C4-pep羧化酶的选择性抑制的制作方法
【专利说明】C4-PEP羧化酶的选择性抑制
[0001] 过去，选择性和非选择性除草剂的多个不同靶点已经得到鉴定。然而，仍然非常需 要新的除草剂，特别是选择性除草剂。具体地讲，能够对抗C4植物的特殊除草剂对于农业 经济是极其重要的，也是世界范围内控制杂草的重要转折点。这些杂草降低了最重要的C3 谷物的粮食产量，例如稻米、小麦、大麦和燕麦。
[0002] C4的新陈代谢为选择性除草剂提供了三个可能的靶点。第一个靶点是磷酸烯醇式 丙酮酸（PEP)羧化酶，其在CO 2固定中起作用。第二个靶点是苹果酸酶（ME)或PEP羧激酶 (PEP CK)，其能够促进维管束鞘细胞中二氧化碳的释放。第三个靶点为丙酮酸磷酸双激酶 (PPDK)，其能够使得PEP再生。
[0003] 物质unguinol和ilimaquinone已经被鉴定为C4植物玉米、小米和黍的PPDK的 选择性抑制剂。这些物质分离自海洋生物（Motti等，2007)。所有C4新陈代谢的变体的共 同的唯一通用靶点为PEP羧化酶。由于在植物和其它有机物中的常规C3代谢中起作用的 C4特异性PEP羧化酶和C3同工型之间的较高的序列同源性，采用该酶作为选择性靶点不太 理想。
[0004]目前报道的 PEP 羧化酶抑制剂（Jenkins 等，1987 ;Jenkins，1989 ;McFadden 等， 1989 ;Mancera等，1995)均基于PEP类似物（例如3, 3-二氯代-2-(二羟基膦基甲基） 丙烯酸酯（D⑶P))。然而，这些化合物也能够抑制C3类PEP羧化酶，抑制率为12 - 46 % (Jenkins，1989)并且不抑制C4植物的生长（Doyle等，2005)。Pairoba等（1996)报道，源 自C4植物绿苋（Amaranthus viridis)的PEP羧化酶可以被多种黄酮醇类和黄酮类抑制。 发挥抑制作用的黄酮醇类为槲皮黄酮（quercetin)、槲皮戒（quercitrin)、芦丁（rutin)、 山柰酸（kaempferol)、漆黄素（fisetin)、桑色素（morin)和杨梅素（myricetin)。发挥抑 制作用的黄酮类为黄芩素（baicalein)/黄芩甙（baicalin)。但是在该报道中，既没有鉴定 抑制类黄酮醇（或黄酮类）的结合位点，也没有鉴定抑制的分子机理。因此，抑制类黄酮醇 和黄酮的机理是未知的。另外，也报道了作为源自绿苋的苹果酶的抑制剂的物质，这个事实 意味着非常非特异性的抑制。此外，作者未能展示被测试的黄酮醇和黄酮仅能抑制C4类的 PEP羧化酶而不能抑制C3类同工型。
[0005] 源自大肠杆菌（Escherichia coli) (C3型）和源自C4植物玉米的PEP羧化酶的 晶体结构是已知的（Matsumura等，2002)。在披露的这些结构中，多个氨基酸侧链被确定为 对于反馈（feedback)抑制剂苹果酸盐/酯和天冬氨酸酯/酯而言是重要的。然而，作者未 能注意到我们在C4选择性除草剂的研发中使用的苹果酸酯结合位点的结构差异。
[0006] 因此，需要多用途的有效的C4特异性除草剂，因为源自C4植物的PEP羧化酶的选 择性抑制剂是未知的。
[0007] 如上所述，ilimaquinone和unguinol被鉴定为PPDK的抑制剂。然而，这些抑制 剂具有许多缺点，因为它们抑制了 C4植物的亚群。采用PEP羧基激酶使得CO2释放和PEP 再生的热带杂草没有被抑制。另外，该抑制剂需要复杂的生物合成途径并且生产成本极高 (lOOyg ilimanquinone需要花费150欧元）。此外，两种化合物在水中溶解度较低（具有 较高的clog值（high clog values))，阻碍了植物的再吸收。
[0008] 然而，该化合物的抑制浓度较高，它们的溶解度较差（unguinol的ClogP = 5. 7， iIimaquinone的ClogP = 6. 0)。对于分离的酶而言，unguinol的半数最大抑制浓度（IC50) 为40 yM，ilimaquinone的为292 yM(Motti等，2007)。因此，植物的抑制需要高的多的浓 度，多至毫克分子浓度范围。由于生产成本较高，使用这些化合物是不经济的。
[0009] 最后，unguinol被用作动物的生长激素，具有抗菌活性和细胞毒性，能够抑制酶胆 盐水解酶。因此，其不适合作为除草剂。
[0010] 对于鉴定为源自C4植物绿苋的PEP羧化酶的抑制剂的那些黄酮醇类和黄酮类而 言，采用C3植物的对照试验未能显示对C4同工型的选择性抑制。该出版物的标题暗示了 完整组黄酮类的抑制作用（Pairoba等，1996)，但是该作者未能说明该要求。黄酮类共有 约7000种不同的物质，是植物次生代谢物的最大一类，具有很高的结构多样性。在该结构 多元化的物质种类中，仅测试了很少几个黄酮醇和黄酮。同样属于黄酮类（flavanoides) 的黄烧酮（Flavanones)、黄酮二醇类（flavandioles)、黄烧类（flavanes)、黄烧醇类 (flavanoles)、异黄酮类（isoflavones)和花青素（anthocyanes)没有进行测试。
[0011] 天然存在的黄酮类的固有缺点是其低水溶性，阻碍了这些物质的应用以及再吸 收。
[0012] 所有被测试的PEP类似物的固有缺点在于它们同样能够在一定程度上抑制C3类 PEP羧化酶。它们对于C4植物的生长没有显示任何作用。
[0013] 因此，需要有效的C4选择性抑制剂。所以，本发明涉及至少一种化合物、其盐或溶 剂化物的用途，优选作为C4植物选择性除草剂的化合物、其盐或溶剂化物，其中所述化合 物具有式（I)的结构：
[0014]
[0015] 其中A为环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基，B为环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基， 其中R 1HJ4和R5彼此独立选自H或烷基，键（a)为单键或双键，其中整数i为0或1， 其中在（a)为双键的情况下n为0并且X为0或S，其中在（a)为单键的情况下n为1并 且X为H或烷基，其中键（b)为单键或双键，其中在（b)为双键的情况下m和p为0,其中在 (b)为单键的情况下m和p均为1，
[0016] 和/或具有式（II)的结构：
[0017]
[0018] 包括其互变异构结构，其中俨和R°2彼此独立选自下列基团：H、0H、羧酸、酯、烷 基、烷氧基和卤素，其中Y1选自下列基团：(S( = 0)2)、S( = 0))和（C( = 0))，其中Y2为 〇,其中r为0或1，其中在r为0的情况下q和s为1，其中在r为1的情况下q和s为0， 其中R01、R°2、R°4、R°5、R°6、R°7、R°4#、R°5#、R°6#、R°?、R°9、R°10、R011 和R°12彼此独立选自下列基团： H、-0H、-SO3H、羧酸、酯、烷基、烷氧基和卤素，所述化合物能够与源自C4植物的磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶所含有的苹果酸酯结合位点结合，从而抑制所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
[0019] 应当理解，两种或多种上述化合物也可以用作C4抑制剂，因此，包括两种或多种 式（I)化合物的混合物或者两种或多种式（II)化合物的混合物或者至少一种式（I)化合 物和至少一种式（II)化合物的混合物。
[0020] 在本发明的定义中，术语"烷基"涉及非支链烷基和支链烷基以及含有一或多个杂 原子或官能团的基团，例如，举例来说-〇-、-3-、_順-、-順-(：(=0)-、-(：( = 0)-順-等。该 术语还包括被一或多个适当的取代基进一步取代的烷基。
[0021] 在本发明的定义中，术语"环烷基"涉及任选适当取代的4 一 8元单环烷基以及任 选适当取代的多环烷基。
[0022] 在本发明的定义中，术语"杂环烷基"涉及含有一或多个（优选1 一 4个，例如1、 2、3或4个）杂原子的任选适当取代的4 一 8元单环烷基以及任选适当取代的多环烷基，其 中在环烷基含有1个以上杂原子的情况下，该杂原子可以是相同或不同的。
[0023] 术语"烷基"、"环烷基"、"环烷基"和"杂环烷基"还包括被一或多个适当的取代基 进一步取代的基团。
[0024] 本发明中使用的术语"取代的"优选是指烷基、环烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂 环烷基，其可以在任何位置被一或多个取代基取代，优选被1、2、3、4、5或6个取代基取代， 更优选被1、2或3个取代基取代。如果存在两个或多个取代基，每一个取代基可以是相同 的，或者至少与一个其它取代基是不同的。通常对所述取代基没有限定。
[0025] 所述取代基可以例如选自下列基团：芳基、链烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧 基、芳基幾基氧基、烷氧基幾基氧基、芳基氧基幾基氧基、駿酸醋、烷基幾基、芳基幾基、烧氧 基幾基、氣基幾基、烷基氣基幾基、^?烷基氣基幾基、烧硫基幾基、烷氧基、憐酸醋、勝酸根 (phosphonato)、次膦酸根、氨基、酰基氨基（包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰 基和脈基）、脉基、硝基、亚氣基、疏基（sulfhydryl)、烧硫基、芳硫基、硫代駿酸醋、硫酸醋、 烷基亚磺酰基、磺酸酯、氨磺酰基、磺酰胺基、三氟甲基、氰基、叠氮基、环烷基（例如环戊基 或环己基）、杂环烷基（例如吗啉代、哌嗪基或哌啶基）、烷基芳基、芳基烷基和杂芳基。此 类有机基团的优选的取代基为例如卤素（例如氟、氯、溴或碘）、氨基、羟基、羰基、巯基和羧 基。
[0026] 环烷基的优选的示例为例如环戊基或环己基或留体类，例如具有孕留烷骨架的甾 体类，如12, 20-二氧基孕留烷-3-基。
[0027] 杂环烷基的优选的示例为例如吗啉代、哌嗪基或哌啶基。
[0028] 在本发明的定义中，术语"芳基"是指但不限于任选适当取代的5和6元单环芳族 以及任选适当取代的多环基团，例如双环或三环芳基。因此，术语"芳基"包括例如任选取 代的苯基或任选适当取代的萘基。芳基也可以与脂环族或非芳族的杂环烷基环稠合或桥接 以便于形成多环，例如苯并间二氧杂环戊烯基或四氢化萘。术语"芳基"还包括通过单键与 其它芳族基团连接从而形成例如联苯基的芳族。
[0029] 在本发明定义中使用的术语"杂芳基"包括任选适当取代的5和6元单环芳族以 及取代的或未取代的多环芳基，例如双环或三环芳基，其包含一或多个（优选1 一 4个，例 如1、2、3或4个）杂原子，其中在芳基包含1个以上杂原子的情况下，该杂原子可以是相同 或不同的。此类包含1 一 4个杂原子的杂芳基为例如苯并间二氧杂环戊烯基、吡咯基、呋喃 基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、吡啶基、 吡嗪基、哒嗪基、苯并噁唑基、苯并二噁唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、亚甲二 氧基苯基、萘啶基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、嘌呤基、脱氮嘌呤基、 蝶啶基或中氮茚基。
[0030] 本发明中使用的术语"取代的芳基"和术语"取代的杂芳基"描述了芳基或杂芳基 的一或多个原子例如C或N上的氢被取代基置换的基团。同样，对此类取代基通常没有限 定。所述取代基例如选自下列基团：烷基、链烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰 基氧基、烷氧基幾基氧基、芳基氧基幾基氧基、駿酸醋、烷基幾基、芳基幾基、烷氧基幾基、氣 基幾基、烷基氣基幾基、^?烷基氣基幾基、烧硫基幾基、烷氧基、憐酸酯、勝酸根、次勝酸根、 氨基、酰基氨基（包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基）、脒基、硝基、亚 氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸酯、氨磺酰基、磺酰胺 基、三氟甲基、氰基、叠氮基、环烷基（例如环戊基或环己基）、杂环烷基（例如吗啉代、哌嗪 基或哌啶基）、烷基芳基、芳基烷基和杂芳基。
[0031] 此类有机基团的优选的取代基为例如卤素（例如氟、氯、溴或碘）、氨基、羟基、羰 基、疏基、氣基和駿基。
[0032] 因此，环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基为例如选自下列任选取代的基团：苯并间 二氧杂环戊烯基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、吡唑 基、噁唑基、异噁唑基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、苯并噁唑基、苯并二噁唑基、苯并噻唑基、苯 并咪唑基、苯并噻吩基、亚甲二氧基苯基、萘啶基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、异吲哚基、苯 并呋喃基、嘌呤基、脱氮嘌呤基、蝶啶基、中氮茚基、苯基、联苯基和留体类。
[0033] 通式（I)的化合物
[0034] 根据第一个优选的实施方案，本发明涉及化合物、其盐或溶剂化物作为C4植物选 择性除草剂的用途，其中所述化合物包含环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基，其中所述化合 物具有式（I)的结构：
[0035]
[0036] 其中A为环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基，B为环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基，
[0037] 其中R1、R2、R3、R4和R5彼此独立选自H或烷基，
[0038] 其中整数i为0或1，
[0039