用于诱导多能干细胞的融合蛋白及其使用方法
【专利摘要】本发明涉及一种融合蛋白及其在将体细胞重编程为诱导多能干细胞中的用途。具体而言，本发明含有细胞全能性相关的基因编码的蛋白和哺乳动物YAP蛋白的转录激活结构域或其具有转录调控活性的片段的融合蛋白、其编码核苷酸序列、表达载体及组合物。本发明还涉及使用本发明的融合蛋白诱导多能干细胞的方法。
【专利说明】用于诱导多能干细胞的融合蛋白及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及多能干细胞领域。具体而言，本发明涉及用于将体细胞重编程为多能干细胞的人工转录因子及其在体细胞重编程中的用途，本发明还涉及将体细胞重编程为诱导多能干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]胚胎干细胞是来源于受精卵发育早期胚胎内细胞团或着床后胚原始生殖细胞的一类未分化的全能性细胞，具有无限增殖和全向分化能力，可分化成人体几乎所有组织类型的细胞。因此其在动物克隆、发育生物学基础研究，尤其是人类再生医学临床应用等方面具有十分诱人的广阔前景。但是将胚胎干细胞真正应用到临床上人面临着众多障碍，特别是人类胚胎干细胞尤其是病人特异的干细胞的来源及相关的伦理问题成为了困扰科学界的一大难题。因此，能够使用来源丰富的体细胞，通过重编程的方法，使终末分化的细胞重新获得类似于胚胎干细胞的多能性细胞成为了众多研究者的追求和奋斗目标。
[0003]到目前为止，主要有三项技术能够使体细胞发生重编程进而获得干细胞:核移植重编程技术(SCNT)、细胞融合重编程技术以及诱导多能干细胞重编程技术(iPS)。1952年，核移植首先在两栖类中获得成功(Briggs and King, 1952)，至1997年克隆羊Dolly的诞生(Wilmut et al.，1997)，体细胞克隆技术迅速发展并逐渐成熟。到目前为止，体细胞克隆已在大鼠、猪、牛、猴、狗等二十余种物种上取得了成功。通过核移植技术而产生的干细胞能够避免细胞移植治疗后的免疫排斥不良反应。
[0004]但是该技术距离真正的临床应用也还是有很多问题存在的，首先核移植效率极低；其次，实验证明体细胞克隆动物经常存在发育异常的现象；以及最终运用到人类疾病治疗上所涉及到的人类卵子来源和人类胚胎使用的伦理争议等一系列问题都成为了该技术发展的瓶颈问题。同样，细胞融合重编程技术也面临着重编程效率极低、技术要求过高等众多问题制约着其临床应用。以上两种常规的重编程方法都存在着缺陷，因此各国的科学家都在探索其他的更为可行的重编程策略。2006年日本科学家Yamanaka研究组在研究中发现将4个转录因子0ct4、Sox2、Klf4和c_Myc通过病毒感染的方式转入小鼠的成纤维细胞后就可以使成纤维细胞获得具有类似于ES细胞的多能性(Takahashi andYamanaka, 2006)。随后研究表明这种诱导性多能干细胞(induced pluripotent stemcells, iPS细胞)与胚胎干细胞十分相似，并且能够在注射至囊胚后形成嵌合鼠，尤其是2009年通过四倍体补偿技术生成的小鼠的出生证明了这种细胞的多能性。2007年11月Yamanaka和Thomso n实验室分别宣布他们使用人类皮肤细胞成功地诱导出了人类iPS细胞(Takahashi et al., 2007; Yu et al.，2007)。同年 Jaenisch 研究组使用 iPS 技术在键刀型细胞贫血症模型小鼠上进行基因治疗研究获得了初步成功。简而言之，该技术通过导入几个简单的转录因子就意想不到的可以使已分化的体细胞发生重编程并恢复多能性。这一简单可行的技术突破可以很方便的获取病人自身体细胞来源的多能性干细胞，不但轻易地解决了再生治疗的细胞来源问题，而且能够避免自身免疫排斥、规避了伦理道德的制约，为再生医学的临床应用奠定了坚实的基础。
[0005]但是，诱导多能干细胞的技术作为一项新生技术许多方面还并未完善。比如，其机理尚未研究透彻、潜在的安全性风险，诱导效率低下、诱导耗时过长等。如果这些问题不能有效地解决，就不能使该技术成功的应用到临床上。因此科研界投入了巨大的精力去解决这些问题，到目前为止也取得了相当多的进展。
[0006]首先，世界范围内的科学家从细胞生物学、分子生物学的各个方面对iPS诱导机制进行了充分的研究。例如在，科学家在单细胞水平、染色质修饰酶(chromatinmodification enzyme)和 3D 染色质调控(3D chromatin regulation)方面的文章使我们在转录调控水平、表观遗传学水平、信号转导等层面对重编程的机制有了深入的认识。尤其是北大邓宏魁的“跷跷板模型(seesaw model)”使我们对iPS机制认识更为全面。
[0007]其次，在iPS的安全性方面也进行了众多方面的改进工作。首先c-Myc从四因子中去除使致瘤性风险大为降低。再者更为安全的诱导手段，如非病毒整合载体的应用，mRNA、蛋白诱导方式，邓宏魁的小分子化合物的诱导方式使iPS在安全性方面得到了巨大的提闻。
[0008]第三，常规的iPS诱导效率只有0.01%-2%左右，因此科学家采用各种方法去提高诱导效率。如添加小分子化合物如VPA、VC可以将诱导效率提升约100倍，优化诱导因子组合，如mRNA诱导可以提升效率到5%左右。多能因子融合VP16或者MyoD的转录激活结构域可以大幅度的提升iPS诱导效率。[0009]第四，一般来讲，小鼠细胞iPS诱导用时为两周左右，人的iPS细胞用时更长。因此能够在最短的时间获得iPS对最终的临床应用也是很重要的一个因素，但目前来说诱导时间一般都在两周时间左右。
[0010]申请号为W02011110051的专利申请通过将0CT4，S0X2, NANOG分别融合疱疹病毒VP16转录激活结构域。将这三种人工转录因子和Klf4 一起感染MEF细胞，可以大幅度的提高重编程效率。但是该技术诱导的速度和效率仍未达到最理想状态。比如其内源多能基因如0ct4等的表达不够迅速。
[0011]Hirai等人将0CT4与MyoD转录激活结构域进行融合,然后将融合了 MyoD的0ct4的人工因子(M30)和原始形态的S0X2，c-Myc, Klf4三种转录因子一起感染MEF细胞，可以大幅度的提高重编程效率。GFP阳性克隆计数结果显示，该诱导多能干细胞的方法在dayl5可达到GFP阳性克隆的最高值，诱导效率可以达到约25%，但只比传统的0ct4，S0X2, c-Myc,Klf4诱导方法高10倍左右。同时该方法仍然使用了原癌基因c-Myc，没有消除安全隐患。相比较而言，本发明安全性较高，效率更高，时间上更为迅速。在未来再生医学临床应用上本方法显然更有优势。
[0012]iPS研究在过去的数年间取得了相当大的进展，使我们日益看到了其最终走向临床应用的辉煌前景。但是总体说来，该技术当前还存在诱导效率低，用时较长，安全性还有待提高等问题，阻碍了快速高效地获得高质量的临床应用级别iPS细胞。
【发明内容】
[0013]因此，本发明的目的是克服现有技术中存在的常用的各种诱导产生iPS的方法均诱导效率低下(0.01%-2%)、用时较长(10天至两周左右时间)的缺点。提供一种快速、高效、安全地诱导产生多能干细胞的方法，并且该方法为iPS的临床应用提供了基础。
[0014]一方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含细胞全能性相关的基因编码的蛋白或其片段，以及与所述细胞全能性相关的基因编码的蛋白或其片段直接连接或通过连接序列连接的转录调控结构域或其具有转录调控活性的片段。
[0015]优选地，所述连接序列为GGGGS。
[0016]优选地，所述细胞全能性相关的基因编码的蛋白或其片段通过氨基端或羧基端与转录调控结构域或其具有转录调控活性的片段连接；
[0017]优选地，所述细胞全能性相关的基因选自0CT4、S0X2、NANOG, SOXl、S0X3、S0X15、S0X18、STAT3、SMADU Sal4、Nr5a2、Daxl, Esrrb, UtfU MyoD, CEBPa、Pax5, PdxU Ngn3、MafA、Ascll、Brn2、Mytll、Gata4、Mef2c和Tbx5中的一种或多种。更优选地，所述细胞全能性相关的基因选自 0CT4、S0X2、NANOG、MyoD、CEBP a、Pax5、Pdx1、Ngn3、MafA、Asc11、Brn2、Gata4、Mef2c和Tbx5中的一种或多种。进一步优选地，所述细胞全能性相关的基因选自0CT4、S0X2和NANOG中的一种或多种，例如一种、两种或三种。
[0018]优选地，所述转录调控结构域为哺乳动物YAP蛋白的转录激活结构域(transcriptional activity domain TAD)或其具有转录调控活性的片段。更优选地,所述转录调控结构域选自小鼠、猪、羊、牛或人的YAP蛋白的转录激活结构域或其具有转录调控活性的片段。进一步优选地，所述转录调控结构域选自小鼠的YAP蛋白的转录激活结构域或其具有转录调控活性的片段，优选地，所述转录调控结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
[0019]优选地，所述融合蛋白选自以下的一种或多种:0CT4蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白，即0CT4-YAPtad(以下称为0y)、S0X2蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白，即S0X2-YAPtad(以下称为Sy)、NANOG蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白，即NANOG-YAPtad(以下称为Ny)、MyoD蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋`白、CEBPa蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白、Pax5蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白、Pdxl蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白、Ngn3蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白、MafA蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白、AsclI蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白、Brn2蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白、Gata4蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白Mef2c蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白、Tbx5蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白。
[0020]优选地，本申请的融合蛋白选自序列SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:38-48所示的氨基酸序列中的一种或多种。
[0021]另一方面，本发明提供了编码上述融合蛋白的核苷酸序列。
[0022]优选地，所述核苷酸序列选自如SEQ ID NO:USEQ ID N0:3、SEQ ID NO:5和SEQID NO:49-59所不的核苷酸序列中的一种或多种。
[0023]优选地,编码所述转录调控结构域的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。
[0024]再一方面，本发明提供了表达上述融合蛋白的载体。优选地，所述载体为逆转录病毒载体。更优选地，所述进行逆转录病毒包装的细胞为293T细胞。[0025]本发明还提供了一种组合物，所述组合物含有上述融合蛋白、核苷酸序列和/或表达载体。优选地，本发明的组合物还包括运载体和赋形剂。
[0026]优选地，所述组合物含有至少一种选自下组的融合蛋白:0CT4-YAPtad (Oy)、S0X2-YAPtad (Sy)、NANOG-YAPtad (Ny)。
[0027]优选地，所述组合物还包括Klf4蛋白、编码Klf4蛋白的核苷酸和/或表达载体。
[0028]优选地，所述Klf4蛋白的表达载体为逆转录病毒载体，更优选地，所述进行逆转录病毒包装的细胞为293T细胞。
[0029]优选地，所述Klf4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0030]优选地，所述编码Klf4蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。 [0031]在一个优选的实施方案中，本申请的组合物包括如SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:8 所示的氨基酸序列和 / 或 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
[0032]使用本发明的0CT4-YAPtad、S0X2_YAPtad、NANOG-YAPtad 并加上 KLF4 因子(以下称为OySyNyK-1PS方法)比常规的0CT4、S0X2、NAN0G，、KLF4因子组合(以下称为OSNK-1PS方法)能更加快速高效的诱导多能干细胞产生。
[0033]本发明还提供了一种将体细胞重编程为诱导的多能干细胞的方法，所述方法包括以下步骤:
[0034]I)用本发明所述的融合蛋白、核苷酸序列、表达载体或组合物处理体细胞，
[0035]2)经过培养后，筛选出具有多能干细胞理化特征的细胞，从而获得多能干细胞。
[0036]优选地,所述体细胞为人或者其他物种的任何成体细胞。优选地,所述体细胞为哺乳动物的成体细胞。进一步优选地，所述哺乳动物为人或鼠。优选地，所述成体细胞为:皮肤成纤维细胞、血液细胞和/或口腔上皮细胞。
[0037]优选地，所述处理体细胞的方法包括通过病毒感染、质粒转染、蛋白转导和/或mRNA转染将所述融合蛋白、核苷酸序列、表达载体和/或组合物导入体细胞中。在一个优选的实施方案中，所述方法为逆转录病毒感染，优选地，所述逆转录包装细胞为293T细胞。
[0038]优选地，所述病毒感染中，使用病毒感染复数(MOI)大于等于10的逆转录病毒量去感染细胞。更优选地，使用病毒感染复数(MOI)等于10的逆转录病毒量去感染细胞。
[0039]在一个本发明优选的实施方案中，所述方法的步骤I)包括以下步骤:
[0040]I)构建含有本发明所述的细胞全能性相关的基因和所述哺乳动物YAP蛋白的转录激活结构域(transcriptional activity domain TAD)或其具有转录调控活性的片段的核苷酸序列的质粒载体；优选地，还构建含有Klf4的核苷酸序列的质粒载体；优选地，所述核苷酸序列包括全长序列的0CT4，S0X2, NANOG,所述YAP蛋白的转录激活结构域为小鼠YAP蛋白的转录激活结构域(transcriptional activity domain TAD);优选地,所述质粒为逆转录病毒PMXs载体；优选地，所述pMXs载体的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；
[0041]2)将上述质粒分别转染进入293T细胞进行逆转录病毒的包装，转染后48小时之后，收集病毒上清液，过滤后，将病毒混合，加入聚凝胺(polybrene)，感染成体细胞，启动细胞重编程；
[0042]优选地，所述过滤使用0.45 μ m PVDF滤器。
[0043]优选地，所述病毒以1:1:1:1的比例混合。[0044]优选地，所述加入聚凝胺后的终浓度为8μ g/μ I。
[0045]在本申请的一个具体实施例中，使用的体细胞为0G2-MEF，转染24小时后，将病毒液从0G2-MEF细胞移去当做O小时算起，最快可在20小时看到0ct4_GFP的表达，提示此时内源0ct4基因已经起始表达，，重编程已经快速启动。细胞计数的结果显示细胞的增殖速度并没有发生有差异的改变，RT-PCR的结果显示p53的表达水平亦未有大幅度的变化。约在第四天就可以看到iPS克隆开始出现，约在第6-7天就可以挑去形态较好的单克隆进行建系培养。
[0046]本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明的融合蛋白、核苷酸序列、表达载体和/或组合物。
[0047]本发明还提供了本发明的融合蛋白、核苷酸序列、表达载体和/或组合物在制备用于将体细胞重编程为诱导干细胞的试剂中的用途。
[0048]本发明还提供了本发明的融合蛋白、核苷酸序列、表达载体和/或组合物在再生医学研究和临床治疗领域的用途。
[0049]本发明的方法和传统的0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc (下文中简称为0SMK)相比，由于去除了 c-Myc的使用，安全性得到了提高。和常规的0ct4、Sox2、Nanog、Klf4(下文中简称为0SNK)诱导方法相比，其诱导速度极大的加快，诱导效率得到了极大的提高。GFP荧光克隆计数结果显示，在第7天，OSNK基本上没有克隆形成，而利用0CT4-YAPTAD (Oy)，S0X2-YAPTAD(Sy)，NANOG-YAPTAD(Ny)和Klf4(即本申请的OySyNyK法)融合蛋白组合进行iPS诱导，可约形成2500个荧光克隆。 流式细胞仪分析结果显示在第7天约有40%的细胞是0ct4-GFP阳性表达的细胞。
[0050]对iPS诱导过程中不同时间点样品进行实时PCR分析的结果也显示，内源多能相关基因，如0ct4、Sox2、Nanog、Daxl> Eras等，OySyNyK方法相对于常规OSNK诱导能够快速高水平的进行诱导表达。采用亚硫酸盐对0ct4、Nanog的启动子区域进行胞嘧啶甲基化状态的分析也显示相对于常规OSNK诱导方法，OySyNyK方法能够在短至1_2天的时间内使0ct4、Nanog的启动子区发生快速的去甲基化，使其从表达抑制状态进入到高水平的活性表达状态。建系传代后的iPS细胞系和0ct4、Sox2、Nanog、Klf4常规方法诱导建系成功的iPS细胞系一样，多能相关基因高表达，外源基因沉默，AP染色呈阳性，可以诱导产生EB，并且囊胚注射后可以生成嵌合鼠，并且可以进行种系传递，证明了其虽然是快速诱导成功的，但是一样具有良好的全能性。
[0051]本发明的有益效果体现在两个方面:相比较于常规低效耗时的多能干细胞诱导方法，本发明能在6-7天内以极高的效率形成高质量的iPS克隆。后续鉴定表明该方法产生的iPS细胞在基因表达、增殖速度和发育多潜能性等各方面指标都和胚胎干细胞极为相似，并能成功的进行种系传递。因此，可以预期，本方法应用于人类再生医学临床实践当中，能够快速高效的诱导患者特异的自体多能干细胞，可以极大地节省治疗时间和提高治疗成功率，为实现再生医学在临床上的广泛应用奠定了一定的基础。本发明能够高效快速的诱导多能干细胞的产生，可以为iPS机理的研究提供巨大的便利，可以发掘出原来被低iPS诱导效率掩盖的有用信息。
[0052]本发明主要应用于以成体细胞诱导生成多能干细胞，并用于再生医学研究和临床治疗等领域。[0053]相比较于常规低效耗时的多能干细胞诱导方法，本发明能在6-7天内以极高的效率形成高质量的iPS克隆。后续鉴定表明该方法产生的iPS细胞在基因表达、增殖速度和发育多潜能性等各方面指标都和胚胎干细胞极为相似，并能成功的进行种系传递。因此，可以预期，本方法应用于人类再生医学临床实践当中，能够快速高效的诱导患者特异的自体多能干细胞，可以极大地节省治疗时间和提高治疗成功率，为实现再生医学在临床上的广泛应用奠定了一定的基础。
【专利附图】
【附图说明】 [0054]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
[0055]图1 为本申请的 0ct4-YAPTAD、S0X2_YAPtad、NANOG-YAPtad 载体构建示意图；
[0056]图2为本申请的OySyNyK法诱导多能干细胞形成时间示意图；
[0057]图3为使用GFP阳性克隆计数的结果，OySyNyK方法诱导iPS效率和OSNK方法诱导iPS效率的对比。其中，OSNK方法在第12天进行计数，而OySyNyk方法在第7天进行iPS的计数；
[0058]图4为使用流式细胞仪分析GFP阳性细胞比例。结果显示，OySyNyK诱导方法比OSNK诱导方法迅速且高效；
[0059]图5为GFP荧光照片，用于比较传统OSNK方法iPS诱导和本发明OySyNyK方法iPS诱导不同的速度和效率；
[0060]图6为碱性磷酸酶染色(NAP)结果，该结果显示在第7天，OySyNyK方法iPS诱导效率极高，而OSNK方法诱导产生极少的iPS克隆；
[0061]图7为OySyNyK方法诱导形成的克隆,建系传代后形态和mES形态相似,且能够长期传代维持较好的状态。A图为建系后第1次传代iPS克隆形态。B图为建系后传代10次以后iPS克隆形态。
[0062]图8为诱导多能干细胞的mRNA水平表达鉴定，如图所示，OySyNyK方法比OSNK方法能够更迅速和更强的诱导内源多能因子0CT4、S0X2、NANOG的表达；
[0063]图9为诱导多能干细胞的mRNA水平表达鉴定，如图所示，OySyNyK方法比OSNK方法能够更迅速和更强的诱导内源多能因子EraS、Daxl的表达；
[0064]图10为使用本发明的OySyNyK方法诱导成功的iPSc，进行建系传代。如图所示六种建系的细胞系，外源表达的诱导因子都沉默了 ；
[0065]图11为使用本发明的OySyNyK方法进行iPS诱导，其中，采用亚硫酸盐测序的方法可以检测到0ct4、Nanog细胞因子的启动子区域在第3天从表观遗传学抑制状态转换成活性表达状态；图A为MEF样品，图B为OySyNyK方法诱导iPS第3天样品FACS筛选GFP阳性细胞。图C为OySyNyK方法诱导iPS第5天样品FACS筛选GFP阳性细胞.图D为OySyNyK方法诱导的iPS建系细胞样品。图F为mES阳性对照样品。
[0066]图12使用本发明的OySyNyK-1PSc注射到免疫缺陷小鼠上可以产生畸胎瘤，HE染色显示三个胚层的结构；
[0067]图13使用本发明的OySyNyK-1PSc囊胚注射可以产生嵌合体小鼠(图A)，并产生种系传递的小鼠(图B)。
[0068]其中，本申请用到氨基酸序列和核苷酸序列如下所示:[0069]图14为SEQ ID NO:1编码0CT4和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白的核苷酸序列
[0070]图15为SEQ ID NO:20CT4和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白序列
[0071]图16为SEQ ID NO:3编码S0X2和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白的核苷酸序列
[0072]图17为SEQ ID NO:4S0X2和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白序列
[0073]图18为SEQ ID NO:5编码NANOG和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白的核苷酸序列
[0074]图19为SEQ ID NO:6NAN0G和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白序列
[0075]图20为SEQ ID NO:7编码KLF4的核苷酸序列
[0076]图21 为 SEQ ID NO:8KLF4 蛋白序列
[0077]图22为SEQ ID NO:9编码YAP蛋白的转录激活结构域的核苷酸序列
[0078]图23为SEQ ID NO: 10YAP蛋白的转录激活结构域序列
[0079]图24为SEQ ID NO:1 IpMXs载体核苷酸序列
[0080]图25为SEQ ID NO:38M yoD和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白序列
[0081]图26为SEQ ID NO:39CEBP α和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白序列
[0082]图27为SEQ ID NO:40Pax5和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白序列
[0083]图28为SEQ ID NO:41Pdxl和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白序列
[0084]图29为SEQ ID NO:42Ngn3和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白序列
[0085]图30为SEQ ID NO:43MafA和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白序列
[0086]图31为SEQ ID NO:44Ascll和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白序列
[0087]图32为SEQ ID NO:45Brn2和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白序列
[0088]图33为SEQ ID NO:46Gata4和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白序列
[0089]图34为SEQ ID NO:47Mef2c和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白序列
[0090]图35为SEQ ID NO:48Tbx5和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白序列[0091 ] 图36为SEQ ID NO:49编码MyoD和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白的核苷酸序列
[0092]图37为SEQ ID NO:50编码CEBP α和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白的核苷酸序列
[0093]图38为SEQ ID NO:51编码Pax5和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白的核苷酸序列
[0094]图39为SEQ ID NO:52编码Pdxl和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白的核苷酸序列
[0095]图40为SEQ ID NO:53编码Ngn3和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白的核苷酸序列
[0096]图41为SEQ ID NO:54编码MafA和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白的核苷酸序列
[0097]图42为SEQ ID NO:55编码Ascll和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白的核苷酸序列[0098]图43为SEQ ID NO:56编码Brn2和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白的核苷酸序列
[0099]图44为SEQ ID NO:57编码Gata4和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白的核苷酸序列
[0100]图45为SEQ ID NO:58编码Mef2c和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白的核苷酸序列
[0101]图46为SEQ ID NO:59编码Tbx5和YAP蛋白的转录激活结构域的融合蛋白的核苷酸序列
【具体实施方式】
[0102]以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明所要保护的范围。
[0103]除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。
[0104] 实施例1使用OySyNyK方法诱导多能干细胞
[0105]1.1丰要试剂与材料
[0106]HEK293T培养基配方:高糖DMEM培养基中加入10%的胎牛血清和终浓度100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素
[0107]MEF培养基配方:高糖DMEM培养基中加入10%的胎牛血清、0.055πιΜβ巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM的非必须氨基酸和终浓度100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素。
[0108]iPSC培养基配方:高糖DMEM培养基中加入10%的胎牛血清，0.055πιΜβ巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM的非必须氨基酸，和终浓度100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素，50 μ g/ml 维生素 C (Sigma), 1000U/ml LIF。
[0109]1.2实验方法
[0110]使用本领域已知的常规方法制备逆转录病毒，其中pMXs逆转录病毒载体(购自addgene)质粒，分别是 0ct4_YapTAD (Oy), Sox2_YapTAD (Sy), Nanog-YapTAD (Ny), Klf4 (K)和包装质粒，各11微克以磷酸钙沉淀方法转染HEK293T细胞。转染后12小时，更换新鲜培养基。转染后48小时，收取病毒上清液，并用0.45微米的PVDF过滤器过滤。0CT4-GFP MEF (从怀孕13.5天的0CT4-GFP转基因小鼠(购自Jackson Laboratory)制备的原代胚胎成纤维细胞)以5 X IO4的密度提前16小时接种在十二孔板中。四种病毒以1:1:1:1的比例混合，并加入终浓度8 μ g/ml的聚凝胺，以2ml每孔的病毒量进行感染.感染24小时后更换iPS培养基，此时定义为Ohr。大约24±6hr后能看到单个细胞0CT4-GFP开始表达，0CT4-GFP阳性iPSC克隆在day3开始出现。iPSC在第六或者第七天进行计数或者挑取单克隆进行传代。
[0111]实施例2使用OSNK法诱导多能干细胞
[0112]HEK293T培养基配方:高糖DMEM培养基中加入10%的胎牛血清和终浓度100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素
[0113]MEF培养基配方:高糖DMEM培养基中加入10%的胎牛血清，0.055πιΜβ巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM的非必须氨基酸，和终浓度100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素。[0114]iPSC培养基配方:高糖DMEM培养基中加入10%的胎牛血清、0.055πιΜβ巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM的非必须氨基酸和终浓度100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素、50 μ g/ml 维生素 C (Sigma)、1000U/ml LIF。
[0115]逆转录病毒包装:pMXs逆转录病毒载体(购自addgene)质粒，分别是0ct4(0)、Sox2 (S) ,Nanog(N)、Klf4 (K)和Ecopac包装质粒各11微克以磷酸钙沉淀方法转染HEK293T细胞。转染后12小时，更换新鲜培养基。转染后48小时，收取病毒上清液，并用0.45微米的PVDF过滤器过滤。0CT4-GFPMEF以5X 104的密度提前16小时接种在十二孔板中。四种病毒以1:1:1:1的比例混合，并加入终浓度8U g/ml的聚凝胺，以2ml每孔的病毒量进行感染。感染24小时后更换iPS培养基，此时定义为Ohr。大约在第4天能看到0CT4-GFP开始表达，0CT4-GFP阳性iPSC克隆在第7天开始出现，iPS克隆在第12到14天进行计数或者挑取单克隆进行传代。
[0116]实施例30ySyNyK法和OSNK法的诱导多能干细胞形态结构和GFP表达鉴定
[0117]0CT4-GFP为0ct4启动子驱动表达的GFP报告质粒整合到转基因小鼠基因组上，其可以用来指示内源0ct4基因表达，是iPS多能性的一个重要标准。
[0118]由图5所示，常规的OSNK诱导多能干细胞产生的方法效率低、耗时长。其在第五天左右才开始有0CT4-GFP少量细胞表达，第七天还未见明显的iPS克隆出现。而本发明方法在第一天就有0CT4-GFP表达，在第三天就开始有iPS克隆开始初步形成，到第七天已经形成大量的状态良好iPS克隆。本方法形成的iPS克隆经过建系传代以后形态上和传统OSNK方法诱导产生的iPS克隆无明显差别。
[0119]实施例40ySyNyK法和OSNK法的诱导多能干细胞的碱性磷酸酶染色鉴定
[0120]碱性磷酸酶染色采用Millipore公司的试剂盒,具体步骤如下。
`[0121]吸出细胞培养液，用PBS润洗I次，用PFA固定I~2min。吸出固定液，用TBST润洗一次；12孔板每孔加入碱性磷酸酶试剂1ml，室温避光放置10~15min后，吸出染色液，用PBS缓冲液润洗一次，最后保存于PBS溶液中。
[0122]由图6所见，在第七天OSNK方法诱导的iPS未见明显的染色出现，本发明所诱导的iPS可见大量的碱性磷酸酶染色呈阳性的克隆。
[0123]实施例50ySyNyK法诱导产生的iPS多有典型的多能干细胞生长特性
[0124]由图7可见，OySyNyK法诱导产生的iPS克隆经建系传代培养后，可以很好的维持类似胚胎干细胞样的克隆形态，经过长期(连续10代)培养后仍然可以很好地维持典型的克隆形态。
[0125]实施例60ySyNyK法和OSNK法的诱导多能干细胞的mRNA水平表达鉴定
[0126]在OSNK方法和OySyNyK方法诱导iPS的过程中，在指定的天数消化收集细胞，用Trizol裂解细胞，然后提取RNA。取2微克RNA进行反转录生成cDNA，然后进行realtimePCR分析。
[0127]引物序列如下:
[0128]0CT4:
[0129]正向:5’-TAGGTGAGCCGTCTTTCCAC-3’ (SEQ ID NO:12)
[0130]反向:5，-GCTTAGCCAGGTTCGAGGAT-3，(SEQID NO:13)
[0131]S0X2:[0132]正向:5’-AGGGCTGGGAGAAAGAAGAG-3’ (SEQ ID NO:14)
[0133]反向:5，-CCGCGATTGTTGTGATTAGT-3，(SEQID NO:15)
[0134]NAN0G2:
[0135]正向:5，-ATCCCTTCCCTCGCCATCAC-3，(SEQID NO:16)
[0136]反向:5，-GGCATTGATGAGGCGTTCC-3’(SEQ ID NO:17)
[0137]Daxl
[0138]正向:5’-TGCTGCGGTCCAGGCCATCAAGAG-3’ (SEQ ID NO:18)
[0139]反向:5，-GGGCACTGTTCAGTTCAGCGGATC-3’(SEQ ID NO:19)
[0140]Eras
[0141]正向:5，-TGCCTACAAAGTCTAGCATCTTG-3，(SEQID NO:20)
[0142]反向:5，-CTTTTACCAACACCACTTGCAC-3，(SEQID NO:21)
[0143]GAPDH:[0144]正向:5，-AGTCAAGGCCGAGAATGGGAAG-3，(SEQID NO:22 )
[0145]反向:5’-AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATG-3’ (SEQ ID NO:23)
[0146]如图8所示，OySyNyK方法比OSNK方法能够更迅速和更强的诱导内源多能因子0CT4、S0X2、NANOG的表达；如图9为所示，OySyNyK方法比OSNK方法能够更迅速和更强的诱导内源多能因子Eras、Daxl的表达；
[0147]实施例7体外畸胎瘤形成试验
[0148]将OySyNyK方法诱导建系的iPS细胞去除feeder后，以2*106细胞量注射到SCID裸鼠(购自维通利华)后腿上部，约2月后取出畸胎瘤组织进行苏木精伊红染色。由图12结果所示，OySyNyK方法诱导建系的iPS产生的畸胎瘤当中有三个胚层的结构，证明了该iPS细胞系的全能性。
[0149]实施例8逆转录病毒外源某闵表汰沉默
[0150]取OySyNyK病毒感染MEF第三天的样品，六株建系传代的OySyNyK方法诱导的iPS细胞系，MEF细胞进行Trizol裂解，提取RNA。取2微克RNA进行反转录生成cDNA，然后进行realtime PCR分析。引物序列如下:
[0151]0CT4:
[0152]正向:5，-GGGTGGACCATCCTCTAGAC-3，(SEQID NO:24)
[0153]反向:5，-CCAGGTTCGAGAATCCAC-3，(SEQID NO:25)
[0154]S0X2:
[0155]正向:5，-GGGTGGACCATCCTCTAGAC-3，(SEQID NO:26)
[0156]反向:5，-GGGCTGTTCTTCTGGTTG-3，(SEQID NO:27)
[0157]NANOG:
[0158]正向:5，-GGGTGGACCATCCTCTAGAC-3，(SEQID NO:28)
[0159]反向:5，-GGCATTGATGAGGCGTTCC-3’(SEQ ID NO:29)
[0160]KLF4:
[0161]正向:5，-GGGTGGACCATCCTCTAGAC-3，(SEQID NO:30)
[0162]反向:5，-GCTGGACGCAGTGTCTTCTC-3，(SEQID NO:31)
[0163]GAPDH:[0164]正向:5’-AGTCAAGGCCGAGAATGGGAAG-3’ (SEQ ID NO:32)
[0165]反向:5’-AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATG-3’ (SEQ ID NO:33)
[0166]如图10所示，六株建系传代的OySyNyK方法诱导的iPS细胞系中，外源表达的0y, Sy, Ny, K均已经处于表达沉默状态。
[0167]实施侈Il 90ct4矛口 Nanog promoter在OySyNyK方法诱导iPS I寸矛呈中十 谏.去甲基仆,
[0168]提取各样品的基因组，然后进行亚硫酸盐处理。本实验是采用Millipore公司的试剂盒CpGenome?Turbo Bisulfite Modification Kit进行样品处理。然后对产物进行0ct4和Nanog启动子区域进行PCR，PCR产物平端连接pEASY_T3载体(购自全式金)，随机挑去10个克隆进行测序。引物信息如下: [0169]NANOG启动子的DNA甲基化分析
[0170]正向:5，-GATTTTGTAGGTGGGATTAATTGTGAATTT-3，(SEQID NO:34)
[0171]反向:5，-ACCAAAAAAACCCACACTCATATCAATATA-3’(SEQ ID NO:35)
[0172]0CT4启动子的DNA甲基化分析:
[0173]正向:5，-ATGGGTTGAAATATTGGGTTTATTTA-3’(SEQ ID NO:36)
[0174]反向:5，-CCACCCTCTAACCTTAACCTCTAAC-3，(SEQID NO:37)
[0175]对0ct4、Nanog的启动子区域进行胞嘧啶甲基化状态的分析显示，相对于常规OSNK诱导方法,OySyNyK方法能够在短至1_2天的时间内使0ct4、Nanog的启动子区发生快速的去甲基化，使其从表达抑制状态进入到高水平的活性表达状态。
[0176]实施例1OOySyNyK方法诱导的iPS可以生成嵌合体小鼠和进行种系传递
[0177]OySyNyK方法诱导的iPS囊胚注射到ICR小鼠3.5天囊胚当中，然后移植到代孕母鼠子宫里。生出的后代小鼠中后杂合毛色的嵌合体小鼠，然后将嵌合体公鼠和野生型ICR母鼠交配，出生的后代小鼠中有纯黑色小鼠出生。
[0178]如图左所示OySyNyK方法诱导的iPS能成功的生出嵌合体小鼠。如图右所示，出生的嵌合体小鼠能成功的进行种系传递。说明OySyNyK方法诱导的iPS多能性良好。
【权利要求】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含细胞全能性相关的基因编码的蛋白或其片段，以及与所述细胞全能性相关的基因编码的蛋白或其片段直接连接或通过连接序列连接的转录调控结构域或其具有转录调控活性的片段； 优选地，所述连接序列为GGGGS ； 优选地，所述细胞全能性相关的基因编码的蛋白或其片段通过氨基端或羧基端与转录调控结构域或其具有转录调控活性的片段连接；优选地，所述细胞全能性相关的基因选自 0CT4、S0X2、NANOG、SOXl、S0X3、S0X15、S0X18、STAT3、SMADl、Sal4、Nr5a2、Daxl、Esrrb、Utfl、MyoD、CEBPa、Pax5，Pdxl、Ngn3、MafA、Ascll、Brn2、Mytll、Gata4、Mef2c 和 Tbx5 中的一种或多种；更优选地，所述细胞全能性相关的基因选自0CT4、S0X2、NANOG、MyoD、CEBP α、Pax5、Pdxl、Ngn3、MafA、Ascl1、Brn2、Gata4、Mef2c 和 Tbx5 中的一种或多种；进一步优选地，所述细胞全能性相关的基因选自0CT4、S0X2和NANOG中的一种或多种，例如一种、两种或二种； 优选地，所述转录调控结构域为哺乳动物YAP蛋白的转录激活结构域或其具有转录调控活性的片段；更优选地，所述转录调控结构域选自小鼠、猪、羊、牛或人的YAP蛋白的转录激活结构域或其具有转录调控活性的片段；进一步优选地，所述转录调控结构域选自小鼠的YAP蛋白的转录激活结构域或其具有转录调控活性的片段；再进一步优选地，所述转录调控结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白选自以下的一种或多种:0CT4蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白；S0X2蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白；NAN0G蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白；、MyoD蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白；CEBPa蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白；Pax5蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白；Pdxl蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白；Ngn3蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白；MafA蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白；Ascll蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白；Brn2蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白；Gata4蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白；Mef2c蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白；Tbx5蛋白与YAP蛋白的转录激活结构域融合形成的融合蛋白； 优选地，所述融合蛋白选自 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:38-48所示的氨基酸序列中的一种或多种。
3.一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码如权利要求1或2所述的融合蛋白； 优选地，编码所述转录调控结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示； 优选地，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO:USEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:49-59所不的核苷酸序列中的一种或多种。
4.一种表达载体,所述表达载体表达如权利要求1或2所述的融合蛋白； 优选地，所述载体为逆转录病毒载体； 更优选地，所述进行逆转录病毒包装的细胞为293T细胞。
5.一种组合物，所述组合物含有如权利要求1或2所述的融合蛋白、如权利要求3所述的核苷酸序列和/或如权利要求4所述的表达载体；优选地，所述组合物含有至少一种选自下组的融合蛋白:0CT4-YAPtad、S0X2-YAPtad和NANOG-YAPtad ； 优选地，所述组合物还包括Klf4蛋白、编码Klf4蛋白的核苷酸和/或表达载体； 优选地，所述Klf4蛋白的表达载体为逆转录病毒载体，更优选地，所述进行逆转录病毒包装的细胞为293T细胞； 优选地，所述Klf4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示； 优选地，所述编码Klf4蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
优选地，所述组合物包括选自SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列和 / 或 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:7 所示的核苷酸序列。
6.一种试剂盒，所述试剂盒含有如权利要求1或2所述的融合蛋白、如权利要求3所述的核苷酸序列、如权利要求4所述的表达载体和/或如权利要求5所述的组合物； 优选地，所述试剂盒含有至少一种选自下组的融合蛋白:0CT4-YAPtad、S0X2-YAPtad和NANOG-YAPtad ； 优选地，所述试剂盒还包括Klf4蛋白、编码Klf4蛋白的核苷酸和/或表达载体； 优选地，所述Klf4蛋白的表达载体为逆转录病毒载体，更优选地，所述进行逆转录病毒包装的细胞为293T细胞； 优选地，所述Klf4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示； 优选地，所述编码Klf4蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示； 优选地，所述试剂盒包括包括选自SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:8 所示的氨基酸序列和 / 或 SEQ ID NO:USEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
7.一种将体细胞重编程为诱导的多能干细胞的方法，所述方法包括以下步骤: 1)用权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求3所述的核苷酸序列、权利要求4所述的表达载体、权利要求5所述的组合物或权利要求6所述的试剂盒处理体细胞， 2)将上述步骤I)获得的经过处理后的体细胞进行培养，然后筛选出具有多能干细胞理化特征的细胞，从而获得多能干细胞； 优选地，所述体细胞为人或者其他物种的任何成体细胞；更优选地，所述体细胞为哺乳动物的成体细胞；进一步优选地，所述哺乳动物为人或鼠；进一步优选地，所述成体细胞为:皮肤成纤维细胞、血液细胞和/或口腔上皮细胞； 优选地，所述体细胞处理包括通过病毒感染、质粒转染、蛋白转导和/或mRNA转染将所述融合蛋白、核苷酸序列、表达载体和/或组合物导入体细胞中； 优选地，所述方法为逆转录病毒感染；更优选地，所述进行逆转录病毒包装的细胞为293T ； 优选地，所述质粒转染中，使用病毒感染复数大于等于10的逆转录病毒量去感染细胞；更优选地，使用病毒感染复数等于10的逆转录病毒量去感染细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述步骤I)是通过包括以下步骤的方法进行的: a)构建含有权利要求1所述的细胞全能性相关的基因或其片段和哺乳动物YAP蛋白的转录激活结构域或其具有转录调控活性的片段的核苷酸序列的质粒载体；优选地，还构建含有Klf4的核苷酸序列的质粒载体； 优选地，所述细胞全能性相关的基因包括全长序列的0CT4、S0X2和NANOG，所述YAP蛋白的转录激活结构域为小鼠YAP蛋白的转录激活结构域； 优选地，所述质粒为逆转录病毒pMXs载体； 优选地，所述pMXs载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示； b)将上述步骤a)获得的质粒载体分别转染进入293T细胞以进行逆转录病毒的包装，转染后48小时之后，收集病毒上清液，过滤后，将病毒混合，加入聚凝胺，感染成体细胞，启动细胞重编程； 优选地，所述过滤使用0.45 μ m PVDF滤器； 优选地，所述病毒以1:1:1:1的比例混合； 优选地，所述加入聚凝胺后的终浓度为8 μ g/μ I。
9.如权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求3所述的核苷酸序列、权利要求4所述的表达载体、权利要求5所述的组合物或权利要求6所述的试剂盒在制备用于将体细胞重编程为诱导多能干细胞的 试剂中的用途。
【文档编号】C07K19/00GK103739718SQ201410020902
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月16日 优先权日:2014年1月16日
【发明者】陈大华, 金鹏, 孙钦秒, 夏来新, 朱庚振, 朱飞, 林蔚, 谭薇琦 申请人:中国科学院动物研究所