/分，离心8分钟，弃上清， 细胞沉淀用1. 〇ml培养基混匀，备用； D. 另取一个75cm2方瓶，加入14. 0ml培养基质，将1. 0ml上述制备的含肝癌细胞悬液 加入此方瓶中，于37°C，5% 0)2孵育箱中培养； E. 肝癌细胞呈贴壁生长，经过3-4天，肝癌细胞生长至80% -95%单层时，弃上清，用 0. 5mM的EDTA，处理肝癌细胞大约3-5分钟，用倒置显微镜观察，当90%的肝癌细胞变圆时， 即可用弯管吹打并将消化的细胞转移到15ml离心管中，于1500转/分下，离心8分钟，弃 上清，计数，若细胞数不足，扩增至三个培养瓶，继续消化离心； F. 加入缓冲液重悬细胞，采用CD133免疫磁珠分选系统从细胞液中分选出CD133阳性 肝癌干细胞； G. 将前一步骤获得的CD133阳性肝癌干细胞在DMEM/F12培养液中进行培养； H. 37°C、5% C02孵育箱中培养5-7天，从而获得足够用于制备肝癌干细胞疫苗的⑶133 阳性肝癌干细胞。
7. 根据权利要求6所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤E中，在 加入EDTA的同时加入0. 25%胰酶1. 0ml以消化肿瘤细胞。
8. 根据权利要求6所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤G中，在 DMEM/F12培养液中添加：生长因子rhEGF15?25ng/ml、rhbFGF5?15ng/ml、硫酸肝素2? 6ug/ml、胎牛血清0· 1?0· 2% (质量百分比）和青霉素-链霉素双抗0· 5?1. 5% (质量 百分比）。
9. 根据权利要求6所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤Η中， 所述足够用于制备肝癌干细胞疫苗的CD133阳性肝癌干细胞是培养至细胞个数达到 1X105?5X105/ml的CD133阳性肝癌干细胞。
10.根据权利要求2至9之一所述的制备方法获得的肝癌干细胞疫苗用于制备治疗肝 癌的药物中的用途。
【文档编号】A61P35/00GK104258383SQ201410503127
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月26日 优先权日:2014年9月26日
【发明者】陈继冰, 林茂, 左建生, 刘建国, 徐克成, 牛立志 申请人:广州复大医疗股份有限公司复大肿瘤医院