专利名称:一种从l-丙氨酸制备丙酮酸的生物催化方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域：
，涉及微生物催化制备酮酸的新工艺。具体地说，本发明涉及利用粪产碱杆菌细胞催化L-丙氨酸氧化脱氨制备丙酮酸的生物催化方法。
背景技术：
丙酮酸是最重要的a -氧代羧酸之一，不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且也是一种重要的医药化工产品，在制药工业、日用化工、农用化学品等工业及科学研究领域有广泛的用途。鉴于丙酮酸巨大的市场需求，其生产技术的研究已成为化工和生物技术的一大热点。
丙酮酸的制备方法主要有化学合成法和生物技术法。
化学合成法主要包括酒石酸法和乳酸氧化法。酒石酸法以酒石酸为原料，通过与硫酸氢钾共熔脱水脱羧高温反应得到丙酮酸。该法虽然操作简单，但底物转化率低，生产成本高，污染严重。乳酸氧化法以乳酸乙酯为原料，修饰的银或铜为催化剂，反应温度300 600°C，通过液相或气相空气氧化转化为丙酮酸酯，形成的丙酮酸酯经精馏、水解得到丙酮酸。乳酸氧化法存在的缺点是需要采用高温反应。
生物技术法具有生产条件温和、成本低廉、产品纯度高、环境污染小的特点，是丙酮酸生产技术的发展方向。生物技术法包括发酵法和酶转化法。发酵法以糖质原料如葡萄糖或其它碳源直接发酵生成丙酮酸，如公开号CN101096691，CN101691545, CN1690188。发酵法生产丙酮酸的缺点是:丙酮酸作为糖酵解途径的最终产物，处于代谢途径中的关键代谢支点，在细胞中容易代谢为其它产物，很难累积；发酵液中丙酮酸的浓度较低，而且存在聚丙酮酸，a-酮戊二酸等有机杂酸，丙酮酸的分离提取困难。酶转化法主要有三个途径:乳酸脱氢酶法、乳酸氧化酶法和丙酮酸脱羧酶法。乳酸脱氢酶法以乳酸脱氢酶为生物催化齐U，在辅酶NAD+存在下，催化乳酸形成丙酮酸，该法的缺点是反应具有可逆性，乳酸很难转化完全，加入的外源性辅酶NAD+价格非常昂贵，工业化可能性小。乳酸氧化酶法采用乳酸氧化酶为生物催化剂催化DL-乳酸转化为丙酮酸，不需要外源性辅酶，成本大大降低，具有工业应用价值，如公开号CN102199632，CN101182484。日本先进工业科学与技术国家研究院(AIST)成功开发丙酮酸的丙酮酸脱羧酶法制备工艺。该工艺采用丙酮酸脱羧酶/焦磷酸硫胺素酶反应系统，以乙醛为底物，在碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中制备丙酮酸，产率81%。与发酵法相比，虽然酶转化法具有底物转化率高，分离纯化简单的优点，但丙酮酸的酶转化法工业生产仍有许多技术问题需要解决。[0006]L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase)在分子氧存在下，催化L-氨基酸氧化脱氨产生相应的酮酸、氨和过氧化氢。微生物L-氨基酸氧化酶用于酮酸以及D-氨基酸的产生具有很好的前景。Degussa (公开号US6461841)公开了一个L-氨基酸氧化酶产生菌IRhodococcus opacus DSM42350工程菌构建方法以及该工程菌用于制备D-氨基酸的方法，丹麦 Novodisk (公开号 CN1124979)公开了一今有失 Trichoderma Harzianum L-氨基酸氧化酶用作洗涤剂添加酶的专利。产L-氨基酸氧化酶微生物已用于从DL-丙氨酸制备D-丙氨酸，如公开号CN1884565，CN101649344。在这些方法中，L-丙酮酸完全降解，不能累积。目前为止，尚无有关L-氨基酸氧化酶用于制备丙酮酸的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种从L-丙氨酸制备丙酮酸的生物催化方法，使得到的丙酮酸纯度高，反应不污染环境。
为实现上述目的，本发明以产L-氨基酸氧化酶的粪产碱杆菌整细胞为生物催化齐U，催化L-丙氨酸氧化脱氨。反应中产生的过氧化氢利用细胞中的过氧化氢酶催化分解为水和氧，实现丙酮酸的高效制备。
技术路线如下:
权利要求
1.一种从L-丙氨酸制备丙酮酸的生物催化方法，包括以下步骤: a)细胞培养:粪产碱杆菌在培养基中，以L-丙氨酸为诱导剂，30°C培养24h，离心，获得湿菌体，所述幾产喊杆菌为Alcaligens faecali 1.1799 ； b)细胞通透性处理 每Ig湿菌体用ImL30%丙酮水溶液处理5 20min，离心，用冷生理盐水洗涤2次，获得通透性细胞； c)催化反应 每IL蒸馏水中悬浮2(Tl00g步骤b)中的通透性细胞，加入0.2^1.0molL-丙氨酸，30°C下反应6 12h，获得丙酮酸。
2.根据权利要求
1所述一种从L-丙氨酸制备丙酮酸的生物催化方法，其特征是:步骤c)采用HPLC监测反应过程并测定反应液中丙酮酸含量；其中HPLC条件为: 色谱柱:C18 ； 流动相:10mmol/L乙酸 钠与甲醇按体积比80:20混合的溶液，pH3.5 ； 检测波长:214nm ； 温度:25°C。
专利摘要
本发明提供一种从L-丙氨酸制备丙酮酸的生物催化方法。粪产碱杆菌Alcaligens faecalis 1.1799细胞经通透性处理后，利用细胞中的L-氨基酸氧化酶在空气存在下催化L-丙氨酸氧化脱氨形成丙酮酸、氨和过氧化氢，同时利用细胞中的过氧化氢酶催化反应中形成的过氧化氢，实现丙酮酸的累积，无副产物产生。本发明方法具有成本低廉、产品收率和纯度高、环境友好的优点，适合丙酮酸的工业化生产。
文档编号C12R1/05GKCN102586343 B发布类型授权 专利申请号CN 201210045591
公开日2013年7月17日 申请日期2012年2月27日
发明者夏仕文, 何从林, 徐红梅, 方国兰 申请人:重庆邮电大学, 重庆惠健生物科技有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (1),