一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法
【专利摘要】本发明提出了一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法，属于生物与化学工艺【技术领域】。在原料的选取上，本发明所选用的雨生红球藻是经过雨生红球藻细胞异样生长、高密度藻细胞稀释和光诱导三个阶段完成的，利用超高压提取技术对藻体进行破壁处理，然后再经过萃取、洗脱、浓缩、皂化、离心、等步骤得到虾青素。该工艺有机溶剂消耗少，萃取剂可以循环利用，环境污染小、生产成本低，回收率高，杂质少，降低了虾青素氧化降解可能性，提高了虾青素的提取质量。
【专利说明】—种从雨生红球藻中提取虾青素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种虾青素的提取方法，具体涉及一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法，属于生物与化学工艺【技术领域】。
【背景技术】
[0002]虾青素属于类胡萝卜素，呈鲜红色，是一种优质色素和超级抗氧化剂，一种具有邻羟基酮结构的类胡萝卜素，其化学名称为3，3-二羟基-4，4-二酮基-β，β '-胡萝卜素，纯虾青素是暗红棕色晶体，熔点224°C，不溶于水，能溶于大多数有机溶剂。虾青素具有超强的抗氧化性和清除自由基的能力，临床及动物学实验表明虾青素具有良好的抗炎、抗肿瘤、抗衰老、保护皮肤、增强机体免疫、预防心血管疾病、维护眼睛健康、提高动物的繁殖力等多方面重要的生物学功能。除此之外，虾青素还具有显著的着色性能，目前主要作为水产品、禽蛋、观赏动物养殖和畜牧产品的着色剂。因此虾青素在食品、医药、化妆品、保健品和饲料等行业具有非常大的应用潜力，市场前景广阔。
[0003]雨生红球藻中虾青素含量高，是虾青素的最佳生物来源。它是一种单细胞生物，其厚壁孢子坚韧的细胞壁影响虾青素提取，细胞壁不但阻碍提取溶剂向细胞内渗透，也影响细胞内虾青素向细胞外扩散。因此，通常先对红球藻细胞进行机械破壁，然后再用溶剂提取。目前，各种机械破壁方法中破壁率较高并可实现工业化生产的是高压均质法，但高压均质机磨损较快，使生产成本明显增加。我国天然虾青素的生产目前还处于初级阶段，大量工作主要集中在实验室研究水平。国内虾青素粉(虾青素含量为2~3%)的市场价格为3500元/公斤。因此虾青素的生产具有很大的市场潜力。超高压提取技术利用IOOMPa以上的流体静压力作用于料液上 ，保压一定时间，然后迅速卸压，可进行分离纯化，达到提取目的。
[0004]CN102659652A公开了一种从雨生红球藻中提取总虾青素的固相萃取方法，该方法没有经过物料溶剂预处理，以少量有机溶媒为中介，将物料中的虾青素萃取到固体萃取剂上，通过固相萃取一步即可从含虾青素的物料中获得虾青素油。
【发明内容】
[0005]为解决现有技术中存在的问题，本发明提出了一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法，该方法采用高压技术对雨生红球藻进行破壁，提高了虾青素的提取质量。
[0006]本发明的技术方案包括:
[0007]一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法，所述方法包括以下步骤:
[0008]a藻体破壁:称取一定量的藻体，向所述藻体中加入一定量的大豆油，所述藻体和大豆油的重量体积比为l:10g/mL，以345mL/min流量泵入高压容器内，在压力为100~300Mpa、温度为4°C下进行破壁处理，将破壁液离心分离，得到虾青素提取液及藻渣；
[0009]b萃取:将步骤a中的虾青素提取液及藻渣与硅胶以重量比2~4:1混合均匀，然后加入乙醇和乙酸乙酯，所述乙醇和乙酸乙酯的加入量按照每IOg雨生红球藻粉加入5~IOmL乙醇和15~20mL的乙酸乙酯来进行计算，将所述虾青素提取液及藻渣、硅胶、乙醇和乙酸乙酯混合搅拌萃取I~3h后，将萃取混合物装入层析柱中；
[0010]C洗脱:用乙醇洗脱，收集红色流出液部分；
[0011]d浓缩:将所述红色流出液减压蒸馏，得到暗红色虾青素油状液体。
[0012]上述的虾青素油状液体按照如下步骤精提:
[0013]e皂化:将虾青素油状液体与0.06mol/L的氢氧化钾-乙醇溶液按体积比2~8: 1混合为皂化液，4~12°C，氮气保护条件下，避光皂化2-4h ；
[0014]f离心:在步骤e皂化液中加入去离子蒸馏水，至红色絮状沉淀产生，离心得到虾
青素沉淀。
[0015]上述的虾青素沉淀按照如下步骤获得结晶产品:
[0016]g纯化:将虾青素沉淀通氮气吹干，用石油醚溶解，再通过硅胶柱层析纯化，用正己烷与丙酮按体积比5:2混合作为洗脱液洗脱，收集红色流出液；
[0017]h结晶:在步骤g红色流出液中加入等体积去离子水混匀，置于-10°C~_6°C，育晶18~24h，4000转/min离心，用去离子水洗涤沉淀两次，收集晶体，氮气吹干，获得结晶产品。[0018]进一步的，上述的步骤b中的乙醇和乙酸乙酯可以用大豆油、氢氧化钾-乙醇溶液、石油醚、正己烷、丙酮中的一种或几种的混合物来代替。
[0019]上述的雨生红球藻的培养包括三个阶段:培养雨生红球藻细胞异样生长阶段、高密度藻细胞稀释阶段和光诱导阶段。
[0020]上述的雨生红球藻细胞异样生长阶段中加入生长激素，所述生长激素为萘乙酸、6-苄基嘌呤、2，4- 二氯苯氧乙酸或赤霉素。
[0021]上述萘乙酸的质量浓度为0.5mg/L、6-苄基嘌呤的质量浓度为0.5mg/L、2，4_ 二氯苯氧乙酸的质量浓度为0.lmg/L、赤霉素的质量浓度为0.5mg/L。
[0022]本发明所带来的有益技术效果:
[0023]本发明提出了一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法，在原料的选取上，本发明所选用的雨生红球藻是经过雨生红球藻细胞异样生长、高密度藻细胞稀释和光诱导三个阶段完成的，通过异样培养可在短时间内获得大量的可产虾青素的微藻细胞，藻液稀释后转入光诱导培养，光诱导培养的藻细胞密度达到2-10g/L，而常规光自养培养藻细胞密度一般0.2-2g/L，采用光诱导培养藻体内的虾青素含量可提高常规培养的5倍以上，并且在藻细胞异样生长阶段中加入生长激素，该方法制备得到的雨生红球藻含有较高的虾青素；利用超高压提取技术对藻体进行破壁处理，然后再经过萃取、洗脱、浓缩、皂化、离心、等步骤得到虾青素，该制备方法消耗溶剂量较少，萃取剂选用大豆油、乙醇、乙酸乙酯等溶剂，该萃取剂可以循环利用，并且环境污染小、生产成本低、回收率高、提取得到的虾青素杂质少，该提取方法降低虾青素氧化降解可能性，提高了虾青素的提取质量。
【具体实施方式】
[0024]本发明提出了一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法，为了使本发明的目的、技术方案以及优点更清楚、明确，以下将结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
[0025]本发明所选取原料为雨生红球藻，雨生红球藻的简要培养步骤如下。
[0026]雨生红球藻的培养:雨生红球藻细胞经异样生长、高密度藻细胞稀释和光诱导三个阶段，并且在藻细胞异样生长阶段加入一些生产长激素萘乙酸(NAA)、6_苄基嘌呤(6-BA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、赤霉素(GA3)，通过异样培养这种方式可在短时间内获得大量的可产虾青素的微藻细胞，然后将藻液稀释后转入光诱导培养，藻体内虾青素含量可提高、初始的5倍以上；异样生长培养能使雨生红球藻长期处于营养繁殖的阶段，异样生长阶段细胞产率高，一天平均细胞产率有1.6g/L，异样阶段最终细胞的密度可达到24.5g/L，所以光诱导的藻细胞密度达到2-10g/L，常规光自养培养藻细胞密度一般0.2-2g/L，是常规培养的5-10倍；传统的微藻自养培养时间约14-30天，而光诱导的时间一般约3~5天，虾青素的生产周期缩短，产率大大提高；所选用的生长激素:萘乙酸的质量浓度为0.5mg/L、6-苄基嘌呤的质量浓度为0.5mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸的质量浓度为0.lmg/L、赤霉素的质量浓度为0.5mg/L。
[0027]实施例1:
[0028]步骤一:高压提取对藻体进行破壁处理
[0029]藻体破壁:称取IOg藻体，向藻体中加入IOOmL大豆油，在345mL/min流量泵入高压容器内，在压力为lOOMpa、温度为4°C下进行破壁处理，将破壁液离心分离，得到虾青素提取液及藻渣；
[0030]步骤二:快速分离虾青素
[0031]萃取:将虾青素提取液及藻渣与硅胶以重量比2:1混合均匀，然后加入5mL乙醇和15mL的乙酸乙酯，搅拌萃取Ih后，将萃取混合物装入层析柱中；
[0032]洗脱:用乙醇洗脱，收集红色流出液部分； [0033]浓缩:将所述红色流出液减压蒸馏，得到暗红色虾青素油状液体。
[0034]步骤三:虾青素油状液体的粗提
[0035]皂化:将虾青素油状液体与0.06mol/L的氢氧化钾-乙醇溶液按体积比2: I混合为皂化液，4°C，氮气保护条件下，避光皂化2h ；
[0036]离心:在皂化液中加入去离子蒸馏水，至红色絮状沉淀产生，离心得到虾青素沉淀。
[0037]步骤四:虾青素结晶
[0038]纯化:将虾青素沉淀通氮气吹干，用石油醚溶解，再通过硅胶柱层析纯化，用正己烷与丙酮按体积比5:2混合作为洗脱液洗脱，收集红色流出液；
[0039]结晶:在红色流出液中加入等体积去离子水混匀，置于-10°C，育晶18h，4000转/min离心，用去离子水洗涤沉淀两次，收集晶体，氮气吹干，获得结晶产品。
[0040]实施例2:
[0041 ] 步骤一:高压提取对藻体进行破壁处理
[0042]藻体破壁:称取IOg藻体，向藻体中加入IOOmL大豆油，在345mL/min流量泵入高压容器内，在压力为200Mpa、温度为4°C下进行破壁处理，将破壁液离心分离，得到虾青素提取液及藻渣；
[0043]步骤二:快速分离虾青素
[0044]萃取:将虾青素提取液及藻渣与硅胶以重量比3:1混合均匀，然后加入SmL乙醇和ISmL的乙酸乙酯，搅拌萃取2h后，将萃取混合物装入层析柱中；
[0045]洗脱:用乙醇洗脱，收集红色流出液部分；[0046]浓缩:将所述红色流出液减压蒸馏，得到暗红色虾青素油状液体。
[0047]步骤三:虾青素油状液体的粗提
[0048]皂化:将虾青素油状液体与0.06mol/L的氢氧化钾-乙醇溶液按体积比4: I混合为皂化液，8°C，氮气保护条件下，避光皂化3h ；
[0049]离心:在皂化液中加入去离子蒸馏水，至红色絮状沉淀产生，离心得到虾青素沉淀。
[0050]步骤四:虾青素结晶
[0051]纯化:将虾青素沉淀通氮气吹干，用石油醚溶解，再通过硅胶柱层析纯化，用正己烷与丙酮按体积比5:2混合作为洗脱液洗脱，收集红色流出液；
[0052]结晶:在红色流出液中加入等体积去离子水混匀，置于_8°C，育晶20h，4000转/min离心，用去离子水洗涤沉淀两次，收集晶体，氮气吹干，获得结晶产品。
[0053]实施例3:
[0054]步骤一:高压提取对藻体进行破壁处理
[0055]藻体破壁:称取IOg藻体，向藻体中加入IOOmL大豆油，在345mL/min流量泵入高压容器内，在压力为300Mpa、温度为4°C下进行破壁处理，将破壁液离心分离，得到虾青素提取液及藻渣；
[0056]步骤二:快速分离虾青素
[0057]萃取:将虾青素提取液及藻渣与硅胶以重量比3:1混合均匀，然后加入IOmL乙醇和20mL的乙酸乙酯，搅拌萃取3h后，将萃取混合物装入层析柱中；
[0058]洗脱:用乙醇洗脱，收集红色流出液部分；
[0059]浓缩:将所述红色流出液减压蒸馏，得到暗红色虾青素油状液体。
[0060]步骤三:虾青素油状液体的粗提
[0061]皂化:将虾青素油状液体与0.06mol/L的氢氧化钾-乙醇溶液按体积比6: I混合为皂化液，10°c，氮气保护条件下，避光皂化4h ；
[0062]离心:在皂化液中加入去离子蒸馏水，至红色絮状沉淀产生，离心得到虾青素沉淀。
[0063]步骤四:虾青素结晶
[0064]纯化:将虾青素沉淀通氮气吹干，用石油醚溶解，再通过硅胶柱层析纯化，用正己烷与丙酮按体积比5:2混合作为洗脱液洗脱，收集红色流出液；
[0065]结晶:在红色流出液中加入等体积去离子水混匀，置于_6°C，育晶24h，4000转/min离心，用去离子水洗涤沉淀两次，收集晶体，氮气吹干，获得结晶产品。
[0066]上述三个实施例中萃取步骤中选用的乙醇和乙酸乙酯也可以用大豆油、氢氧化钾-乙醇溶液、石油醚、正己烷、丙酮中的一种或几种的混合物来代替。
[0067]应当理解的是，上述针对较佳实施例的描述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围情况下，还可以做出替换、简单组合等多种变形，本发明的请求保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1.一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法，其特征在于包括以下步骤: a藻体破壁:称取一定量的藻体，向所述藻体中加入一定量的大豆油，所述藻体和大豆油的重量体积比为l:10g/mL，以345mL/min流量泵入高压容器内，在压力为100~300Mpa、温度为4°C下进行破壁处理，将破壁液离心分离，得到虾青素提取液及藻渣； b萃取:将步骤a中的虾青素提取液及藻渣与硅胶以重量比2~4:1混合均匀，然后加入乙醇和乙酸乙酯，所述乙醇和乙酸乙酯的加入量按照每IOg雨生红球藻粉加入5~IOmL乙醇和15~20mL的乙酸乙酯来进行计算，将所述虾青素提取液及藻渣、硅胶、乙醇和乙酸乙酯混合搅拌萃取I~3h后，将萃取混合物装入层析柱中；c洗脱:用乙醇洗脱，收集红色流出液部分；d浓缩:将所述红色流出液减压蒸馏，得到暗红色虾青素油状液体。
2.根据权利要求1所述一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法，其特征在于:所述虾青素油状液体按照如下步骤精提: e皂化:将虾青 素油状液体与0.06mol/L的氢氧化钾-乙醇溶液按体积比2~8: I混合为皂化液，4~12°C，氮气保护条件下，避光皂化2-4h ； f离心:在步骤e皂化液中加入去离子蒸馏水，至红色絮状沉淀产生，离心得到虾青素沉淀。
3.根据权利要求2所述一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法，其特征在于:所述虾青素沉淀按照如下步骤获得结晶产品: g纯化:将虾青素沉淀通氮气吹干，用石油醚溶解，再通过硅胶柱层析纯化，用正己烷与丙酮按体积比5:2混合作为洗脱液洗脱，收集红色流出液； h结晶:在步骤g红色流出液中加入等体积去离子水混匀，置于-10°C~_6°C，育晶18~24h，4000转/min离心，用去离子水洗涤沉淀两次，收集晶体，氮气吹干，获得结晶产品O
4.根据权利要求3所述的一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法，其特征在于:所述步骤b中的乙醇和乙酸乙酯可以用大豆油、氢氧化钾-乙醇溶液、石油醚、正己烷、丙酮中的一种或几种的混合物来代替。
5.根据权利要求4所述的一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法，其特征在于:所述雨生红球藻的培养包括三个阶段:培养雨生红球藻细胞异样生长阶段、高密度藻细胞稀释阶段和光诱导阶段。
6.根据权利要求5所述的一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法，其特征在于:所述雨生红球藻细胞异样生长阶段中加入生长激素，所述生长激素为萘乙酸、6-苄基嘌呤、2，4- 二氯苯氧乙酸或赤霉素。
7.根据权利要求6所述的一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法，其特征在于:所述萘乙酸的质量浓度为0.5mg/L、6-苄基嘌呤的质量浓度为0.5mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸的质量浓度为0.lmg/L、赤霉素的质量浓度为0.5mg/L。
【文档编号】C07C403/24GK103787941SQ201410020938
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】李悦明, 管斌, 李元广, 徐建春, 夏修峦, 王道会 申请人:青岛科海生物有限公司