专利名称:人lox-1细胞外结构域的高效可溶性表达及纯化方法
技术领域：
本发明公开一种人L0X-1细胞外结构域的高效可溶性表达及纯化方法，涉及在大肠杆菌中高效可溶性表达人L0X-1细胞外结构域(hLOX-1 E⑶)的表达载体的构建、高效可溶性表达条件的确立及规模化大量纯化工艺的建立，可用于hLOX-1 ECD的大量制备，属生物工程技术领域：
。
背景技术：
心脑血管疾病的前身是动脉粥样硬化(Arteriosclerosis,以下简称As)。As是经多年无症状发展而突然致残致死的疾病，70% -80%的冠状动脉血栓的形成是继发于As 斑块的破裂。对人类而言，随年龄的增长动脉硬化几乎是不可避免的。As在形成脂纹这种初级阶段的时候是可逆的，经治疗，内腔狭窄和斑块可以回缩。所以As的早期诊断和及早针对性治疗对防治心脑血管疾病具有重要的现实意义。
在As的发生机制研究中，人们发现氧化型低密度脂蛋白(Oxidized Low Density Lipoprotein,以下简称οχ-LDL)是导致血管内皮细胞激活、损伤和功能失调的主要危险因子，在As的发病过程中起关键作用。植物血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-I (Lectin-like Oxidized Low Density Lipoprotein Receptor-1,以下简称 LOX-1)是介导血管内皮细胞对ox-LDL摄取的主要受体。
从1997年Sawamura等在牛主动脉内皮细胞中发现了 οχ-LDL的受体L0X-1、次年 Yamanaka等发现人主动脉内皮细胞中同样存在L0X-1以来，研究者们围绕着L0X-1与As 间的关系进行了深入细致的研究。众多研究结果表明，L0X-1存在于As发生和发展的全过程中，是抗As药物筛选的新靶点和急性冠脉综合症的敏感而特异的生物标志物。然而， 以L0X-1为靶点的药物筛选和诊断试剂的研制工作，却由于无法获得大量可溶且稳定的 L0X-1蛋白而始终无法顺利进行。
到目前为止所报道的L0X-1在大肠杆菌中的表达均是以包涵体形式存在的，包涵体复性是获得重组蛋白的主要方法。在众多的包涵体复性方法中，只有Machida等开发利用人工分子伴侣新材料对包涵体进行复性的方法[日本专利，公开号P2001-261697A]被商业化。Xie等利用该方法成功地获得了 L0X-1 C-末端凝集素样结构域(CTLD)的活性蛋白，Ohki等在此工作基础上得到其结晶体及X线的立体结构数据。然而包涵体复性因存在如下不足①反应条件苛刻，需要蛋白变性剂的参与；②过程复杂，费时且效率低；③回收率低，易造成大量损失；④复性后蛋白的稳定性差，在实际应用中受到制约。在大肠杆菌中可溶性表达L0X-1尚未见报道。
发明内容
本发明提供一种人L0X-1细胞外结构域的高效可溶性表达及纯化方法，其目的是获得大量可溶且稳定的hL0X-l E⑶蛋白。
本发明公开的人L0X-1细胞外结构域的高效可溶性表达方法，其技术解决方案包括以下步骤
(I)表达载体的构建
表达载体中使用麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合标签；根据目的蛋白的二级结构及其 pi值的特性在目的蛋白N末端添加蛋白酶酶切位点；采用gateway连接技术构建表达质粒。
(2)表达条件的优化
使用大肠杆菌RoSetta-gami2(DE3)作为表达宿主细胞；通过培养条件及IPTG浓度变化控制表达速度。
(3) hLOX-1 ECD 蛋白的纯化
利用MBPTrap HP回收融合蛋白，通过蛋白酶酶切除去融合蛋白中的MBP标签，分子筛、 离子交换层析等交替使用得到在SDS-PAGE上为单一条带的高纯度hLOX-1 E⑶蛋白。
实现上述方法的具体步骤如下
1、表达载体的构建
选择hLOX-1 ECD结构域为表达对象；利用PCR反应从人L0X-1 cDNA中扩增hLOX-1 E⑶基因片段；采用Gateway技术将目的基因同表达载体进行连接；
1)以人L0X-1cDNA作为模板，设计引物
引物 I :5’ -caccCTGGTGCCACGCGGTTCTTCCCAGGTGTCTGACCTCC-3’
引物 2 :5，-tcattaCTGTGCTCTTAGGTTTGCCTTC-3，
进行PCR反应，扩增出hLOX-1 E⑶基因片段；
2)构建重组克隆质粒pENTR-thr-hLOX-1ECD，将其转化到ToplO感受态细胞中，分离含有pEhLOX-lE质粒的大肠杆菌并培养扩增，回收pEhLOX-lE质粒；
3)向带有MBP融合标签的表达载体pDEST-Mal中插入hLOX-1E⑶基因片段；质粒pEhLOX-lE和pDEST-Mal连接，将反应产物转入大肠杆菌DH5 α，用含有氨苄青霉素的平板筛选含有表达载体pDEST-Mal-thr-hLOX-1 E⑶的大肠杆菌，并进行扩大培养、提取 pDMhLOX-ΙΕ质粒、测序验证插入的hLOX-1 E⑶基因序列的正确性；
2、表达条件的优化
1)用大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)作为表达宿主细胞，将质粒pDMhLOX-ΙΕ通过化学转化法转入宿主细胞中，保存含有质粒pDMhLOX-ΙΕ的大肠杆菌备用；
2)高效表达条件的建立①初始培养温度为30-37度；
②诱导培养温度为20-35度；
③IPTG浓度为100-500微摩尔之间；
④开始诱导时的菌体浓度(以0D_时的吸光度为浓度计算参数)OD6tltl= 0.4-0. 6。
、hL0X-l ECD 蛋白的纯化
将菌体悬浮在生理缓冲液中，采用超声法破碎细胞；将细胞碎片等沉淀物质除去，回收上清液进入分离纯化工序
⑴使用MBPtrap HP亲和层析柱回收可溶的融合蛋白，操作规程依据MBPtrap HP的使用说明书所记述的操作规程。缓冲液为上述的缓冲液A和B，回收含有融合蛋白的组分。
(2)将融合蛋白通过制备型分子筛进行纯化，收集目的蛋白峰。使用缓冲液C进行洗脱，设定洗脱流速为1.5 ml/min。
(3)用凝血酶切开标签蛋白MBP同hLOX-1 ECD蛋白的连接，用MBPtrap HP柱除去 MBP蛋白，回收含有hLOX-1 E⑶蛋白的组分。
(4)采用阴离子和阳离子交换树脂连续交替处理，进一步纯化hLOX-1 E⑶蛋白。使用缓冲液D和E，设定梯度洗脱流速为I. 5 ml/min。回收纯化后的hLOX-1 E⑶蛋白。
(5)进一步分子筛纯化，得到高纯度活性hLOX-1 E⑶蛋白。
本发明公开的人L0X-1构成如图I所示L0X-1由四个结构域构成N-末端胞浆结构域、跨膜结构域(TM)、颈环结构域(NECK)、C-末端凝集素样结构域(CTLD) ；NECK和CTLD构成人L0X-1细胞外结构域(hLOX-1 ECD)，是关键功能结构域。在CTLD结构域中存在三个二硫键。
本发明中hLOX-1 E⑶在大肠杆菌中形成包涵体的原因归纳为以下几点
(1)合成蛋白的速度过快、浓度过高，没有足够的时间和空间形成正常结构；
(2)蛋白在折叠过程中疏水区暴露于溶液中，由于分子间的相互作用而形成错误折叠导致凝集；
(3)细胞内部表达环境的还原性过高，使蛋白质中二硫键稳定性下降，出现错配或多余的~■硫键；
(4)培养温度、pH值、某些金属离子等因素影响重组蛋白动力学的稳定。
利用本发明获得的hLOX-1 ECD蛋白可作为试剂、抗原、靶标分子等应用于科研或 /和以临床医疗为目的的相关药物等的开发与研究。
本发明的积极效果在于MBP标签同分子伴侣一样可引导hLOX-1 E⑶蛋白的正确折叠，抑制包涵体的形成，维持其在大肠杆菌细胞内的稳定性。同时MBP还是纯化标签，利用MBP亲和层析柱可简单而高效地回收融合蛋白。Rosetta-gami2(DE3)可促进hLOX-1 ECD 基因的表达效率，有助于hLOX-1 E⑶蛋白的二硫键正确形成，提高其可溶性表达量。蛋白酶酶切位点方便了 hLOX-1 ECD蛋白同融合标签的分离。本发明纯化过程简便易行，可实现大量制备，并且纯化的hLOX-1 E⑶蛋白纯度高。
图I是人L0X-1构成示意图；
图2为构建的表达载体模式图；
图3为可溶性表达的SDS-PAGE结果；
图4为纯化各阶段SDS-PAGE结果图；
图5为表达及纯化过程示意图；
图6为纯化的hLOX-1 E⑶蛋白的活性检测结果。
具体实施例
本发明中所涉及的主要材料
人L0X-1基因从人内皮细胞cDNA文库中克隆获得。表达载体pDEST-Mal为本实验室自行构建的表达载体。pENTR Directional TOPO cloning Kits >Gateway LR clonase IIEnzyme Mix及表达用大肠杆菌购自Invitrogen公司。PCR反应相关试剂购自TAKARA公司。 MBPTrap HP>Superdex 200>Superdex 75、阴阳离子交换树脂购自 GE Healthcare 公司。引物合成及测序等委托生工生物工程(上海)有限公司。
实施例I :表达载体的构建及可溶性表达验证
一、表达载体的构建
选择hLOX-1 ECD结构域为表达对象。利用PCR反应从人L0X-1 cDNA中扩增hLOX-1 E⑶基因片段。采用Gateway技术将目的基因同表达载体进行连接。
图2是构建的表达载体模式图，其中，MBP表示的是麦芽糖结合蛋白；Thix)mbin site表示的是凝血酶酶切位点。
具体步骤如下
I.以人L0X-1 cDNA作为模板，设计引物
引物 I :5’ -caccCTGGTGCCACGCGGTTCTTCCCAGGTGTCTGACCTCC-3’
(小写部分是Gateway技术构建质粒的引导碱基,下划线表示凝血酶识别位点)
引物 2 :5，-tcattaCTGTGCTCTTAGGTTTGCCTTC-3，
(小写部分是双重终止密码子)
进行PCR反应，扩增出hLOX-1 E⑶基因片段。
2.按照pENTR Directional TOPO cloning Kits说明书上描述的操作方法构建重组克隆质粒pENTR-thr-hLOX-1 ECD(以下略写为pEhL0X_lE)，将其转入ToplO感受态细胞中，分离含有PEhLOX-IE质粒的大肠杆菌并培养扩增，回收pEhLOX-lE质粒。
3.向带有MBP融合标签的表达载体pDEST-Mal中插入hLOX-1 E⑶基因片段。质粒 pEhLOX-lE 和 pDEST-Mal 根据 Gateway LR clonase II Enzyme Mix 说明书中描述的操作方法进行连接反应。反应完成后，立即将反应产物转入大肠杆菌DH5CI，用含有氨苄青霉素的平板筛选含有表达载体pDEST-Mal-thr-hLOX-1 E⑶(以下略写为pDMhL0X_lE)的大肠杆菌，并进行扩大培养、提取pDMhLOX-ΙΕ质粒、测序验证插入的hL0X-l E⑶基因序列的正确性。
二、可溶性表达验证具体实施方案如下
I.用大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)作为表达宿主细胞，将质粒pDMhLOX-ΙΕ通过化学转化法转入宿主细胞中，保存含有质粒pDMhLOX-ΙΕ的大肠杆菌备用。
2.表达条件确立及可溶性表达
①初始培养温度为30-37度；
②诱导培养温度为20-35度；
③IPTG浓度为100-500微摩尔之间；
④开始诱导时的菌体浓度(以0D_时的吸光度为浓度计算参数)OD6tltl= 0.4-0. 6。
具体实施如下
(1)预培养在37度，菌体培养至OD6tltl = 0. 8-0. 9。
⑵以2%的接种量接入含有IOOmL培养基的500 mL摇瓶中，37度继续培养至 OD600=O. 5，之后进行变温处理。
(3)添加终浓度为300微摩尔的IPTG至培养液中，30度诱导培养3小时，收集菌体。
(4)用超声波破碎细胞，离心分别回收上清液和沉淀用于分析可溶性表达蛋白程度。
(5)用SDS-PAGE检查总表达量和可溶性蛋白比率。
图3是可溶性表达的SDS-PAGE结果。其中，M，标准蛋白质分子量标记；1，IPTG诱导前菌体总蛋白；2，IPTG诱导后菌体总蛋白；3，细胞破碎后上清；4，菌体碎片及沉淀。
结论在500 mL摇瓶中，hLOX-1 E⑶蛋白以融合蛋白的形式在大肠杆菌 Rosetta-gami2(DE3)中有70%以上的可溶性表达。构筑的表达载体可以用于hLOX-1 ECD 的可溶性表达。
实施例2 大量表达和纯化方法的建立
使用实施例I中构建成功的表达载体，对表达条件进行优化，并建立表达蛋白的纯化方法。
具体实施方案如下
I.将质粒pDMhLOX-ΙΕ通过化学转化法转入大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中，扩大培养并保存备用。
2.参照实施例I对表达条件进行优化，并将培养量扩大到I升。具体实施如下 ⑴预培养用250ml三角瓶，装液量为50ml，接入大肠杆菌后在37度培养至OD6tltl =O. 8。
(2)以3%的接种量接入含有I升培养基的3 L摇瓶中，37度继续培养至OD6tltl =
O.5，之后进行变温处理。
(3)添加终浓度为300微摩尔的IPTG至培养液中，30度诱导培养3小时，收集菌体。
3. hLOX-1 ECD 蛋白的纯化
将菌体悬浮在生理缓冲液中，采用超声法破碎细胞。将细胞碎片等沉淀物质除去，回收上清液进入分离纯化工序。详细描述如下
所用缓冲液组成如下
缓冲液 A: 20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, I mM EDTA, I mM DTT, pH 8.0。
缓冲液B: 20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, I mM EDTA, I mM DTT, 10 mM Maltose, pH 8. O。
缓冲液C: 20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 8.0。
缓冲液D: 20 mM Tris-HCl, pH 8. O
缓冲液 E: 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8.0。
具体步骤
⑴使用MBPtrap HP亲和层析柱回收可溶的融合蛋白，操作规程依据MBPtrap HP的使用说明书所记述的操作规程。缓冲液为上述的缓冲液A和B，回收含有融合蛋白的组分。
(2)将融合蛋白通过制备型分子筛进行纯化，收集目的蛋白峰。使用缓冲液C进行洗脱，设定洗脱流速为1.5 ml/min。
(3)用凝血酶切开标签蛋白MBP同hLOX-1 ECD蛋白的连接，用MBPtrap HP柱除去 MBP蛋白，回收含有hLOX-1 E⑶蛋白的组分。[0048](4)采用阴离子和阳离子交换树脂连续交替处理，进一步纯化hLOX-1 E⑶蛋白。使用缓冲液D和E，设定梯度洗脱流速为I. 5 ml/min。回收纯化后的hLOX-1 E⑶蛋白。
(5)进一步分子筛纯化，得到高纯度活性hLOX-1 E⑶蛋白。
(6)用SDS-PAGE检查各阶段的纯化结果。
图4是纯化各阶段SDS-PAGE结果。其中，M，标准蛋白质分子量标记；1，细胞破碎后上清液；2，第一次MBPTrap柱的洗脱液；3，分子筛200pg纯化后的目的蛋白峰回收液；4，融合蛋白经凝血酶酶切后的产物；5，再次经MBPTrap分离后的MBP标签蛋白；6，经 MBPTrap分离出的hLOX-1 E⑶蛋白组分；7，最终纯化后的hLOX-1 E⑶蛋白产品。
结论通过上述纯化过程，得到了在SDS-PAGE上为单一条带的高纯度hL0X_l E⑶ 蛋白。
实施例3 hLOX-1 E⑶蛋白的大量表达和纯化
在实施例I和实施例2的基础上，利用5升发酵罐验证了该发明大量制备hLOX-1 ECD 蛋白的可行性。
具体实施方案如下
I.用500毫升三角瓶中装100毫升培养基作为一级培养。37度培养使菌体浓度达到 OD600 = O. 9。
2.以3%的接种量接入含有2升培养基的发酵罐中，搅拌速度为120转/分钟，溶氧调整为20%，37度继续培养至0D_ = O. 5-0. 6。之后将温度降到30度，添加终浓度为300 微摩尔的IPTG至培养液中，控制溶氧在8-10%，继续培养到菌体浓度达到0D_ = I. 0-1. 2， 停止发酵，回收菌体。
3.按实施例2中的纯化方法对表达的hLOX-1 E⑶蛋白进行纯化。
图5是表达及纯化过程不意图。
结论通过5 L发酵罐的放大实验，完整的表达及纯化过程被确立。采用该方法不仅可以在大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中可溶性表达hL0X_l ECD蛋白，同时也可以大量制备。
试验例I
hLOX-1 E⑶蛋白活性测定
hLOX-1 ECD蛋白的活性有无是以该蛋白是否有同ox-LDL的结合活性为判断标准。使用的检测设备是BIAC0RE 3000 (GE Healthcare公司产品)。操作规程按设备说明书执行。
具体步骤如下
⑴将实施例I所得的hLOX-1 ECD蛋白的N末端固定在感测芯片上，安装到设备检测
T D O
(2)用缓冲液C洗脱至基线平衡。
(3)将一定浓度的ox-LDL溶液作为配体流过感测芯片，达到饱和后用缓冲液C洗脱。
(4)通过软件计算hLOX-1 E⑶蛋白同ox-LDL的结合活性。
图6是纯化的hLOX-1 E⑶蛋白的活性检测结果。a_c分别表示不同的οχ-LDL的浓度，其中，(a) O. 5X1(T9 M ;(b) O. 25X 1(Γ9 M ; (c) O. 125Χ10_9 Μ。
结论上述实施例中纯化的hLOX-1 E⑶蛋白同ox-LDL有很好的结合活性。[0066]通过上述实施例，获得的hLOX-1 E⑶蛋白纯度高、稳定性好、且具有很好的生理活性。本发明克服了现有技术中无法大量制备可溶性hLOX-1 ECD蛋白的问题，为规模化制备 hLOX-1 E⑶提供了切实可行的方法。
权利要求
1.一种人L0X-1细胞外结构域的高效可溶性表达方法，包括以下步骤(1)表达载体的构建表达载体中使用麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合标签；根据目的蛋白的二级结构及其 pi值的特性在目的蛋白N末端添加蛋白酶酶切位点；采用gateway连接技术构建表达质粒;(2)表达条件的优化使用大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)作为表达宿主细胞；通过培养条件及IPTG浓度变化控制表达速度；(3)hL0X-lECD蛋白的纯化利用MBPTrap HP回收融合蛋白，通过蛋白酶酶切除去融合蛋白中的MBP标签，分子筛、 离子交换层析等交替使用得到在SDS-PAGE上为单一条带的高纯度hLOX-1 E⑶蛋白。
2.—种人L0X-1细胞外结构域的高效可溶性表达方法，包括以下步骤表达载体的构建选择hLOX-1 ECD结构域为表达对象；利用PCR反应从人L0X-1 cDNA中扩增hL0X_l E⑶基因片段；采用Gateway技术将目的基因同表达载体进行连接；1)以人L0X-1cDNA作为模板，设计引物引物 I :5’ -caccCTGGTGCCACGCGGTTCTTCCCAGGTGTCTGACCTCC-3’引物 2 :5，-tcattaCTGTGCTCTTAGGTTTGCCTTC-3，进行PCR反应，扩增出hLOX-1 E⑶基因片段；2)构建重组克隆质粒pENTR-thr-hLOX-1ECD，将其转化到ToplO感受态细胞中，分离含有pEhLOX-lE质粒的大肠杆菌并培养扩增，回收pEhLOX-lE质粒；3)向带有MBP融合标签的表达载体pDEST-Mal中插入hLOX-1E⑶基因片段；质粒pEhLOX-lE和pDEST-Mal连接，将反应产物转入大肠杆菌DH5 α，用含有氨苄青霉素的平板筛选含有表达载体pDEST-Mal-thr-hLOX-1 E⑶的大肠杆菌，并进行扩大培养、提取 pDMhLOX-ΙΕ质粒、测序验证插入的hLOX-1 E⑶基因序列的正确性；表达条件的优化1)用大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)作为表达宿主细胞，将质粒pDMhLOX-ΙΕ通过化学转化法转入宿主细胞中，保存含有质粒PDMhLOX-IE的大肠杆菌备用；2)高效表达条件的建立①初始培养温度为30-37度；②诱导培养温度为20-35度；③IPTG浓度为100-500微摩尔之间；④开始诱导时的菌体浓度(以0D_时的吸光度为浓度计算参数)OD600= 0. 4-0. 6 ； hL0X-l E⑶蛋白的纯化将菌体悬浮在生理缓冲液中，采用超声法破碎细胞；将细胞碎片等沉淀物质除去，回收上清液进入分离纯化工序⑴使用MBPtrap HP亲和层析柱回收可溶的融合蛋白，操作规程依据MBPtrap HP的使用说明书所记述的操作规程；缓冲液为上述的缓冲液A和B，回收含有融合蛋白的组分；⑵将融合蛋白通过制备型分子筛进行纯化，收集目的蛋白峰；使用缓冲液C进行洗脱，设定洗脱流速为I. 5 ml/min ；(3)用凝血酶切开标签蛋白MBP同hLOX-1ECD蛋白的连接，用MBPtrap HP柱除去MBP 蛋白，回收含有hLOX-1 E⑶蛋白的组分；(4)采用阴离子和阳离子交换树脂连续交替处理，进一步纯化hLOX-1E⑶蛋白；使用缓冲液D和E，设定梯度洗脱流速为I. 5 ml/min ;回收纯化后的hLOX-1 E⑶蛋白；(5)进一步分子筛纯化，得到高纯度活性hLOX-1E⑶蛋白。
专利摘要
本发明公开一种人LOX-1细胞外结构域的高效可溶性表达及纯化方法，涉及在大肠杆菌中高效可溶性表达人LOX-1细胞外结构域(hLOX-1ECD)的表达载体的构建、高效可溶性表达条件的确立及规模化大量纯化工艺的建立，可用于hLOX-1ECD的大量制备，本发明纯化过程简便易行，可实现大量制备，并且纯化的hLOX-1ECD蛋白纯度高。
文档编号C12N15/63GKCN102604980SQ201210044888
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月27日
发明者孟兆丽, 张欣冉, 张海辉, 相宏宇, 谢彦博, 谢秋宏 申请人:吉林大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan