一种雨生红球藻高产虾青素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于红球藻生产虾青素领域，涉及一种雨生红球藻高产虾青素的方法。
【背景技术】
[0002] 虾青素，是从河螯虾外壳、牡蛎和鲑鱼中发现的一种红色类胡萝卜素，化学名称是 3,3'-二羟基_4,4'-二酮基β-胡萝卜素，晶体为褐红色。虾青素是具有抗氧化活性的 类胡萝卜素，与胡萝卜素及维生素Ε等相比，虾青素具有更强的生物活性，是属于人体安全 的物质。虾青素的抗氧化活性比β -胡萝卜素高约10倍，比维生素Ε高约500倍，虾青素 已被认为是"超级维生素Ε"，而且其具有着色功能，在水产及家禽养殖、食品、化妆品、医药 等领域具有广泛的应用前景。目前，雨生红球藻是自然界中天然虾青素含量最高的生物来 源，他是一种普遍存在的绿藻，属于绿藻门，绿藻纲，团藻目，红球藻科，红球藻属，这种藻在 适宜它生长的条件下广泛存在于自然界中。在国外已有几家大公司利用雨生红球藻进行天 然虾青素的工业化生产，但我国尚未形成生产规模。目前国际市场的价格为每千克2500美 元，全球每年有1亿美元以上的市场容量。因此，开发雨生红球藻生产天然虾青素具有极大 的市场前景。
[0003] 虽然雨生红球藻是目前最好的虾青素工业生产来源，但它生长缓慢，培养过程中 容易被其他生物污染，为了优化工业生产过程，提高虾青素的产量，需要为天然虾青素的生 产提供优良培养方法，以提高工业产量。
[0004] 根据检索，发现有以下几篇专利文献与本发明相关，分别是：
[0005] 1、专利（200910099708. 6) "一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法"，该方法 通过三角烧瓶、塑料桶或尼龙袋、水泥池的三步培养法，比较简易，但每步都需要控制各种 理化环境参数，较为繁琐。
[0006] 2、专利（02138827.X) "一种培养雨生红球藻生产虾青素的方法"，该方法虽然采 用一步培养法较为简便，但只采用通C02诱导细胞积累虾青素比较慢，而且采收方法较为麻 烦。
[0007] 3、专利（201210561399. 1)"一种培养雨生红球藻生产虾青素的转化方法"，该方法 包括固定化转化细胞的制备、固定化转化细胞与营养生长细胞相结合、相关的环境条件控 制等，诱导效果明显，运行稳定可靠。但该方法需要制备固定化细胞，比较麻烦，不适于大规 模培养。
[0008] 4、专利（200610154678. 0) "大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及其方 法"，该方法中整个培养装置由设置在固定架上的光生物反应器系统、充气装置、培养液灌 输装置和静细胞收集装置组成，固定架上设置浮沉控制装置，可以不需建立人工培养池和 其他设施，而利用自然水体进行大规模雨生红球藻培养。但该方法需要在密闭光式生物反 应器中进行，且需要在自然水体进行培养，实行起来较为困难，生产虾青素的成本高，产量 小。
[0009] 5、文章"雨生红球藻培养及虾青素累积条件探讨"，该文章发现缺氮培养基对于雨 生红球藻细胞累积虾青素最为有利，但其只限于实验室研究。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种与常规虾青素生产藻株相 比其虾青素生成能力更高且生长速度更快，并由此能够有效提高虾青素产率的雨生红球藻 高产虾青素的方法。
[0011] 本发明实现目的的技术方案是：
[0012] -种雨生红球藻高产虾青素的方法，步骤如下：
[0013] ⑴先在带有遮阳网的管道或者塑料袋中进行高密度培养，温度为18-33Γ，光照强 度为1000-2500Lux，培养5-8天，待藻细胞进入稳定期；
[0014] ⑵接入跑道池中培养，跑道池中为BBM完全培养基，用于进一步扩大培养藻细胞， 培养至待细胞密度不再继续升高；
[0015] ⑶将跑道池中藻细胞收集接入等盐度的氮、磷、硫缺失的BBM培养基进行胁迫培 养，用于雨生红球藻虾青素的积累，培养温度为18-33Γ，光照强度为无遮挡太阳光，太阳光 强度在lOOOOLux以上；
[0016] ⑷在3到5天胁迫培养后，细胞颜色不再加深，细胞体积不再继续增大，鞭毛脱落 丧失游动能力，即可收集细胞，然后破碎，提取虾青素。
[0017] 而且，所述细胞收集方法是：将跑道池中的藻细胞抽入到铺有双层滤布的培养池 中。第一层300目滤布用来除虫，第二层1000目滤布用来收集细胞，滤液通过培养池底部 流出培养池，藻细胞留在滤布上，随后添加一定体积等盐度的氮、磷、硫缺失的BBM培养基 进行胁迫培养。
[0018] 而且，所述的诱变方法的步骤是：
[0019] ⑴取适量培养至对数期的雨生红球藻藻液，离心收集用磷酸缓冲液洗涤两次，然 后在藻悬液内加入甲基磺酸乙酯，避光并使该藻细胞与其接触4h;
[0020] ⑵加入lml5 %的硫代硫酸钠终止诱变反应，离心去除诱变液，用新鲜营养液洗涤 两次，避光12h后置于光照条件下培养；
[0021] ⑶将诱变处理后的藻株接种于固体培养基上，筛选培养基上生长快速且藻落较大 的藻株，即得到生长速率快且高产虾青素的诱变藻株。
[0022] 而且，所述的诱变藻株在BBM、BG_11等自养培养基中良好生长。
[0023] 而且，经过胁迫培养后，其虾青素的含量可达干重的5%以上，生长速率比原藻株 提尚达30%以上，生理生化特性稳定，具有稳定遗传性能。
[0024] 本发明的优点和积极效果是：
[0025] 1、本发明提供的高产虾青素的方法中在高光条件下使用等盐度的氮、磷、硫缺失 的BBM培养基进行胁迫培养，可以更大限度的增加虾青素的产量，而且使用双层滤布过滤， 既可以去除培养过程中引入的虫害，又方便培养末期雨生红球藻细胞的采收。
[0026] 2、本方法相比来说更为简易，而且本方法在高光照的条件下，进一步使用等盐度 的氮磷硫缺失的BBM培养基进行胁迫培养，可以进一步增加细胞虾青素的含量与产量。
[0027] 3、本发明诱导的藻株是以雨生红球藻的原藻株为材料，采用化学诱变剂甲基磺酸 乙酯（EMS)诱变，筛选而得。其特征是该藻株经过发酵法培养后，虾青素的含量可达干重的 5%以上，生长速率比原藻株提高达30%以上，生理生化特性稳定，具有稳定遗传性能，是生 产天然虾青素的优良藻株，可以作为工业生产来源，进行天然虾青素的工业化生产
【附图说明】
[0028] 图1雨生红球藻绿色游动时期扫描电镜照片（左上角图片为原藻株绿色时期时细 胞）（HB712);
[0029] 图2雨生红球藻红色不动时期扫描电镜照片（左上角图片为原藻株红色时期时细 胞）（HB712)。
【具体实施方式】
[0030] 下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术 手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发 明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背 离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改 动也属于本发明的保护范围。
[0031] 本申请采用的藻株为雨生红球藻HB712,其公开于"雨生红球藻培养及虾青素累积 条件探讨，陈兴才等，中国食品学报，第6卷第4期，2006年8月"
[0032] -种雨生红球藻高产虾青素的方法，步骤如下：
[0033] 1、培养基的处理
[0034] 种子培养基配置好以后，121°C灭菌20min，冷却至室温后进行接种；生产用培养 基采用漂白粉过夜处理，有效氯的浓度为100-300mg/L，处理后用等当量的硫代硫酸钠中和 培养基中的次氯酸，利用残氯试纸检测培养基中残氯是否符合标准，检验合格后方可接种。
[0035] 2、雨生红球藻的培养方式
[0036]⑴先在带有遮阳网的管道或者塑料袋中进行高密度培养，温度为18-33Γ，光照强 度为1000-2500Lux，培养5天待藻细胞进入稳定期；
[0037] ⑵接入跑道池中培养，跑道池中为BBM完全培养基，用于进一步扩大培养藻细胞， 待细胞密度不再继续升高后，将藻细胞（雨生红球藻HB712)抽入到铺有双层滤布的培养池 中；
[0038] ⑶第一层滤布（300目）用来除虫，第二层滤布（1000目）用来收集细胞，滤液通 过培养池底部流出培养池，藻细胞留在滤布上，随后添加4吨等盐度的氮、磷、硫缺失的BBM 培养基（培养基成分：196. 89mg/L氯