乙酰辅酶a羧化酶剪接变体及其用途的制作方法

专利名称：乙酰辅酶a羧化酶剪接变体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2)剪接变体的核苷酸序列。还涉及由所述核酸编码的对应多肽，和鉴别潜在地可用于治疗与受损的氧化脂肪酸的能力有关的疾病或障碍的化合物的方法，其包含测定该化合物调节ACC2剪接变体复合物或其复合物的活性或量的能力。
背景技术：
许多最近的发现已经指向可变的信使RNA前体剪接，所述剪接作为蛋白多样性的发生器，在有些情况下，其在由单基因产生的多样性的程度上与免疫系统相匹敌。基于可变剪接的全基因组分析，已经预测多达40-60％人基因具有可变剪接形式。该过程允许在由组成型外显子提供的恒定构架中任选地包含或取代一些外显子。得到的蛋白同种型通常在特定的功能结构域存在不同，同时具有共同的功能(Lopez AJ.Annu Rev Genet，32279-305，1998；Graveley.TrendsGenet.17100-107，2001)。可变剪接也可以导致可读框的过早终止，或甚至在2个不同的读框中使用相同的mRNA序列(Quelle等，Cell.83993-1000，1995)。因此，可变剪接对蛋白具有重要的功能后果，且它在产生蛋白多样性中的总体重要性，是由于它的普及和有些基因的极端组合输出。
最近25年已经表现出肥胖症的发病率和严重性的令人担忧的增加。这发生在发达国家和发展中的第三世界国家。例如，超过半数的美国人口受到超重的影响。过度的体重(在西方社会，BMI＞27，在亚洲，＞25)与2型糖尿病、高血压、血脂异常(dyslipidaemia)、心血管疾病、骨关节炎和一些癌症的高危险有关。体重减轻可以对许多这样的发病具有深远的影响，例如，几乎可以预防2型糖尿病的进展。但是，尽管可以容易地实现显著的且有益的体重减轻，但最大的挑战是维持；体重复得对绝大多数人而言是不可避免的。因此，能具体地解决该问题的抗肥胖剂会满足重要的未得到满足的临床需要。
骨骼肌负责全部身体脂质氧化的较大比例，且送递给肌肉的脂质的主要命运是用作氧化燃料。在禁食或轻度锻炼的过程中，血浆未酯化的游离脂肪酸(NEFA)占肌肉燃料需要的80-90％，而当燃料需求长期维持时，循环的细胞间的或细胞内的三酰基甘油酯(triacylglyceride)(TAG)-衍生的脂肪酸负责大多数的脂质氧化。肌肉脂质代谢的调节，依赖于底物可用性和随后的细胞内的游离脂肪酸的运输。游离脂肪酸底物向肌肉的送递，依赖于以TAG的形式原始酯化的游离脂肪酸的动员和运输。在肥胖症中，游离脂肪酸的过度供应驱动向TAG合成的代谢和在肌肉中的储存。现在已经明确，胰岛素抗性与骨骼肌中的过量的肌细胞内(intramyocellular)的TAG密切相关(Krssak等，Diabetologia 42113-6，1999)。
在临床上，难以维持体重减轻，与脂肪酸氧化的损伤紧密相关(Valtuena等，Int J.Obes.Relat.Metab.Disord.21811-7，1997a；Valtuena等，Int.J.Obes.Relat.Metab.Disord.21267-732，1997b)，且代表着肥胖症的药物疗法的主要障碍。在概念上，预期减少由乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2)在氧化组织(例如骨骼肌)中生成的丙二酸单酰辅酶A，会提高脂肪酸氧化速度，并降低呼吸商(RQ)。因此，这可以提高体重减轻后的肥胖患者中的氧化电势。相应地，已经将ACC2视作有前途的抗-肥胖症靶，因为ACC2的缺失导致小鼠的瘦表型(Abu-Elheiga等Science 2912613-2664，2001)，且它的抑制是苗条蛋白-诱导的通过降低丙二酸单酰辅酶A来增加脂肪酸氧化的最后步骤。
存在2种已知的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)同种型，ACC1(ACCα)，它是胞质的，且主要在肝和脂肪组织中表达，和ACC2(ACCβ)，认为它与线粒体有关，且主要在骨骼肌和心脏中表达。乙酰辅酶A羧化酶催化ATP-驱动的乙酰辅酶A的羧化，以形成丙二酸单酰辅酶A。在脂肪酸合成中使用由ACC1生成的丙二酸单酰辅酶A，而推测由ACC2在线粒体表面上局部地形成的丙二酸单酰辅酶A调节棕榈酰辅酶A穿梭系统(CPT-1)。丙二酸单酰辅酶A是肉碱棕榈酰转移酶1(CPT-1)的有效抑制剂，且结果它降低向线粒体中的脂肪酸流量。因而，ACC2活性的降低，会降低局部的丙二酸单酰辅酶A水平，并增加脂肪酸β-氧化，并伴随着减少三酰基甘油(TAG)合成(Munday.Biochem Soc Trans.301059-64，2001)。
因而，乙酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.2)属于碳键形成性连接酶的酶家族。使用生物素作为辅因子，ACC在ATP-驱动的多步反应中羧化乙酰辅酶A，以形成丙二酸单酰辅酶A(1)ATP+HCO3-+ACC-生物素→ADP+P1+ACC-生物素-CO2(2)ACC-生物素-CO2+乙酰辅酶A→ACC-生物素+丙二酸单酰辅酶A认为人乙酰辅酶A羧化酶2被疏水的N-末端锚定在线粒体外膜中(Abu-Elheiga等，Proc Natl Acad Sci USA.97(4)1444-9，2000)。该酶在2458个氨基酸的大单个多肽链(约280 kDa)上具有3个功能结构域，用于协同实现上述的部分反应。
已知ACC1受聚合、解聚合和磷酸化的短期调节。认为柠檬酸盐是ACC的生理变构激活剂，且已经证实，它会诱导ACC1原聚体向丝状结构的多步聚合。柠檬酸盐结合造成无活性的ACC1原聚体的最初的构象变化，这触发随后的二聚体形成(“二聚体”由4个ACC1肽构成)。认为该最初的复合物形成，是所有ACC聚合的限速步骤。还已经证实，ACC2会被柠檬酸盐激活。但是，机理尚不清楚，因为预期ACC2单体/原聚体向线粒体外膜的附着限制酶如何聚合。提出新发现的缺少膜结合序列的ACC2剪接变体ACC2(1b)，是与ACC2形成柠檬酸盐诱导的多聚体复合物的胞质配偶体。
但是，羧化酶反应的柠檬酸盐激活似乎在出现二聚体和多聚体形式的酶之前。该发现暗示着，酶周转的启动不依赖于酶复合物形成，且因而，在线粒体丙二酸单酰辅酶A形成中不需要假定的ACC2-ACC2(1b)配偶体关系。相反地，认为聚合的功能和重要性是对ACC周转的结构保护，以免于激酶(例如，AMPK和/或cAMP PK)的灭活磷酸化。因而，ACC2原聚体尽管最初由柠檬酸盐激活，但会迅速地变得可接近上述的激酶，并被同时的磷酸化关闭，除非与ACC2(1b)相结合。因此，阻止ACC2-ACC2(1b)复合物形成的化合物，不会阻止激活本身，而是通过细胞的能量调节机制，造成酶的下游抑制。因而，能以阻断柠檬酸盐诱导的复合物形成的方式与ACC2和/或ACC2(1b)相互作用的化合物，可以用于减缓线粒体表面上的丙二酸单酰辅酶A生成，并因此也用于增加线粒体中的脂肪酸氧化速度。在免疫沉淀研究中有ACC1和ACC2的异二聚体化的先例。在一项研究中(Dyck等Eur J Biochem 1999)，使用链霉抗生物素蛋白-HRP，单独地检测到与大鼠心脏ACC2共沉淀的更低分子量产物，从而间接地鉴别出了具有ACC1大小但不是ACC1的生物素化的蛋白。当使用SDS-PAGE分离时，预期ACC2(1b)以与ACC1大约相同的速度迁移。但是，应当指出，相同的研究人员还表明，当使用针对ACC1的特异性的抗体时，ACC2会与ACC1共免疫沉淀。异二聚体形成的其它证明来自大鼠肝脏ACC1和ACC2的共免疫沉淀实验(Winz等，JBC 269(20)14438-14445，1994)，其中报道了由2个同种型组成的1∶1复合物。另外证实，当进行非变性PAGE时，ACC1和ACC2会共迁移。ACC1在氧化组织(如骨骼肌和心脏)中的相对低丰度暗示着，在这些器官中存在可替代的调节配偶体，例如ACC2(1b)。
编码ACC2的基因位于染色体12上，且在EMBL条目AC007637中公开了基因组序列。人ACC2 cDNA序列，见EMBL条目HSU89344。2个序列的比对表明，人ACC2基因由52个编码外显子组成。比对还鉴别出公布的ACC2的cDNA序列中的许多错误。因此，发明人已经克隆了ACC2 cDNA，并重新测序。校正的序列如SEQ IDNO2所示。
相关的蛋白。认为代表着ACC2基因的基因组小鼠序列证实了与人酶的最高同源性(约91％)。有错误的大鼠ACC2数据库序列与人ACC2具有83％同一性。人ACC1和ACC2是76％相同的(相似性约82％)。
发明概述本发明源自ACC2的剪接变体的发现，所述变体在本文中称作ACC2(1b)。已经在人骨骼肌、心脏、脂肪组织和肝脏中检测到ACC2(1b)mRNA。剪接变体缺少膜锚定结构域，且被认为是ACC2的调节配偶体，从而与膜锚定的ACC2形成柠檬酸盐诱导的聚合物。另外，ACC2(1b)是上游/下游激酶和磷酸酶的调节作用的潜在介质，所述激酶和磷酸酶构成脂肪酸氧化控制的丙二酸单酰辅酶A轴的部分。本发明的目的是提供一种蛋白，其在代谢疾病的理解中具有重要作用，所述代谢疾病例如肥胖症、2型糖尿病、血脂异常和与受损的氧化脂肪酸的能力有关的其它障碍。已经实现了该目的，其中提供了分离的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有根据SEQ ID NO1的氨基酸序列的乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2)剪接变体，或与其具有至少85％序列同一性的变体，或与SEQ ID NO1中公开的序列不同之处仅在于同义密码子的取代的变体，该变体缺少膜结合能力。该剪接变体可以用于与野生型ACC2相同的筛选、诊断、治疗等。
根据本发明的其它方面，提供了包含上述核酸的质粒。另外，提供了生产包含SEQ ID NO1的氨基酸序列、与其具有至少85％序列同一性的序列、或其C-末端截短的版本的多肽的方法，所述多肽不能膜锚定，该方法包含a)在适于表达多肽的条件下，培养含有表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码ACC2剪接变体多肽、或与其具有至少85％序列同一性的多肽、或其C-末端截短的版本的核酸序列，该多肽不能膜锚定；和b)从宿主细胞培养物中回收多肽。
根据本发明的另一个方面，提供了分离的多肽，其包含SEQ IDNo.1所述的氨基酸序列，或与其具有至少85％相似性的序列，该多肽不能膜结合。
根据本发明的另一个方面，提供了纯化的抗体，其能选择性地结合ACC2剪接变体。
根据本发明的一个方面，提供了能调节ACC2剪接变体的活性或量的化合物在治疗与受损的氧化脂肪酸的能力有关的疾病或障碍中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了鉴别潜在地可用于治疗与受损的氧化脂肪酸的能力有关的疾病或障碍的化合物的方法，其包含测定化合物调节ACC2剪接变体蛋白的活性或量的能力。
根据本发明的另一个方面，提供了分离的ACC2-ACC2(1b)蛋白复合物。因此，提供了鉴别潜在地可用于治疗与受损的氧化脂肪酸的能力有关的疾病或障碍的化合物的方法，其包含测定化合物调节包含ACC2和ACC2剪接变体的复合物的活性或量的能力。
而且，包含野生型ACC2和ACC2(1b)剪接变体的复合物构成了生产丙二酸单酰辅酶A的酶的生理形式。因此，使用重组技术，现在可以首次体外制备该复合物。因此，该复合物可以用于筛选中，以鉴别在治疗代谢疾病中具有潜在的治疗益处的化合物，所述代谢疾病例如肥胖症、2型糖尿病、血脂异常和与受损的氧化脂肪酸的能力有关的其它障碍。
另外，提供了对ACC2剪接变体核酸选择性的抑制性核酸分子或针对ACC2剪接变体蛋白的选择性抗体在生产用于治疗与受损的氧化脂肪酸的能力有关的疾病或障碍的药物中的用途。另外，提供了对ACC2和ACC2(1b)剪接变体复合物选择性的抑制性核酸分子在生产用于治疗与受损的氧化脂肪酸的能力有关的疾病或障碍的药物中的用途。
附图简述

图1是包含新外显子1b的人ACC2基因结构的示意表示。该基因全长约130kb，且包含53个编码外显子，包括2个可替代地使用的含有起始ATG的起始外显子，称作外显子1a和外显子1b。
图2显示了人ACC2和人ACC2(1b)的氨基酸序列的比对。
图3显示了使用实时PCR测量的在人心脏、肝脏、骨骼肌、脾和脂肪组织中的ACC2(1b)RNA表达水平。
图4显示了柠檬酸盐刺激的在转染的HEK293细胞中表达的ACC2(1b)的活性。
图5a至5b显示了来自ACC2、ACC2(1b)和假转染的HEK293细胞的细胞裂解物的SDS-PAGE和随后的蛋白印迹分析的结果。
图6a至6f显示了人心脏和骨骼肌的免疫染色。
发明详述因此，本发明提供了分离的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有根据SEQ ID NO1的氨基酸序列的ACC2剪接变体，或与其具有至少85％序列同一性的变体，或与SEQ ID NO1中公开的序列不同之处仅在于同义密码子的取代的变体，该变体不能膜锚定。本发明还提供了包含所述序列的互补体的核酸分子。本发明还提供了含有要求保护的核酸分子的表达载体，和用所述核酸转化的宿主细胞。本发明还提供了用于表达ACC2的野生型(膜锚定)和剪接变体形式两者的表达系统，以便形成ACC2-ACC2(1b)复合物。本发明还提供了该ACC2-ACC2(1b)复合物在筛选调节所述复合物的活性的化合物中的用途。本发明还提供了纯化的ACC2剪接变体多肽，具体地，具有SEQ ID No1所示的氨基酸序列的那些，与其具有至少85％序列同一性的那些，或其C-或N-末端截短的版本，该变体不能膜锚定。本发明还提供了用于鉴别调节本发明的ACC2剪接变体的表达或活性的化合物的测定，该化合物可以具有治疗价值，尤其是对于肥胖症、2型糖尿病、血脂异常和与受损的氧化脂肪酸的能力有关的其它障碍。
根据本发明的第一个方面，提供了分离的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有根据SEQ ID NO1的氨基酸序列的ACC2剪接变体，或与其具有至少85％序列同一性的变体，或与SEQID NO1不同之处仅在于同义密码子的取代的变体，其中该变体缺少膜锚定能力。在一个实施方案中，ACC2剪接变体包含SEQ ID NO3公开的氨基酸序列。
根据本发明的另一个方面，提供了分离的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有SEQ ID NO3公开的N-末端16氨基酸序列的ACC2多肽，或在该16氨基酸区域具有少于4氨基酸取代的多肽，该变体不能锚定于膜。根据本发明的另一个方面，提供了分离的核酸分子，其包含编码ACC2多肽的核苷酸序列，其中缺少由位置1至8代表的信号肽/靶向肽结构域(SEQ ID NO4)。如本领域的技术人员会明白的，遗传密码的简并性允许给定的编码序列中的许多核苷酸取代，其不会影响编码的蛋白的氨基酸序列。因而，本发明也提供了分离的核酸，其与序列表中公开的编码ACC2剪接变体的核苷酸序列中的任一个的不同之处仅在于，这样的同义密码子的取代。实施例10的多态性分析提供了在个体之间发现的差异的细节。
在本发明的一个特定的实施方案中，核酸包含根据SEQ ID NO1的核苷酸序列，或与其具有至少85％序列同一性的核苷酸，其中所述核酸编码具有SEQ ID NO3所示的N-末端的ACC2剪接变体多肽。在另一个实施方案中，本发明还包括能编码SEQ ID NO3公开的多肽的变体的核苷酸序列，其中所述变体与其具有至少81％序列同一性。在一个实施方案中，核酸包含SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
在另一个方面，本发明提供了分离的ACC2(1b)多肽。在一个实施方案中，多肽具有根据SEQ ID NO1的氨基酸序列；或与其具有至少95％氨基酸序列同一性的序列；或其C-末端截短的版本。特定的实施方案是具有SEQ ID NO3所示的N-末端序列的变体。
在另一个方面，本发明提供了ACC2剪接变体蛋白，其中已对某些残基进行了保守的氨基酸取代，以生成非天然产生的剪接变体，其保留ACC2活性。保守的取代优选地位于尚未参与催化的区域。
术语“分离的”指，从它的原始环境(例如，如果它是天然产生的，则指天然环境)取出材料。例如，存在于活动物中的天然产生的多核苷酸或多肽是未分离的，但是与天然系统中的一些或所有共存材料分离的相同的多核苷酸或DNA或多肽，是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的部分，且/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的部分，且仍然是分离的，因为该载体或组合物不是它的天然环境的部分。
在另一个方面，本发明提供了生产包含SEQ ID NO1的氨基酸序列、与其具有至少85％序列同一性的序列、或其C-末端截短的版本的多肽的方法，所述多肽不能膜锚定，该方法包含a)在适于表达多肽的条件下，培养含有表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码ACC2剪接变体多肽、或与其具有至少85％序列同一性的多肽、或其C-末端截短的版本的核酸序列，该多肽不能膜锚定；和b)从宿主细胞培养物中回收多肽。
可以从细胞本身回收这样的蛋白，或者如果使用适当的异源分泌信号(例如来自SUC2或α-因子的)来确保多肽分泌进培养基中，则可以从培养基回收。
在另一个方面，本发明提供了生产包含SEQ ID NO1的氨基酸序列、与其具有至少95％序列同一性的序列、或其C-末端截短的版本的多肽的方法，所述多肽也包含SEQ ID NO3所示的序列。该方法包含a)在适于表达多肽的条件下，培养含有表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含核酸序列，所述核酸序列编码ACC2剪接变体多肽，或与其具有至少95％序列同一性且包含SEQ ID NO3所示的N-末端16氨基酸的多肽，或其C-末端截短的版本；和b)从宿主细胞培养物中回收多肽。
因而，在另一个方面，本发明提供了用本发明的核酸转化的细胞和细胞系。转化的细胞可以是，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了制备ACC2-ACC2(1b)复合物的方法，其包含，(a)在适于表达多肽的条件下，培养能表达ACC2的野生型和剪接变体形式的宿主细胞，(b)允许多肽形成复合物；和，(c)回收复合物。
根据本发明的另一个方面，提供了分离的ACC2-ACC2(1b)蛋白复合物。所述分离的蛋白复合物可以存在于膜制剂或级分上，或与其相结合。
根据本发明的另一个方面，提供了重组生产的ACC2-ACC2(1b)复合物在筛选具有治疗潜力的化合物中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了分离的ACC2-ACC2(1b)复合物在筛选具有治疗潜力的化合物中的用途。
在另一个方面，本发明提供了纯化的能选择性地结合ACC2剪接变体的抗体，和制备能选择性地结合本发明的ACC2剪接变体蛋白的抗体的方法。选择性地结合是指，基本上不能结合天然的全长ACC2或其任何部分，或ACC2剪接变体以外的任何其它蛋白或多肽。本领域的技术人员能鉴别野生型ACC2和用于针对其设计和制备选择性抗体的各种剪接变体形式之间的氨基酸序列差异。关键差异在于N-末端区域。如本文所使用的，关于抗体结合，可互换地使用词语“选择性的”和“特异性的”。
在本发明的另一个方面，提供了能调节ACC2剪接变体的活性或量的化合物在治疗疾病中的用途，所述疾病例如肥胖症、2型糖尿病、血脂异常和与受损的氧化脂肪酸的能力有关的其它障碍。
通过例如改变的基因表达水平或信息稳定性，可以实现化合物对本发明的ACC2剪接变体的量的调节。通过例如结合ACC2剪接变体蛋白或ACC2-ACC2(1b)复合物的化合物，可以实现化合物对ACC2剪接变体的活性的调节。在一个实施方案中，ACC2剪接变体的调节包含能减少ACC2剪接变体的活性或量的化合物。在另一个实施方案中，ACC2剪接变体的调节包含能增加ACC2剪接变体的活性或量的化合物。在另一个实施方案中，通过能抑制ACC2-ACC2(1b)复合物的活性或量、或复合物形成本身的化合物，实现ACC2活性的调节。能调节ACC2剪接变体的活性的化合物的实例是抗体。使用任何合适的方法，可以制备抗体。例如，可以使用纯化的多肽来制备特异性的抗体。术语“抗体”意在包括多克隆抗体、单克隆抗体和各种类型的抗体构建体，例如F(ab’)2、Fab和单链Fv。如果抗体以大于或等于约107M-1的Ka结合，则将其定义为特异性地结合。使用常规技术，例如Scatchard等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，51660(1949)所述的那些，可以测定结合的亲和力。
使用本领域众所周知的操作，可以从许多来源容易地产生多克隆抗体，例如，马、母牛、山羊、羊、狗、鸡、兔、小鼠或大鼠。通常，一般通过肠胃外的注射，将抗原施用给宿主动物。通过使用佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂，可以增强抗原的免疫原性。加强免疫后，收集少量血清样品，并测试对抗原的反应性。用于这样的测定的各种测定的实例包括下述的那些AntibodiesALaboratory Manual，Harlow和Lane(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；以及下述操作，例如逆流免疫电泳(CIEP)、放射免疫测定、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、斑点印迹测定和夹心测定，见美国专利号4,376,110和4,486,530。
使用众所周知的操作，见例如美国专利号RE 32,011；4,902,614；4,543,439和4,411,993；Monoclonal Antibodies，HybridomasA NewDimension in Biological Analyses，Plenum Press，Kennett，McKearn和Bechtol(eds.)，(1980)所述的操作，可以容易地制备单克隆抗体。
使用替代技术，例如在本文引作参考的Alting-Mees等，“Monoclonal Antibody Expression LibrariesA Rapid Alternative toHybridomas”，Strategies in Molecular Biology31-9(1990)所述的那些，可以生产本发明的单克隆抗体。类似地，使用重组DNA技术来整合编码特异性的结合抗体的基因的可变区，可以构建结合配偶体。这样的技术记载在Larrick等(Biotechnology.7394，1989)。
一旦分离和纯化，使用确立的测定方法，见例如D.M.Kemeny，Pergamon Press，Oxford，英国的“A Practical Guide to ELISA”，可以使用抗体来检测抗原在样品中的存在。
根据本发明的另一个方面，提供了能调节ACC2剪接变体的活性或量的化合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途，所述疾病例如肥胖症、2型糖尿病、血脂异常和与受损的氧化脂肪酸的能力有关的其它障碍。
因而，本发明也提供了用于鉴别能调节本发明的ACC2剪接变体基因或蛋白的表达或活性的小分子或其它化合物的测定。使用未转化的细胞、确立的细胞系或本发明的转化的细胞，可以体外地进行这样的测定，或使用正常的非人动物或转基因动物体内地进行。
具体地，测定可以检测是否存在本发明的核酸的改变的(增强的或减弱的)表达、由这样的核酸编码的蛋白产物的升高的或降低的水平或这样的蛋白的升高的或降低的活性。
根据本发明的另一个方面，提供了鉴别对疾病的治疗潜在地有用的化合物的方法，所述疾病例如肥胖症、2型糖尿病、血脂异常和与受损的氧化脂肪酸的能力有关的其它障碍，其包含测定化合物调节ACC2剪接变体的活性或量的能力。优选地，测定选自i)使用表达ACC2剪接变体的细胞系，或使用纯化的ACC2剪接变体蛋白，测量ACC2剪接变体活性；ii)使用表达ACC2剪接变体和ACC2野生型的细胞系，或使用纯化的ACC2-ACC2(1b)蛋白复合物，测量ACC2活性；和iii)测量在表达ACC2剪接变体的细胞系中的ACC2剪接变体转录或翻译。
该方法可以如下实现使用分离的ACC2和ACC2(1b)剪接变体的复合物，并测量所述复合物关于丙二酸单酰辅酶A生产的活性。使用由所述复合物形成的生成的无机磷酸盐的孔雀绿检测，或通过测量14CO2向14C-丙二酸单酰辅酶A中的整合，可以在无细胞的测定中进行测量。通过使用表达ACC2和ACC2(1b)剪接变体复合物的细胞系，测量ACC2和ACC2(1b)剪接变体复合物的活性，也可以在基于细胞的测定中进行该方法。使用表达ACC2和ACC2(1b)剪接变体复合物的细胞系，可以测量ACC2和ACC2(1b)剪接变体复合物的转录和/或翻译。在一个实施方案中，疾病或障碍选自肥胖症、2型糖尿病或血脂异常。
用于测定待测化合物对ACC2剪接变体的转录或翻译的作用的测定，可以基于在表达ACC2剪接变体的细胞中，i)使用例如RNA印迹分析或定量实时PCR，测量形成的ACC2剪接变体mRNA的量，ii)使用例如蛋白印迹分析，或免疫化学分析例如ELISA，测量形成的ACC2剪接变体蛋白的量，或iii)测量如上所述的ACC2剪接变体活性。
在测定中使用的细胞可以是，天然地表达ACC2剪接变体的细胞，或表达重组的ACC2剪接变体的转染的细胞。优选地，ACC2剪接变体是人重组ACC2剪接变体。
ACC2剪接变体，无论是单独的还是与野生型ACC2共表达的，可以在许多宿主中表达，所述宿主例如细菌、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞和人和动物细胞。真核重组宿主细胞是特别优选的。实例包括酵母，哺乳动物细胞，包括人、牛、猪、猴和啮齿类动物来源的细胞系，和昆虫细胞，包括果蝇(Drosophila)和蚕衍生的细胞系。源自可以使用的且可商业上得到的哺乳动物物种的细胞系包括，L细胞L-M(TK-)(ATCC CCL 1.3)、L细胞L-M(ATCC CCL 1.2)、HEK 293(ATCC CRL 1573)、Raji(ATCC CCL 86)、CV-1(ATCC CCL 70)、COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)和MRC-5(ATCC CCL 171)。
通过许多技术中的任一种，包括磷酸钙转化、DEAE-葡聚糖转化、阳离子脂质介导的脂转染、电穿孔或感染，可以将包含编码ACC2剪接变体(单独的或与野生型ACC2共表达的)的核酸的表达载体导入宿主细胞，以表达多肽。
繁殖并克隆转染的宿主细胞，例如通过有限稀释，并分析，以测定重组ACC2剪接变体/野生型ACC2的表达水平。通过几种方式，包括与抗体的免疫学反应性和/或使用本文所述的测定检测生物学活性，可以鉴别表达ACC2剪接变体(单独的或与野生型ACC2共表达的)的转化的宿主细胞。
基因表达的转录调节由指导转录因子的结合的启动子中的特定DNA元件介导，其从而介导该基因的转录。真核转录因子可以分成2大组i)基本转录因子，其与转录起始处近侧的启动子序列相互作用，从而在RNA聚合酶II的募集后启动转录，和ii)转录因子，其结合特定的远侧启动子元件，从而调节与基本转录机制接触后的转录。真核生物中的基本生理过程是，细胞可以与它们的环境通讯，并通过信号传导分子，例如激素和生长因子，对细胞外的刺激作出响应。这样的信号传导的最后事件是，转录因子与特定的远侧启动子元件的结合，从而导致例如上调的或组织特异性的基因表达。因为它们的调节作用，所以启动子元件是筛选治疗剂的推定靶。
合适的宿主细胞是已知表达ACC2剪接变体的细胞，或已知表达可以影响ACC2剪接变体的转录的转录因子的细胞。优选地，可以使用用编码特定的转录因子的DNA转染的宿主细胞，以研究定义的转录因子和ACC2剪接变体启动子的相互作用。
用于测定待测化合物对ACC2剪接变体的转录的作用的测定，可以基于，使用报告基因系统测量ACC2剪接变体启动子的活性。报告基因系统是包含构成ACC2剪接变体启动子的核酸分子、或其片段的表达系统，该表达系统还包含报告基因，启动子和报告基因被这样放置，从而报告基因的表达由ACC2剪接变体启动子调节。形成的报告蛋白的量用作ACC2剪接变体启动子的活性的指示。
可以用于构建报告基因系统的合适的报告基因是例如萤火虫萤光素酶基因、细菌氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、β-半乳糖苷酶(β-GAL)基因和绿色荧光蛋白(GFP)。
根据本发明的另一个方面，提供了制备药物组合物的方法，其包含i)根据本文所述的方法，鉴别可以用于治疗疾病的化合物，所述疾病例如肥胖症、2型糖尿病、血脂异常和与受损的氧化脂肪酸的能力有关的其它障碍；和ii)将化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的赋形剂或稀释剂相混合。
基于每种剪接变体形式的相对量的测定，可以存在诊断或预后应用。通过调节各种剪接变体形式的表达或量，可以得到治疗应用的其它方法。
因而，根据本发明的另一个方面，提供了测定个体对发展疾病的易感性的方法，所述疾病例如肥胖症、2型糖尿病、血脂异常和与受损的氧化脂肪酸的能力有关的其它障碍，其包含测量由个体表达的ACC2的野生型和剪接变体形式的相对量，和基于存在的相对量，测定个体对发展疾病的易感性，所述疾病例如肥胖症、2型糖尿病、血脂异常和与受损的氧化脂肪酸的能力有关的其它障碍。
根据本发明的另一个方面，提供了诊断患者中疾病的严重性的方法，所述疾病例如肥胖症、2型糖尿病、血脂异常和与受损的氧化脂肪酸的能力有关的其它障碍，其包含测量由个体表达的ACC2的野生型和剪接变体形式的相对量，和基于存在的相对量，测定疾病的严重性。
在一个实施方案中，从肌肉活组织检查样品测量ACC2形式的量。在另一个实施方案中，可以使用诊断方法来测量治疗性治疗的类型。在另一个实施方案中，可以通过监控治疗性治疗过程中由个体表达的全长和剪接变体形式的ACC2的相对量，使用该方法来评估个体的治疗性治疗的有效性。例如，通过在治疗之前、过程中和之后进行监控。
在另一个方面，本发明也提供了诊断患有与受损的氧化脂肪酸的能力有关的障碍的个体的方法，其包含测定个体是否存在本发明的ACC2剪接变体，或其相对量。在一个特定的实施方案中，该障碍是肥胖症。合适的测定包括基于核酸的测定(采用本发明的核酸或能特异性地鉴别本发明的核酸的那些)和基于蛋白的测定(采用本发明的抗体或多肽)。
在本发明的另一个方面，提供了诊断方法，其包含分析从患者得到的DNA样品中的ACC2剪接变体基因的序列、或其选择性的部分，以用于测定对发展疾病的易感性，所述疾病例如肥胖症、2型糖尿病、血脂异常和与受损的氧化脂肪酸的能力有关的其它障碍。
根据本发明的基因知识还提供了，通过例如使用反义DNA或RNA，调节它的体内表达的能力。抑制或减弱特定基因或基因转录物(例如本文鉴别的ACC2剪接变体)的表达水平的一种治疗方式是使用反义治疗。反义治疗利用反义核酸分子，后者是DNA或RNA(“寡核苷酸”)的合成片段，设计用于反映(mirror)特定的mRNA序列和阻断蛋白生成。一旦形成，mRNA会结合核糖体，即细胞的蛋白生产“工厂”，其能有效地阅读RNA序列，并生产基因指令的特定蛋白分子。如果将反义分子送递给细胞(例如作为天然寡核苷酸或通过合适的反义表达载体)，它会结合信使RNA，因为它的序列被设计成靶碱基序列的互补体。两条链一旦结合，则mRNA不再能指令核糖体对编码的蛋白的生产，并被细胞的酶迅速破坏，从而释放反义寡核苷酸，以寻找和破坏另一条相同的mRNA信使链。
利用本文教导的ACC2剪接变体基因和mRNA序列的知识，本领域的技术人员能设计合适的反义核酸治疗分子，并根据需要施用它们。
使用充分确定的技术，可以实验地测定具有治疗潜力的反义寡核苷酸分子。为了使下调本发明的ACC2剪接变体基因在哺乳动物细胞中的表达的方法可行，可以容易地构建实例反义表达构建体，例如使用pREP10载体(Invitrogen Corporation)。预期转录物抑制该基因在用该类构建体转染的细胞中的翻译。反义转录物能有效地抑制天然基因转录物的翻译，且能诱导本文所述的作用(例如，组织生理学的调节)。与ACC2剪接变体基因mRNA的任何部分互补的且可杂交的寡核苷酸被预期用于治疗性应用。1997年6月17日授权的美国专利号5,639,595，“Identification of Novel Drugs and Reagents”，在本文中引作参考，其中充分描述了鉴别展示出体内活性的寡核苷酸序列的方法。将含有源自ACC2剪接变体基因序列的随机的寡核苷酸序列的表达载体转化进细胞中。然后，测定细胞中源自所需的寡核苷酸活性的表型。一旦已经鉴别出了具有所需的表型的细胞，就可以鉴别出具有所需的活性的寡核苷酸的序列。鉴别可以如下实现通过回收载体，或通过聚合酶链反应(PCR)扩增，并对含有插入的核酸材料的区域测序。可以合成反义分子，以用于反义治疗。这些反义分子可以是DNA、DNA的稳定衍生物例如硫代磷酸酯或甲基膦酸酯、RNA、RNA的稳定衍生物例如2′-O-烷基RNA或其它寡核苷酸模仿物(mimetics)。1997年7月29日授权的美国专利号5,652,355，“HybridOligonucleotide Phosphorothioates”，和1997年7月29日授权的美国专利号5,652,356,“Inverted Chimeric and HybridOligonucleotides”，引作参考，其描述了生理上稳定的反义分子的合成和作用。通过显微注射、脂质体被囊化或通过从携带反义序列的载体的表达，可以将反义分子导入细胞中。
如上所述，也可以将反义核酸分子提供为RNA，在本领域现在已知具有长半衰期的RNA的一些稳定形式，其可以直接施用，无需使用载体。另外，通过脂质体、受体介导的转染和本领域已知的其它方法，可以将DNA构建体送递给细胞。
通过标准的分子生物学和/或通过如上所述的化学合成，使用常规方法，可以生产用于与靶基因协同作用的反义DNA或RNA。如果需要，可以化学地修饰反义DNA或反义RNA，以便预防体内降解或促进穿过细胞膜的运输，和/或可以与其连接能灭活mRNA的物质，例如核酶，且本发明延伸至这样的构建体。
反义DNA或反义RNA可以用于治疗人的疾病或障碍，其中已经涉及到ACC2剪接变体基因产物的过度调节或调节不足的生产。
或者，核酶分子可以被设计用于体内地切割和破坏ACC2剪接变体mRNA。核酶是具有高度特异性的内切核糖核酸酶活性的RNA分子。锤头核酶包含杂交区，其核苷酸序列与靶RNA的至少部分互补，和催化区，其适用于识别和切割靶RNA。优选地，杂交区含有至少9个核苷酸。这样的核酶的设计、构建和使用，是本领域众所周知的，且更完整地记载在Haselhoff和Gerlach(Nature.334585-591，1988)。在另一个替代方案中，设计成与ACC2剪接变体基因的5’-区域杂交、以便形成三股螺旋结构的寡核苷酸，可以用于阻断或减少ACC2剪接变体基因的转录。在另一个替代方案中，设计克隆进质粒载体中的RNA干扰(RNAi)寡核苷酸或短(18-25bp)RNAi ACC2剪接变体序列，以将双链RNA导入哺乳动物细胞，来抑制和/或导致ACC2剪接变体信使RNA的降解。ACC2剪接变体RNAi分子可以从腺嘌呤/腺嘌呤(AA)或至少(任意的碱基-A、U、C或G)A....开始，且可以包含18或19或20或21或22或23或24或25碱基对双链RNA分子，优选的长度是21碱基对，且对具有2核苷酸3’突出端的单个ACC2剪接变体序列或形成发夹结构的45-50聚体RNA分子是特异性的。这样的小抑制RNA分子的设计、构建和使用，是本领域众所周知的，且更完整地记载在下述文献中Elbashir等，(Nature.411(6836)494-498，2001)；Elbashir等，(Genes&Dev.15188-200，2001)；Harborth，J.等(J.Cell Science 1144557-4565，2001)；Masters等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 988012-8017，2001)；和，Tuschl等，(Genes&Dev.133191-3197，1999)。
根据本发明的另一个方面，提供了治疗人的方法，所述人需要用作用于ACC2剪接变体蛋白或ACC2-ACC2(1b)蛋白复合物的小分子药物、或针对ACC2剪接变体mRNA起作用的抑制性核酸分子进行治疗，其中该方法包含i)测量从人得到的合适的样品中的ACC2剪接变体mRNA的水平；ii)参考ACC2剪接变体mRNA的正常水平，确定人的状态；和iii)施用有效量的药物或抑制性核酸分子。
根据本发明的另一个方面，提供了治疗人的方法，所述人需要用作用于ACC2剪接变体蛋白或ACC2-ACC2(1b)蛋白复合物的小分子药物、或针对ACC2剪接变体mRNA起作用的抑制性核酸分子进行治疗，其中该方法包含i)测量从人得到的样品中的ACC2剪接变体蛋白或ACC2-ACC2(1b)蛋白复合物的水平；和ii)参考所述蛋白的正常水平，确定人的状态；和iii)施用有效量的药物或针对ACC2剪接变体mRNA起作用的抑制性核酸分子。
治疗患有肥胖症、2型糖尿病、血脂异常或与受损的氧化脂肪酸的能力有关的其它障碍的患者的方法，其包含给患者施用能减少ACC2剪接变体的转录或表达的化合物或核酸分子。
治疗患有肥胖症、2型糖尿病、血脂异常或与受损的氧化脂肪酸的能力有关的其它障碍的患者的方法，其包含给患者施用靶向ACC2剪接变体的mRNA的抑制性核酸分子。
针对ACC2剪接变体核酸的抑制性核酸分子或针对ACC2剪接变体蛋白的抗体在生产用于治疗疾病的药物中的用途，所述疾病例如肥胖症、2型糖尿病、血脂异常和与受损的氧化脂肪酸的能力有关的其它障碍。
在本发明的每一个上述方面，“抑制性核酸分子”选自反义、核酶、三股螺旋适体(aptemer)和RNAi分子。
除非另有定义，在本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在本文中提及的所有出版物都在本文中引作参考。
实验部分现在，将参考下面的非限制性实施例来阐明本发明。
使用AMPLITAQTM，其可从Perkin-Elmer Cetus得到，作为热稳定的DNA聚合酶的来源。
除非另有说明，本发明的实践采用属于本领域技术范围内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法。在文献中充分解释了这样的技术。见，例如，Sambrook等，编，MolecularCloningA Laboratory Manual(第3版)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2001)；Ausubel等，编，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NewYork，NY(2002)；Glover&Hames，编，DNA Cloning 3A PracticalApproach，Vols.I，II，&III，IRL Press，Oxford(1995)；Colowick&Kaplan，编，Methods in Enzymology，Academic Press；Weir等，编，Handbook of Experimental Immunology，第5版，Blackwell ScientificPublications，Ltd.，Edinburgh，(1997)；Fields，Knipe，&Howley，编，Fields Virology(第3版)Vols.I&II，Lippincott Williams&WilkinsPubs.(1996)；Flint，等，编，Principles of VirologyMolecular Biology，Pathogenesis，and Control，ASM Press，(1999)；Coligan等，编，Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons，New York，NY(2002)。
应当理解，本发明不限于所述的特定方法、规程、细胞系、载体和试剂，因为它们可以变化。
实施例1人乙酰辅酶A羧化酶2的新剪接变体ACC2(1b)的硅片上(insilico)预测使用新序列信息和硅片上预测方法的组合，鉴别了人ACC2的新剪接变体的序列。针对含有人基因组DNA的EMBL条目，blast人ACC2 EMBL条目HSU89344(Blast2 NCBI)。发现来自染色体12的人BAC克隆RCPI11-443D10含有编码人ACC2的基因。在EMBL条目AC007637中发现了该克隆的基因组序列。
使用HSU89344和AC007637之间的比对，分析了人ACC2的基因结构。使用比对，预测外显子，并使用内含子剪接共有位点，预测准确的外显子边界。比对表明，人ACC2基因由52个编码外显子组成。在HSU89344的序列和AC007637的基因组序列之间，发现了多个错配。通过将52个编码外显子的序列拼贴到一起，生成人ACC2的校正的序列，以得到预测的ACC2的编码序列。在一种情况下，预测HSU89344的序列的部分由侧接不规则的剪接信号的内含子序列组成，并因此在预测的人ACC2的校正的编码序列中缺失。
使用预测的针对EMBL的EST部分的人ACC2序列进行的Blast2(NCBI)分析表明，存在2个鼠EST序列，其具有剪接到基因的外显子2的序列上的新5′末端(鼠EST BB854145和BB866065)。这2个EST的新5′末端和人基因组DNA之间的比对表明，该序列在人中是保守的。同样，发现该保守序列含有可变的起始ATG，且在小鼠和人基因组DNA中，其后是5′共有剪接位点。因此，该序列似乎能编码ACC2的可替代地使用的独特起始外显子。该外显子称作外显子1b(相对于含有在HSU89344中使用的起始ATG的外显子1a)，且图1显示了包含新外显子的示意基因结构。
通过将外显子1b的编码序列剪接到预测的外显子2-52的序列上，构建了人ACC2(1b)的新剪接变体的编码部分(SEQ ID NO5和1分别显示了新剪接形式的预测的核苷酸序列和氨基酸序列)。
在图2中，显示了人ACC2和人ACC2(1b)的氨基酸序列的比对。使用具有下述参数的GCG Gap(Wisconsin)，进行比对缺口权重8 平均匹配 2.912长度权重2 平均错配 -2.003质量11665 长度 2461比率5.171 缺口1百分比相似性99.512 百分比同一性99.423
实施例2人ACC2的克隆为了开发用于生产重组ACC2的方法，通过RT-PCR从人骨骼肌mRNA，克隆了编码人ACC2的cDNA。PCR扩增了覆盖ACC2的7.5kb序列的共3个片段，并对多个克隆测序。
使用校正聚合酶pfu(Stratagene)，从人心脏cDNA文库，PCR扩增了第一个片段1至3925。PCR使用的引物分别是作为正向引物的5’-ATGGTCTTGCTTCTTTGTCTATC-3’(SEQ ID NO6)和作为反向引物的5’-GGCTGTTTAACACATAGGCGA-3’(SEQ ID NO7)。将产物克隆进“TA”克隆载体pCR2.1，转化进大肠杆菌(E.coli)XL-10 Gold细胞(Stratagene)，并进行完全双链测序。
使用Taq-plus Precision(Stratagene)，从人骨骼肌cDNA，分别PCR扩增了第二个和第三个片段，3250至5356 bp和5335至7302bp。对于第二个PCR片段，将5’-CAGAGCATGGTGCAGTTGGT-3’(SEQ ID NO8)用作正向引物，并将5’-CCATGTCTTCCAGGAGAGGTCC-3’(SEQ ID NO9)用作反向引物。对于第三个PCR片段，将5’-TCGTCATCGGCAATGACATA-3’(SEQ ID NO10)用作正向引物，并将5’-GGTCCACCTCCGGCCC-3’(SEQ ID NO11)用作反向引物。将PCR产物克隆进pCR2.1-TOPO载体，并转化进大肠杆菌Top 10细胞(Invitrogen)，并进行双链测序。
结果表明，所有克隆的核苷酸序列都与公开的cDNA序列(登记号NM_001993)明显不同，但是与来自人类基因组计划的基因组序列以及在公开的数据库中发现的EST相当好地匹配。
通过连接从pCR2.1-TOPO载体消化出的3个片段，将全长ACC2cDNA拼贴到一起。这些片段包括1至3288bp、3288至5323bp和5323至7302bp，并使用BamH1位点来将2个内部位点连接到一起。将全长cDNA连接进哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)。
如通过针对人ACC2的抗体所检测的，pcDNA-ACC2向COS-7细胞和HEK293细胞中的瞬时转染导致ACC2表达的高水平。
使用iPSORT预测软件(Bannai等，Bioinformatics 18∶2,298-305，2002)，在人ACC2 N-末端区域进行N-末端分选信号的硅片上预测。分析了人ACC2(SEQ ID NO2)和人ACC2的硅片上N-末端截短，并通过iPSORT进行预测。预测全长人ACC2包含信号肽。序列MVLLL的截短，将iPSORT预测从“信号肽”变成“线粒体转运肽”。其它N-末端截短，排除了序列MVLLLCL，导致人ACC2 N-末端的靶向标记的丧失。
实施例3人组织的TaqMan分析证实了ACC2(1b)转录物的存在使用Primer Express 1.5软件(Applied Biosystems)，设计hACC2(1b)的寡核苷酸引物和探针。设计正向引物5′-AGTCCTGCCAAGTGCAAGATCT-3′(SEQ ID NO12)、反向引物5′-TCTGTGCAGGTCCAGCTTCTT-3′(SEQ ID NO13)和FAM-标记的探针5′-TGATCGCGAAGTAAAGCCGAGCATGT-3′(SEQ IDNO14)，以覆盖外显子1B和外显子2。人酸性核糖体磷蛋白(h36B4)引物和VIC-标记的探针用作内源对照。
使用来自100ng聚腺苷酸+RNA(脂肪组织)和1μg总RNA(心肌、骨骼肌和肝脏)的SuperscriptIII(Invitrogen)和oligoDt引物，合成了第一链cDNA。为了测定ACC2(1b)在人心肌(Ambion)、骨骼肌(Ambion)、肝脏(BD Biosciences)和脂肪组织(BD Biosciences)中的表达，使用了实时PCR(ABI prism 7500检测系统，AppliedBiosystems)。使用Taqman Universal PCR Mastermix(AppliedBiosystems)，向其中加入引物和探针，进行PCR，并在3％琼脂糖凝胶上验证预期大小的实时PCR产物。使用7500实时PCR系统序列检测软件(Applied Biosystems)进行分析。图3中的结果表明ACC2(1b)转录水平是脂肪组织＞骨骼肌＞心肌＝肝脏，样品(n＝3)之间几乎没有或没有变化。
实施例4人ACC2(1b)的克隆为了制备ACC2(1b)克隆，我们利用了下述事实，即ACC2和剪接变体ACC2(1b)之间的差异仅仅是外显子1。使用含有cDNA的载体作为原材料，所述cDNA编码具有校正的序列的人ACC2(SEQ IDNO2)。使用2种限制酶Nhe1和Hind3的切割位点，切出ACC2 N-末端的序列，并用编码独特的ACC2(1b)N-末端的片段取代它。Nhe1识别序列存在于紧挨ACC2起始密码子上游的载体的多克隆区域中，而Hind3位点存在于ACC2和ACC2(1b)共有的天然序列的下游。使用Taqplusprecision(Stratagene)，从人心脏cDNA，扩增编码独特的ACC2(1b)N-末端且也包含随后共有的ACC2/ACC2(1b)序列的cDNA。含有Nhe1位点的正向PCR引物是5′-ATAAGCTAGCGCCACCATGAGTCCTGCCAAGTGCA-3′(SEQ ID NO15)在天然的Hind3位点的下游的反向引物是5′-TCCTCCGCACTCTCAGCCTTCCGGATT-3′(SEQ ID NO16).
用限制酶Nhe1和Hind3消化使用上述的PCR引物的、包含ACC2 cDNA和PCR产物的载体，净化切割的产物，然后将插入片段(PCR产物)连接进载体。将得到的连接产物转化进大肠杆菌TOP-10细胞，并通过双脱氧测序，证实ACC2(1b)序列向载体中的插入。
实施例5ACC2(1b)在HEK293细胞中的功能表达使用包含实施例1和3所述的cDNA的载体pcDNA3.1(+)，瞬时转染HEK(人胚肾)293细胞。使用亲脂的转染试剂，用5μg上述质粒/10cm培养皿转染细胞。在转染时(第1天)，细胞单层是约60％汇合的，且在收获时(第4天)，完全汇合。使用14CO2-固定测定，监控来自这些转染的HEK293细胞的细胞裂解物的乙酰辅酶A羧化酶活性。图4所示的数据表明，柠檬酸盐刺激表达的ACC2(1b)的活性。ACC2(1b)细胞裂解物和来自用ACC2转染的细胞的裂解物的SDS-PAGE分析表明2种蛋白之间的预期的分子量差异，前者比全长ACC2迁移得略快(未显示数据)。因而，ACC2剪接变体ACC2(1b)证实了柠檬酸盐刺激的催化活性以及预期的凝胶电泳过程中更高的迁移速度。使用特异性地识别N-末端ACC2序列(表位＝氨基酸(a.a.)45-64)的抗体以及针对共有的ACC2/ACC2(1b)序列(表位＝氨基酸1335-1354)产生的抗体，进行对比性的蛋白印迹分析。前一种抗体仅仅鉴别ACC2肽，而后者可鉴别ACC2和ACC2(1b)肽，因而，证实了2种蛋白之间的N-末端序列差异。
实施例6ACC2(1b)抗体在兔的免疫接种中，使用与独特的人ACC2(1b)N-末端相同的合成肽MSPAKCKICFPDREVK(SEQ ID NO3)。将相同的肽缀合到树脂上，并在生成的血清的亲和纯化中使用，从而产生具有ACC2(1b)的特异性识别的IgG级分。将来自ACC2、ACC2(1b)和假转染的HEK293细胞的细胞裂解物，进行SDS-PAGE，并将蛋白转移到PVDF上，以用于使用1∶5000稀释的生成的抗体(第二抗体＝山羊抗兔HRP缀合的，1∶25000稀释的)，进行蛋白印迹。使用ECL Plus(化学发光)的检测，并随后曝光于胶卷，会鉴别出与ACC2(1b)相对应的特定条带，而在假转染的细胞裂解物或ACC2转染的细胞裂解物中没有任何识别，尽管经考马斯染色证实存在ACC2肽(图5)。
实施例7人心脏和骨骼肌的免疫染色图6显示了用实施例6所述的ACC2(1b)抗体(1∶100稀释)和来自Ventana的山羊抗兔抗体(HRP-缀合物，1∶500稀释)组合染色的人骨骼肌。在没有(图6A)或有(图6B)10-倍过量的合成肽MSPAKCKICFPDREVK(SEQ ID NO3)存在的情况下，或在没有第一抗体(图6C)的情况下，进行染色。图6A和6B的对比表明，用肽预吸附阻断染色，并从而证实ACC2(1b)抗体和内源酶之间的特异性的相互作用。而且，图6C证实，染色仅仅由第一抗体介导，因为在有单独的第二抗体存在下，没有显色。但是，肽MSPAKCKICFPDREVK(SEQ ID NO3)的预吸附，没有阻断使用识别全长ACC2和剪接变体ACC2(1b)的抗体(ACC2-4，1∶100稀释)的人骨骼肌免疫染色(图6D)，这进一步支持了ACC2(1b)抗体和内源表位ACC2(1b)之间的相互作用的特异性。图6E和F代表着使用1∶100稀释的人心肌的(心房的)ACC2(1b)-Ab染色。因而，已经表明ACC2(1b)剪接变体蛋白天然地存在，因为通过天然的人氧化组织例如骨骼肌和心脏的免疫染色，可以检测ACC2(1b)实施例8ACC2-ACC2(1b)复合物形成表达人ACC2，其具有融合到它的C-末端上的His-标记(hACC2-6xHis)。在没有柠檬酸盐存在的情况下，使含有表达的融合蛋白的细胞裂解物用镍树脂柱平衡，并与其结合。在含有适当量的柠檬酸盐的介质中，使包含重组人ACC2(1b)的细胞裂解物穿过柱，以诱导ACC2构象转移，和随后的结合到镍树脂上的ACC2与添加的可溶的ACC2(1b)之间的复合物形成。使用平衡缓冲液洗掉任何过量的ACC2(1b)后，加入含有适当浓度的咪唑的洗脱缓冲液，并收集ACC2-ACC2(1b)产物，并用于测试化合物。可以确立转化的细胞系，以表达生理上有关的水平的ACC2和ACC2(1b)。
实施例9筛选通过ACC2-ACC2(1b)复合物抑制丙二酸单酰辅酶A生产的化合物使用在催化过程中形成的生成的无机磷酸盐的孔雀绿检测，或通过直接测量14CO2向酸稳定的14C-丙二酸单酰辅酶A中的整合，可以监控无细胞的测定中ACC2-ACC2(1b)复合物的抑制。通过监控来自处理的相对于对照细胞的细胞裂解物中的丙二酸单酰辅酶A浓度，确定化合物在表达重组人ACC2-ACC2(1b)复合物的完整细胞中的作用。使用适于中间通量筛选的基于HPLC的规程，检测丙二酸单酰辅酶A浓度。
实施例10ACC2基因的多态性的研究从14位欧洲来源的美国个体，得到肝脏RNA，并使用对ACC2(7336-7355)特异性的引物，从每个样品制备ACC2 cDNA。为了得到最常见的ACC2序列，从单个cDNA，制备了11种重叠PCR产物。用M13F序列标记正向引物，并用M13R序列标记反向引物。还从来自5位无亲属关系的欧洲人的基因组DNA和来自60位无亲属关系的欧洲人的DNA库，扩增了外显子1、36、41和51。通过使用M13F和M13R引物的染料-终止子(dye-terminator)测序，在两个方向对单个PCR产物测序。用polyphred/phrap/consed包进行装配和质量调用(calling)后，分析序列痕迹的多态性。使用Seqman来比对与SEQ.ID 2公开的序列的共有序列。为了鉴别ACC2的最常见的单倍型，还从来自无亲属关系的欧洲人的28个类淋巴母细胞细胞系中的基因组DNA，对外显子11、42和45测序。
表1在SEQ ID No.2上的指定位置的变体

在ACC2的编码序列(SEQ ID No.2)中，观察到11种多态性。除了这些多态性以外，在位置4506存在db SNP rs2241220，C-T。所有肝脏序列都是纯合的C，而SEQ.ID No.2在该位置具有T。另外，SEQ.ID No.2在位置525和1791具有更低频率的等位基因。但是，这3个位置不会影响氨基酸序列。我们还已经鉴别出在具有约50％等位基因频率的3’UTR的第9个碱基处的A-G多态性(rs2075262)，和在等位基因频率为7％的内含子10(rs7978168)和等位基因频率为20％的内含子41(rs2075259)中的SNP。
表23种共有的改变氨基酸的SNP的单倍型分析指示着5种单倍型

Seq.ID 2所示的序列代表着最常见的单倍型1。
14位个体会产生检测10％频率的等位基因的95％概率。不太可能存在影响估计哪个序列是最常见的序列的其它SNP。单倍型分析证实了5种不同的蛋白序列，其中3种序列可能是群体内共有的。单倍型1是最常见的，但是仅仅代表着50％染色体。氨基酸取代是保守的。
序列表SEQ ID NO1人ACC2b多肽，2256个氨基酸，独特的N-末端序列标有下划线。
MSPAKCKICFPDREVKPSMSGLHLVKRGREHKKLDLHRDFTVASPAEFVTRFGGDRVIEKVLIANNGIAAVKCMRSIRRWAYEMFRNERAIRFVVMVTPEDLKANAEYIKMADHYVPVPGGPNNNNYANVELIVDIAKRIPVQAVWAGWGHASENPKLPELLCKNGVAFLGPPSEAMWALGDKIASTVVAQTLQVPTLPWSGSGLTVEWTEDDLQQGKRISVPEDVYDKGCVKDVDEGLEAAERIGFPLMIKASEGGGGKGIRKAESAEDFPILFRQVQSEIPGSPIFLMKLAQHARHLEVQILADQYGNAVSLFGRDCSIQRRHQKIVEEAPATIAPLAIFEFMEQCAIRLAKTVGYVSAGTVEYLYSQDGSFHFLELNPRLQVEHPCTEMIADVNLPAAQLQIAMGVPLHRLKDIRLLYGESPWGVTPISFETPSNPPLARGHVIAARITSENPDEGFKPSSGTVQELNFRSSKNVWGYFSVAATGGLHEFADSQFGHCFSWGENREEAISNMVVALKELSIRGDFRTTVEYLINLLETESFQNNDIDTGWLDYLIAEKVQAEKPDIMLGVVCGALNVADAMFRTCMTDFLHSLERGQVLPADSLLNLVDVELIYGGVKYILKVARQSLTMFVLIMNGCHIEIDAHRLNDGGLLLSYNGNSYTTYMKEEVDSYRITIGNKTCVFEKENDPTVLRSPSAGKLTQYTVEDGGHVEAGSSYAEMEVMKMIMTLNVQERGRVKYIKRPGAVLEAGCVVARLELDDPSKVHPAEPFTGELPAQQTLPILGEKLHQVFHSVLENLTNVMSGFCLPEPVFSIKLKEWVQKLMMTLRHPSLPLLELQEIMTSVAGRIPAPVEKSVRRVMAQYASNITSVLCQFPSQQIATILDCHAATLQRKADREVFFINTQSIVQLVQRYRSGIRGYMKTVVLDLLRRYLRVEHHFQQAHYDKCVINLREQFKPDMSQVLDCIFSHAQVAKKNQLVIMLIDELCGPDPSLSDELISILNELTQLSKSEHCKVALRARQILIASHLPSYELRHNQVESIFLSAIDMYGHQFCPENLKKLILSETTIFDVLPTFFYHANKVVCMASLEVYVRRGYIAYELNSLQHRQLPDGTCVVEFQFMLPSSHPNRMTVPISITNPDLLRHSTELFMDSGFSPLCQRMGAMVAFRRFEDFTRNFDEVISCFANVPKDTPLFSEARTSLYSEDDCKSLREEPIHILNVSIQCADHLEDEALVPILRTFVQSKKNILVDYGLRRITFLIAQEKEFPKFFTFRARDEFAEDRIYRHLEPALAFQLELNRMRNFDLTAVPCANHKMHLYLGAAKVKEGVEVTDHRFFIRAIIRHSDLITKEASFEYLQNEGERLLLEAMDELEVAFNNTSVRTDCNHIFLNFVPTVIMDPFKIEESVRYMVMRYGSRLWKLRVLQAEVKINIRQTTTGSAVPIRLFITNESGYYLDISLYKEVTDSRSGNIMFHSFGNKQGPQHGMLINTPYVTKDLLQAKRFQAQTLGTTYIYDFPEMFRQALFKLWGSPDKYPKDILTYTELVLDSQGQLVEMNRLPGGNEVGMVAFKMRFKTQEYPEGRDVIVIGNDITFRIGSFGPGEDLLYLRASEMARAEGIPKIYVAANSGARIGMAEEIKHMFHVAWVDPEDPHKGFKYLYLTPQDYTRISSL
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GAGAAGGTGCTTATTGCCAACAACGGGATTGCCGCCGTGAAGTGCATGCGCTCCATCCGCAGGTGGGCCTATGAGATGTTCCGCAACGAGCGGGCCATCCGGTTTGTTGTGATGGTGACCCCCGAGGACCTTAAGGCCAACGCAGAGTACATCAAGATGGCGGATCATTACGTCCCCGTCCCAGGAGGGCCCAATAACAACAACTATGCCAACGTGGAGCTGATTGTGGACATTGCCAAGAGAATCCCCGTGCAGGCGGTGTGGGCTGGCTGGGGCCATGCTTCAGAAAACCCTAAACTTCCGGAGCTGCTGTGCAAGAATGGAGTTGCTTTCTTAGGCCCTCCCAGTGAGGCCATGTGGGCCTTAGGAGATAAGATCGCCTCCACCGTTGTCGCCCAGACGCTACAGGTCCCAACCCTGCCCTGGAGTGGAAGCGGCCTGACAGTGGAGTGGACAGAAGATGATCTGCAGCAGGGAAAAAGAATCAGTGTCCCAGAAGATGTTTATGACAAGGGTTGCGTGAAAGACGTAGATGAGGGCTTGGAGGCAGCAGAAAGAATTGGTTTTCCATTGATGATCAAAGCTTCTGAAGGTGGCGGAGGGAAGGGAATCCGGAAGGCTGAGAGTGCGGAGGACTTCCCGATCCTTTTCAGACAAGTACAGAGTGAGATCCCAGGCTCGCCCATCTTTCTCATGAAGCTGGCCCAGCACGCCCGTCACCTGGAAGTTCAGATCCTCGCTGACCAGTATGGGAATGCTGTGTCTCTGTTTGGTCGCGACTGCTCCATCCAGCGGCGGCATCAGAAGATCGTTGAGGAAGCACCGGCCACCATCGCCCCGCTGGCCATATTCGAGTTCATGGAGCAGTGTGCCATCCGCCTGGCCAAGACCGTGGGCTATGTGAGTGCAGGGACAGTGGAATACCTCTATAGTCAGGATGGCAGCTTCCACTTCTTGGAGCTGAATCCTCGCTTGCAGGTGGAACATCCCTGCACAGAAATGATTGCTGATGTTAATCTGCCGGCCGCCCAGCTACAGATCGCCATGGGCGTGCCACTGCACCGGCTGAAGGATATCCGGCTTCTGTATGGAGAGTCACCATGGGGAGTGACTCCCATTTCTTTTGAAACCCCCTCAAACCCTCCCCTCGCCCGAGGCCACGTCATTGCCGCCAGAATCACCAGCGAAAACCCAGACGAGGGTTTTAAGCCGAGCTCCGGGACTGTCCAGGAACTGAATTTCCGGAGCAGCAAGAACGTGTGGGGTTACTTCAGCGTGGCCGCTACTGGAGGCCTGCACGAGTTTGCGGATTCCCAATTTGGGCACTGCTTCTCCTGGGGAGAGAACCGGGAAGAGGCCATTTCGAACATGGTGGTGGCTTTGAAGGAACTGTCCATCCGAGGCGACTTTAGGACTACCGTGGAATACCTCATTAACCTCCTGGAGACCGAGAGCTTCCAGAACAACGACATCGACACCGGGTGGTTGGACTACCTCATTGCTGAGAAAGTGCAGGCGGAGAAACCGGATATCATGCTTGGGGTGGTATGCGGGGCCTTGAACGTGGCCGATGCGATGTTCAGAACGTGCATGACAGATTTCTTACACTCCCTGGAAAGGGGCCAGGTCCTCCCAGCGGATTCACTACTGAACCTCGTAGATGTGGAATTAATTTACGGAGGTGTTAAGTACATTCTCAAGGTGGCCCGGCAGTCTCTGACCATGTTCGTTCTCATCATGAATGGCTGCCACATCGAGATTGATGCCCACCGGCTGAATGATGGGGGGCTCCTGCTCTCCTACAATGGG
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权利要求
1.分离的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有根据SEQ ID NO1的氨基酸序列的乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2)剪接变体，或与其具有至少85％序列同一性的变体，或与SEQ IDNO1中公开的序列不同之处仅在于同义密码子的取代的变体，该变体缺少膜结合能力。
2.根据权利要求1的分离的核酸，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO3的多肽。
3.根据权利要求2的分离的核酸，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO3公开的多肽的变体，其中所述变体与其具有至少85％序列同一性。
4.根据权利要求1或2的分离的核酸，其包含SEQ ID NO5所述的核苷酸序列。
5.质粒，其包含权利要求1至4中的任一项的核酸。
6.分离的细胞或细胞系，其包含权利要求1至4中的任一项的核酸。
7.用权利要求1至4中的任一项的核酸转化或转染的分离的细胞或细胞系。
8.根据权利要求6或7中的任一项的细胞或细胞系，其是哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞或细胞系。
9.生产包含SEQ ID NO1的氨基酸序列、与其具有至少85％序列同一性的序列、或其C-末端截短的版本的多肽的方法，所述多肽不能膜锚定，该方法包含a)在适于表达多肽的条件下，培养含有表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码ACC2剪接变体多肽、或与其具有至少85％序列同一性的多肽、或其C-末端截短的版本的核酸序列，该多肽不能膜锚定；和b)从宿主细胞培养物中回收多肽。
10.分离的多肽，其包含SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或与其具有至少85％相似性的序列，该多肽不能膜结合。
11.根据权利要求10的分离的多肽，其包含SEQ ID No1所示的氨基酸序列。
12.分离的ACC2-ACC2(1b)蛋白复合物。
13.纯化的抗体，其能选择性地结合ACC2剪接变体。
14.根据权利要求的抗体，其能选择性地结合ACC2(1b)剪接变体。
15.权利要求10或11的多肽在鉴别调节所述多肽的化合物的测定中的用途。
16.能调节ACC2剪接变体的活性或量的化合物在治疗与受损的氧化脂肪酸的能力有关的疾病或障碍中的用途。
17.如权利要求16要求保护的用途，其中与受损的氧化脂肪酸的能力有关的疾病或障碍选自肥胖症、2型糖尿病和血脂异常。
18.鉴别潜在地可用于治疗与受损的氧化脂肪酸的能力有关的疾病或障碍的化合物的方法，其包含测定化合物调节ACC2剪接变体蛋白的活性或量的能力。
19.根据权利要求18的方法，其中所述测定选自i)使用表达ACC2剪接变体的细胞系，或使用纯化的ACC2剪接变体蛋白，测量ACC2剪接变体活性；和ii)在表达ACC2剪接变体的细胞系中，测量ACC2剪接变体转录或翻译。
20.通过权利要求18或19中的任一项的方法鉴别出的化合物。
21.鉴别潜在地可用于治疗与受损的氧化脂肪酸的能力有关的疾病或障碍的化合物的方法，其包含测定化合物调节包含ACC2和ACC2剪接变体的复合物的活性或量的能力。
22.根据权利要求21的方法，其中使用分离的ACC2和ACC2(1b)剪接变体复合物，并测量所述复合物关于丙二酸单酰辅酶A生产的活性。
23.根据权利要求22的方法，其中所述方法包含测量由所述复合物形成的生成的无机磷酸盐的孔雀绿检测。
24.根据权利要求22的方法，其中所述方法包含测量14CO2向14C-丙二酸单酰辅酶A中的整合。
25.根据权利要求21的方法，其包含使用表达ACC2和ACC2(1b)剪接变体复合物的细胞系，测量ACC2和ACC2(1b)剪接变体复合物的活性。
26.根据权利要求21的方法，其包含使用表达ACC2和ACC2(1b)剪接变体复合物的细胞系，测量ACC2和ACC2(1b)剪接变体复合物的转录和/或翻译。
27.根据权利要求18-19或21-26中的任一项的方法，其中所述疾病或障碍选自肥胖症、2型糖尿病或血脂异常。
28.通过权利要求21-27中的任一项的方法鉴别出的化合物。
29.制备药物组合物的方法，其包含(i)根据权利要求18-19或21-27中的任一项的方法，鉴别可以用于治疗疾病的化合物，所述疾病例如肥胖症、2型糖尿病、血脂异常和与受损的氧化脂肪酸的能力有关的其它障碍；和(ii)将化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的赋形剂或稀释剂相混合。
30.对ACC2剪接变体核酸选择性的抑制性核酸分子或针对ACC2剪接变体蛋白的选择性抗体在生产用于治疗与受损的氧化脂肪酸的能力有关的疾病或障碍的药物中的用途。
31.对ACC2和ACC2(1b)剪接变体复合物选择性的抑制性核酸分子在生产用于治疗与受损的氧化脂肪酸的能力有关的疾病或障碍的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及分离的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2)剪接变体。还涉及由所述核酸编码的对应多肽，和鉴别潜在地可用于治疗与受损的氧化脂肪酸的能力有关的疾病或障碍的化合物的方法，其包含测定化合物调节ACC2剪接变体复合物或其复合物的活性或量的能力。
文档编号C07K16/40GK1981034SQ200580022746
公开日2007年6月13日 申请日期2005年7月6日 优先权日2004年7月7日
发明者J·克拉法姆, B·科尼利厄森, S·哈伦 申请人:阿斯利康(瑞典)有限公司