衍生自b型肝炎病毒核蛋白精氨酸密集区的抗菌胜肽的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明是关于抗菌胜肽。
【背景技术】
[0002] 因广泛使用传统抗生素而造成病原体抗药性提升，是全球所重视的问题，因此迫 切需要研发更多有效的治疗并克服抗药性问题。抗菌胜肽（Antimicrobial peptides，AMP) 是一种新的抗生素种类，具有新颖作用模式及卓越的治疗效果。一般来说，抗菌胜肽含有 10~50个氨基酸，整体带有正电并具有双极性结构（amphipathic structure)。大部份的 抗菌胜肽可直接与细菌膜键结，并藉由使细胞膜瓦解或是攻击细胞内的成分而致死。最重 要的是，抗菌胜肽对抗药性病原体是有效的，此种性质使得近几十年作为新型抗生素的抗 菌胜肽被大量研究。
[0003] 先前未有文献报导衍生自B型肝炎病毒核蛋白（hepatitis B virus core protein，HBc)的胜肽拥有抗菌活性。B型肝炎病毒核蛋白（21KDa)为病毒复制所必需，其 在N端（第1至149个氨基酸残基）包含一蛋白壳（capsid)组装区域，且在C端（第150 至183个氨基酸残基）有一个精氨酸密集区（arginine-rich domain，ARD) (Birnbaum et al. (1990) J Virol 64:3319-3330 ;Nassal M(1992) J Virol 66:4107-4116)。ARD 含有 16 个精氨酸，分成4个精氨酸密集群（ARD I、II、III、IV)，并具有键结至核苷酸的功能。当其 键结至HBV前基因体RNA或是聚阴离子时，HBc可组装为一稳定的蛋白壳。此外，ARD包含 HBc核蛋白与粒子的核输出与输入的重要讯号。我们意外地发现，表现HBcl~183的大肠 杆菌比表现HBcl~149的大肠杆菌其生长慢得多（此结果尚未发表），而这现象的原因文 献上并没有任何报告提出一个合理的解释。
【发明内容】
[0004] 本发明的一目的是关于一医药组成物，包含：
[0005] (a) -有效量的一单离胜肽，其中该单离胜肽包含B型肝炎病毒核蛋白 (hepatitis B virus core protein，HBc)的精氨酸密集駿基端区域（arginine-rich carboxy-terminal region)，并表现一抗菌活性；以及
[0006] (b) -药学上可接受的载体。
[0007] 本发明的另一目的是关于一医药组成物，包含：
[0008] (a) -有效量的一单离胜肽，该单离胜肽包含B型肝炎病毒核蛋白的一片段，该片 段包含一个以上的精氨酸密集区（ARD)，是选自由下列（i)、（ii)及（iii)所组成的群组：
[0009] (i) HBc ARD I ~IV ;
[0010] (ii)HBc ARD I ~III ;
[0011] (iii)HBc ARD II ~IV ;
[0012] 其中该单离胜肽具有一抗菌活性；以及
[0013] (b) -药学上可接受的载体。
[0014] 本发明另一目的是关于一种医药组成物包含一有效量的一单离胜肽，该单离胜肽 包含一衍生自B型肝炎病毒核蛋白的C端区域的精氨酸密集序列，其中该单离胜肽的特征 在于具有一抗菌活性。
[0015] 本发明又一目的是关于一种如前所述的医药组成物用于杀死及/或抑制一微生 物的生长及/或增殖的用途，是经由前述医药组成物与该微生物接触。
[0016] 本发明又一目的是关于一种如前所述的医药组成物用于杀死及/或抑制一 需要的个体内一微生物的生长及/或增殖的用途，或用于治疗受一微生物感染的一个 体。该个体可为感染金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)或克雷伯氏肺炎杆菌 (K. pneumonia)〇
[0017] 后述较佳实施方式的说明与后附的图式使得本案的目的变得显而易见，本发明的 变体与修饰可能有些许不同，但不脱离本发明所揭露新颖概念的精神与范畴。
[0018] 后附图式说明本发明一或多个实施方式，并且与说明书的说明一同用于解释本发 明原理。只要有可能，于所有图中同样的标号是关于一实施方式的相同或类似元件。
【附图说明】
[0019] 图1显示为测试抗菌能力的不同HBc ARD的氨基酸序列。下方呈现不同的磷酸化 胜肽与R替代成A的变异胜肽，是在HBcl47~183的ARD-III与ARD-IV有总共4个Arg 替代成Ala。
[0020] 图2显示HBcl47~183抗绿脓杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、大肠杆菌以及金黄色葡 萄球菌的杀伤动力学。细菌以HBcl47~183 (lx MBC)处理。于指定的时间点（每隔20分 钟）量测细菌的存活率。样本以三重复方式量测。
[0021] 图3显示FITC-HBcl47~183胜肽于细菌上的位置。将近IO7CFU的绿脓杆菌 TCC9027、ATCC27853 (A 及 B)、克雷伯氏肺炎杆菌 ATCC13884 (C)、大肠杆菌 ATCC25922 (D)、 以及金黄色葡萄球菌 ATCC19636、ATCC25923 与 ATCC 29213 (E、F 与 G)与 HBcl47-183 (0? 5x MBC) -起培养1小时。细菌经清洗、固定并以DAPI染色（蓝色）。影像以共焦显微镜拍摄。
[0022] 图4显示HBc 147~183可能的杀菌机制。㈧绿脓杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、大肠 杆菌以及金黄色葡萄球菌经由HBcl47~183的SYTOX Green染剂摄入。每分钟记录以荧 光测量的数据。（B)绿脓杆菌经由0. 5、1与2 y M的HBcl47~183与HBcl53~176的细胞 膜穿透化剂量依赖曲线。2iiM的蜜蜂毒素迷力挺（melittin)作为正控制组。样本以三重 复方式测量。（C)HBcl47~183的DNA键结活性。HBcl47~183与pSUPER质体DNA以指 定的N/P比（0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1、2及3)混合30分钟。DNA的流动性以凝胶阻滞实验评 估。
[0023] 图5显示LPS与LPS抗体于HBcl47~183的杀菌活性的剂量反应作用。绿脓杆菌 及大肠杆菌来源的LPS及LPS抗体与绿脓杆菌及HBcl47~183 (lx MBC)混合3小时。细 菌置于MH琼脂上以测量存活率。样本以三重复方式测量。
[0024] 图6显示ARD胜肽HBc 147~183在数个不同的体外键结分析中，可键结至LPS与A 月旨。每个分析中，样本以三重复方式量测。（A)草图显示胜肽LPS与胜肽A脂键结的体外分 析，以及LPS/A脂的竞争分析。（B)恒定量的LPS与卵白素偶联微球上渐增浓度的生物素化 ARD HBc 147 ~183 胜肽（0、0.004、0.02、0. 1、0.5 与 2.5yM) -起培养。以 LAL ELISA 分析 量测悬浮液中未键结的LPS。将EU值以一不含胜肽的控制组标准化。HBcl47~1838p (含 有8个磷酸化的氨基酸）亦作为一控制组胜肽，因其与LPS的键结微弱。（C)微珠键结的 LPS经由胰蛋白酶琼脂糖消化隔夜而释放至悬浮液中。以LAL ELISA分析悬浮液中自由的 LPS。悬浮液中被释放的LPS的量是与微珠上ARD胜肽HBcl47~183的量成比例。（D)恒 定量的A脂分别与增加浓度的HBcl47~183以及HBcl47~1838P培养。以LAL ELISA试 剂检测悬浮液。这里的结果与先前发现一致，是A脂可直接键结至HBcl47~183。（E)LPS/ A脂竞争分析。恒定量的LPS (I y g)涂布于ELISA盘上的每一孔，然后与一含有IOnM恒定 量的HBcl47-183与增加浓度的A脂的反应混合物培养。A脂的增加以剂量依赖的方式降低 盘上键结ARD胜肽HBc 147~183的量。
[0025] 图7显示ARD胜肽HBcl47~183的细胞毒性分析。（A)以10 %人类红血球细胞 (RBC)测量HBcl47~183与迷力挺的溶血活性。与迷力挺相较，未显示HBcl47~183具有 溶血活性。（B)Huh7、IfepG2、Vero以及HEK293细胞与不同浓度（0至100 y M)的HBcl47~ 183与迷力挺于37°C培养1小时。对细胞存活率的影响以MTT分析测定。迷力挺用于作为 一正控制组。未检测到HBcl47~183对于细胞存活率的影响，而迷力挺则显示强烈的细胞 毒性。（C)肾脏细胞Vero与HEK293以CFSE染色并于第0天植入。第1天时细胞以不同浓 度（0至100 yM)的HBcl47~183培养1小时。以流式细胞仪评估第1天及第3天的细胞 增殖。与空的控制组（mock control)实验相似，在Vero与HEK293细胞上未有显著作用。 于第7A~C图的样本是以三重复的方式分析。（D)利用3周大ICR公小鼠评估ARD胜肽 HBcl47~183的体内细胞毒性。小鼠腹膜内注射胜肽（10与20mg/体重kg)。所有的小鼠 于7天后仍存活。
[0026] 图8显示体内ARD胜肽HBcl47~183抗金黄色葡萄球菌的保护活性试验。（A) 3 周大ICR公小鼠接受致命浓度的金黄色葡萄球菌ATCC 19636，然后分为5组不同的时间点。 于每一时间点（n = 5)收集、稀释血液样本，并将其覆于BHI琼脂上。第二天计算细菌的 数目。观察到接种后2小时血液中有最大细菌量。数据以平均值土标准偏差（SD)表示。 (B)如前所述以致命浓度的金黄色葡萄球菌培养的ICR小鼠，分别在接种后1、1. 5或2小 时以腹膜内注射ARD胜肽（10mg/kg)治疗。每组包含10只小鼠。以PBS治疗的控制组小 鼠全数（100% )于第一天死亡，而以ARD胜肽于接种后1、1. 5或2小时治疗的小鼠，7天后 存活率分别为100%、70%与40%。（C)如前所述，ICR小鼠腹膜内接种金黄色葡萄球菌，随 即腹膜内注射PBS(n = 5)或于接种后1小时腹膜内注射10mg/kg ARD胜肽（n = 5)。接 种后4小时，收集血液、肝脏及脾脏。肝脏及脾脏样本经均质化、稀释，并与血液样本一同覆 于BHI琼脂上。于隔日计算细菌量。与用PBS治疗的小鼠相较，ARD胜肽的治疗能有效降 低血液、肝脏及脾脏中的细菌量。（D)以PBS治疗（空心的圆形、菱形与正方形）与ARD胜 肽HBcl47~183治疗（实心的圆形、菱形与正方形）的小鼠血液、肝脏及胰脏样本细菌量 的量化比较。图中的线表示细菌量的平均值。**表示于PBS与ARD胜肽HBcl47~183治 疗结果的间的 P〈0. 01 (Mann-Whitney U test) 〇
[0027] 图9显示ARD胜肽抗克雷伯氏肺炎杆菌的体内抗菌活性的IVIS分析。（A)感染 克雷伯氏肺炎杆菌的小鼠，在接种后1小时以PBS(n = 5)或10mg/kg ARD胜肽（n = 5)治 疗。接种后4小时，麻醉小鼠并摄影。细菌量显示于生物冷光迭加的摄影影像中。假色影 像（False color imaging)将强冷光处以红色表示，中度冷光处以绿色表示，低冷光处以蓝 色与紫色表示。（B)总光通量以IVIS影像软件量化。**表示于PBS与ARD胜肽HBcl47~ 183 治疗结果的间的 P〈0.0 l (Mann-Whitney U test) 〇
[0028] 图10为一显示HBCARD胜肽的抗菌活性表。
[0029] 图11为一显示ARD胜肽HBcl47~183对于对黏菌素具有抗药性与敏感性的绿脓 杆菌与鲍氏不动杆菌的抗菌活性的表。
[0030] 图12显示人类B型肝炎病毒（HBV)核蛋白（HBc)的精氨酸密集区（ARD)的序列 组合。HBcARD区域从目前不同地域的病患中分离出来的不同血清型中，是为高度保守。
[0031] 图13A~B显示从灵长类、啮齿动物及禽类来源嗜肝病毒的HBc ARD区域的序列 组合。HBc ARD序列在人类、绒毛猴（wooly monkey)、地松鼠、土拨鼠以及蝙蝠的间是高度 保守的。在HBc ARD的精氨酸（正电荷）群集的次区域为ARD-I、ARD-II、ARD-III、以及 ARD-IV。第13B图进一步显示在鸭、苍鹭、鹦鹉、罗斯雁及雪雁的核蛋白C端也有4个群集 正电荷氨基酸。不论灵长类、啮齿动物及禽类嗜肝病毒的间的序列歧异度与演化