含有5、25与100 y M HBc 147-183的新鲜培养液中1小时（在加入ARD胜肽 至H印G2细胞的培养液中10分钟后，标记FITC的ARD胜肽大量内化）。48小时后，收集细 胞并以流式细胞仪分析（FACSCanto, BD Bioscience公司）。动物体内试验
[0114] 3周大ICR公小鼠（19至21g)购自BioLASCO公司（台湾）。于脑心浸出物培养 液（BHI broth，Difco公司）中培养隔夜的细菌，于新鲜脑心浸出物培养液继代培养至对数 增殖期（log phase)。接种物以脑心浸出物培养液稀释至所指定的密度。为准确测试ARD 胜肽的体内毒性，ICR公小鼠分别接受腹膜内接种（i. p.) 10与20mg/kg含有HBcl47-183 的PBS溶液。每组有5只小鼠。胜肽注射后，注射后7天内每天记录小鼠死亡的数量。 为测试ARD胜肽的体内抗菌活性，所有的小鼠皆以腹膜内接种含有金黄色葡萄球菌ATCC 19636(4x IO6CFUAiouse)的脑心浸出物培养液。于接种后1、1. 5以及2小时给予胜肽 HBcl47-183(10mg/kg)。于接种后1小时给予PBS(IOmVkg)作为控制组。每组有10只小 鼠。接种后7天内每天记录小鼠的死亡率。另外实验细菌含量，小鼠以腹膜内接种含有金黄 色葡萄球菌ATCC 19636(106CFU/m〇uSe)的脑心浸出物培养液。所有的小鼠在接种后1小时 给予胜肽HBc 147-183(10mg/kg)或是PBS(10mg/kg)控制组，并于接种后4小时牺牲。血 液样本（200 y 1)先与IOOmMEDTA(10 y 1)混合，再以PBS(无Ca2+及Mg2+)稀释20倍。肝 脏及脾脏样本（0.Ig)于灭菌的PBS中均质化（500 y1)。样本稀释约100倍并置于脑心浸 出物琼脂上，以记录其菌落数。
[0115] 为测试ARD胜肽在体内对于革兰氏阴性菌的抗菌活性，小鼠接种克雷伯氏肺 炎杆菌 Xen39 (107cfu/mouse) (Caliper LifeSciences 公司），是一株含有一光杆菌 (Photorhabdus luminescens)IuxABCDE操纵子修饰的基因工程菌。接种1小时后，小鼠接 受10ml/kg的PBS(n = 5)或是10mg/kg的ARD胜肽（n = 5)。接种后4小时拍摄体内影 像。先麻醉小鼠并移至活体分子影像系统（IVIS spectrum)，测量冷光1分钟以下。影像系 统测量光子的数量并转换数据为假色影像（false color image)，假色影像中将强冷光区 域以红色显示，中度冷光区域以黄色及绿色显示，微弱冷光区域以蓝色显示。生物冷光的增 加表示细菌数减少。这些影像是摄影影像与生物冷光利用计算机产生的色阶迭合而成。感 兴趣区域（ROI)的总光通量（RLU)以活体分子影像系统软件量化。
[0116] 结果
[0117] HBc胜肽的体外抗微生物活性
[0118] 如第1及10图所示，HBcl47~183表现出广泛的抗革兰氏阴性菌（绿脓杆菌、克 雷伯氏肺炎杆菌以及大肠杆菌）、革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）以及真菌（白色念珠 菌）的活性。在这些测试菌株中，绿脓杆菌与克雷伯氏肺炎杆菌对此胜肽最为敏感。对于 绿脓杆菌与克雷伯氏肺炎杆菌来说，ffficl47-183的MBCs低于4 y M，而大肠杆菌与金黄色葡 萄球菌的MBCs约为4 y M。白色念珠菌是对此胜肽最不敏感的（MBCs约为8 y M)。
[0119] 为进一步指出具有抗菌活性的序列，合成不同长度的胜肽（第1图）并如前述方 法测试。胜肽HBc 147-175,于C端删除最后8个氨基酸，尽管它丧失了抗金黄色葡萄球菌 与白色念珠菌的活性，但仍维持强烈的抗革兰氏阴性菌活性。胜肽ARD I~II(HBcl47~ 159)或ARD III~IV(HBcl64~176与HBcl62~175)未具有抗所有测试的细菌与真菌 的活性。相对地，所有含有ARD II~IV(HBcl53~176、HBcl57~176、HBcl53~175、 HBcl55~175及HBcl57~175)以及ARD I~III (HBcl47~167)的胜肽显示分别具有抗 绿脓杆菌与克雷伯氏肺炎杆菌的强烈活性，虽然它们抗大肠杆菌的活性微弱（第10图）。 因此，胜肽ARD II~IV与ARD I~III是必要的且能有效抗绿脓杆菌与克雷伯氏肺炎杆 菌。
[0120] ARD胜肽的正电荷对于杀菌活性是具有关键性
[0121] 丝氨酸残基S155、S162、S170、S176及S181的磷酸化研究显示丝氨酸磷酸化通常 会使抗菌活性减弱。我们发现所有的HBc胜肽一旦磷酸化就会丧失对白色念珠菌的抗菌活 性（第11图）。对细菌来说，在S181磷酸化未有任何作用，但在S155、S162、S170、&S176 磷酸化会减弱其抗菌能力。HBcl55p及HBcl76p的MBCs降至8 y M，HBcl62p及HBcl70p则 降至32yM。当S155、S162及S170同时磷酸化（HBcl55pl62pl70p)时，抗菌活性则完全丧 失（>32iiM)。此结果显示，除了S181的外，丝氨酸磷酸化通常不利于HBc ARD的抗菌活性。 为确认精氨酸残基对于杀菌活性的重要性，我们合成并测试胜肽HBcl47-183-III-IV AA， 是于每个ARD III与ARD IV具有二个R替换成A的变异。与磷酸化HBc ARD胜肽相似，与 HBcl47-183相较，HBcl47-183-III-IV AA的MBC显著地提升，这个结果指出精氨酸残基对 于抗菌活性是必要的。抗药性
[0122] 测试HBcl47_183对于对黏菌素有抗药性的绿脓杆菌与鲍氏不动杆菌的抗菌活 性。如第11图所示，HBcl47~183于4 y M可杀死对黏菌素敏感的绿脓杆菌，而对黏菌素有 抗药性的绿脓杆菌对HBcl47~183有交叉抗性（MBC>16 yM)。与绿脓杆菌相反，HBcl47~ 183对于抗黏菌素敏感绿脓杆菌与抗对黏菌素有抗药性的鲍氏不动杆菌的MBCs有着在 0? 5~I y M的相似范围。这个结果显示，我们的ARD胜肽HBc 147~183对黏菌素有抗药性 的鲍氏不动杆菌未有交叉抗性。
[0123] 杀伤动力学
[0124] 依时间的细菌存活率在试验菌株（绿脓杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、大肠杆菌以及 金黄色葡萄球菌）以依据MBC浓度的HBcl47~183处理的后评估（第2图）。这个结果显 示绿脓杆菌在添加HBcl47-183 (2 y M) 20分钟内即被杀死。虽然克雷伯氏肺炎杆菌及大肠 杆菌属于革兰氏阴性菌，其于180分钟内被4 y M的HBc 147~183杀死。而金黄色葡萄球 菌，可发现其于120分钟内被4yM HBcl47~183杀死。
[0125] HBc 147~183的定位与机制
[0126] 绿脓杆菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌以FITC标记的HBc 147~183依据0. 5x MBC处理，HBcl47~183的位置利用共焦荧光显微镜观察（第3图）。在胜肽治疗下，绿脓 杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌与大肠杆菌以荧光显示为空的杆状物，清楚定义细菌的表面，表示 HBcl47~183累积在细胞膜上（第3A~D图）。为更了解HBc胜肽对细胞膜的作用，做 SYTOX Green摄入分析。绿脓杆菌在添加2 y M HBcl47~183的情况下，引起细胞膜显著的 穿透化（第4A图）。虽然4 y M的HBcl47~183也会累积在克雷伯氏肺炎杆菌与大肠杆菌 的细胞膜上，但其未能造成金黄色葡萄球菌的细胞膜穿透化。如同HBcl47~183对于绿脓 杆菌的杀菌能力，HBcl53~176在10分钟内以剂量依赖的方式造成相同的细胞膜穿透化 (第4B图）。这结果表示HBc胜肽对绿脓杆菌的杀菌作用是直接经由一个与杀伤动力学相 似的快速动力的细胞膜透化（第2图）。另一方面，发现HBcl47~183穿过金黄色葡萄球 菌的细胞膜，并位于细胞质中（第3E~G图）。为研究HBc 147~183与DNA潜在的交互 作用，将HBcl47~183与pSUPER质体DNA以不同的N/P比（如材料与方法中所述）混合， 并以胶体电泳分析（第4C图）。结果显示当胜肽/DNA比例升高时DNA的流动性降低，且在 比例为1时质体DNA完全滞留，表示HBcl47~183对质体DNA有强烈的键结活性。总体来 说，HBcl47~183于革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的杀菌机制可能完全不一样。
[0127] HBc 147~183直接键结至LPS
[0128] 为评估革兰氏阴性菌的LPS是否可作为一有潜力的HBcl47~183标靶，将绿脓杆 菌或大肠杆菌（Sigma公司）的LPS (0. 05至50 y g/ml)分别与绿脓杆菌及2 y M HBcl47_183 培养3小时。结果显示，HBcl47~183的杀菌能力因为添加50 y g/ml的其中一种LPS而 显著降低（第5图）。此外，HBcl47~183优先键结至绿脓杆菌的LPS，而不是大肠杆菌的 LPS。然而，添加抗LPS多株抗体（Genetex Co.公司）不能有效中和HBcl47~183的杀菌 活性（第5图）。这表示HBc 147~183不只与LPS键结，也与细胞膜上其他标靶分子键结。 或者，HBcl47~183与这里使用的抗LPS多株抗体可主要键结至LPS上2个不同的抗原决 定位。
[0129] 如第6A图所示，利用不同的键结分析研究体外HBc 147~183与LPS(或A脂基； Lipid A moiety)的间潜在的交互作用。第6B图中，当HBcl47~183键结至卵白素偶联的 Dynabeads的量上升，并维持培养基中LPS的量时，渐增的LPS量来自悬浮液中减少的量。 HBcl47~1838p是具有8个ser/thr磷酸化，用于作为控制组胜肽。相似的结果以另一个 LPS 测试方法得到：Endosafe_PTS Cartridges (Charles River Laboratories 公司）。在 第6C图，经由ARD胜肽HBcl47~183的胰蛋白酶琼脂糖消化法自微珠分离微珠所捕捉的 LPS。释放的LPS量以LAL测试测量（如材料与方法所述）。LPS主要含有多醣及A脂基。 为评估ARD胜肽是否可直接键结至A脂基，我们在第6D图中经由与第6B图相似的方法，测 试A脂基与ARD胜肽的间的键结。如所预期的，微珠上的HBcl47-183增加导致留存在悬浮 液中的A脂数量减少。这个微球上ARD胜肽与悬浮液中A脂的间的负相关性（第6D图）明 显地与先前在微球上ARD胜肽HBcl47~183与LPS的间所发现的相似（第6B图）。为直 接表示ARD胜肽可键结至LPS的A脂基，我们做了一个A脂与LPS的竞争实验（第6E图）。 涂布LPS的ELISA培养盘内培养定量的HBcl47-183(10nM)，该HBcl47~183已预先与不 同浓度的大肠杆菌A脂（0至IOy g/ml)混合。在大范围的冲洗后，与培养盘结合的（即与 LPS结合）生物素化胜肽HBc 147~183以卵白素偶联HRP检测，接着加入TMB受质与显色 剂。HBcl47-183键结至LPS经由增加A脂的浓度而显著降低（第6E图）。此结果支持LPS 的A脂基可作为ARD胜肽HBc 147~183的直接标靶。
[0130] 细胞毒性
[0131] 为评估HBc胜肽的细胞毒性，我们测量HBcl47~183的溶血活性。与迷力挺控制 组相较，在培养1小时后未检测出HBcl47~183有溶血性（第7A图）。此外，利用MTT分 析评估HBc 147~183对于人类肝癌细胞（Huh 7细胞与HepG2细胞）以及肾脏细胞（Vero 细胞与J1EK293细胞）的细胞毒性。以低剂量（3. 125 yM)迷力挺处理的细胞的存活率显著 降低。相反地，HBcl47~183对于人类肝癌细胞（Huh 7细胞与H印G2细胞）以及肾脏细胞 (Vero细胞与HEK293细胞），只有在100 y M的剂量时具有低程度的细胞毒性（第7B图）。 做CFSE细胞增殖分析以评估HBcl47-183于Vero与HEK293肾脏细胞增殖的影响。与第1 日相较，以HBcl47-183(5、25与100 yM)处理过细胞的CFSE强度降低至与第3日空控制组 (mock control)相同（第7C图），显示ARD胜肽HBcl47~183对于细胞增殖未有显著影 响。