化钠、120. 37mg/L氯化钾、61. 86mg/L六水氯化镁、 25mg/L二水氯化USOmg/LEDTAdlmg/L氢氧化钾、4. 98mg/L七水亚硫酸铁、11. 42mg/L硼 酸、8. 82mg/L七水硫酸锌、1. 44mg/L四水氯化猛、0. 71mg/L三氧化钼、1. 57mg/L无水硫酸 铜、0. 49mg/L六水硝酸钴，pH8. 0左右）进行胁迫培养，用于雨生红球藻虾青素的积累。
[0039] ⑷培养温度为18-33°C，光照强度为无遮挡太阳光（lOOOOLux以上）。在3到5天 胁迫培养后，细胞颜色不再加深，细胞体积不再继续增大，鞭毛脱落丧失游动能力，因此全 都沉在滤布上，同时培养液挥发逐渐减少，直接收集滤布即可将藻细胞全部收集。
[0040] 3、目标产物虾青素的诱导及提取测定：
[0041] ⑴取2ml变红的藻液，加丙酮反复研磨至无色，将丙酮挥发干，用乙腈甲醇（3:1， v/v)溶液将色素重新溶解并收集，4000rpm离心5min，收集上清，用比色管定容至5ml。加 入lml0. 1M的NaOH甲醇溶液，4°C皂化反应12h，目的是将样品中的虾青素酯分解成游离的 虾青素以便测定。
[0042] ⑵利用高效液相色谱法（HPLC)测定上述皂化反应液。色谱条件如下，色谱柱是 BDSHYPERSILC18 (250X4. 6mm, 5.0μm,Thermo);流动相是乙臆：甲醇=3:1 (v/v);洗脱 时间为lOmin;流速为lml/min;检测波长为476nm;进样量为20μ1 ;柱温为25°C。根据各 组分的色谱行为的光谱特性进行定性分析，根据不同浓度的虾青素标准品所绘制的标准曲 线方程计算样品中虾青素的含量。
[0043] ⑶虾青素标准曲线的绘制：将虾青素标品用乙腈甲醇溶液（3:1，v/v)溶解，配置 成100mg/l的标准储备液，然后使用乙腈甲醇溶液稀释，分别稀释成5mg/l、10mg/l、15mg/ 1、20mg/l、25mg/l、50mg/l、100mg/l。按照上述的液相条件进行测定，以奸青素浓度为横坐 标x，HPLC峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线。经计算，在5-100mg/l时，其线性方程为y= 3. 382-1. 178,R2= 0. 9996,说明虾青素在这个范围内线性良好，可用于虾青素含量的计算。
[0044] ⑷上述测定结果显示：虾青素含量如下：
[0045]
[0046] 本发明还提供一种以原藻株为出发藻株通过诱变处理筛选出的诱变藻株的方法， 步骤如下：
[0047] 1、诱变藻株的获得
[0048] 采用甲基磺酸乙酯（EMS)化学诱变，在无菌的BBM固体培养基（250mg/L硝酸钠、 175mg/L磷酸二氢钾、75mg/L磷酸氢二钾、75mg/L七水硫酸镁、25mg/L二水氯化|丐、2511^凡 氯化钠、50mg/LEDTA、31mg/L氢氧化钾、4. 98mg/L七水亚硫酸铁、11. 42mg/L硼酸、8. 82mg/ L七水硫酸锌、1. 44mg/L四水氯化猛、0. 71mg/L三氧化钼、1. 57mg/L无水硫酸铜、0. 49mg/ L六水硝酸钴、1. 5%的琼脂，pH8. 0左右）上平板涂布，筛选生长速度快，藻落大的单藻落。 经过生长速率的测定，虾青素产量的验证。结果筛选出生长速率快且虾青素产量高的藻株 TUSTE16。
[0049] 2、以下描述诱变藻株TUSTE16的形态
[0050] ⑴形态特征
[0051] 所述的雨生红球藻（Haematococcuspluvialis)TUSTE16具有典型的绿藻门团 藻目的特征性结构。在无菌的BBM液体培养基中，适宜条件下培养时，其营养细胞大小约 10-25μm，近圆形，绿色，有鞭毛，扫描电镜观察细胞壁有明显的缺损（参见图1)。接种后1 天进入对数生长期。在营养生长后期，将细胞接入等盐度的氮、磷、硫缺失的BBM培养基进 行胁迫培养细胞逐渐停止生长，运动细胞由绿色经黄色变成深红色最后变成红褐色，此时 细胞明显变大，约为25-35μm，扫描电镜观察细胞壁仍有明显的缺损（参见图2)。细胞内 色素颗粒由细胞核周围向四周扩散直至占据细胞的绝大部分区域，鞭毛消失，整个细胞要 比原藻株红。
[0052] ⑵培养特征：
[0053] 最适培养温度为24°C，最适光照强度为1200Lux，光照时间为全天，在BBM、BG-11 等自养培养基中生长。
[0054] ⑶生理生化性质
[0055] ①培养温度：在18-33°C，最适温度为24°C;
[0056] ②光照强度：在1000-2500Lux，最适光强为1200Lux;
[0057] ③光照时间：全天
[0058] 3、诱变菌株TUSTE16的生长速率的测定：
[0059] ⑴培养基为BBM培养基，藻种的接种量由细胞的0D值为标准，实验中采取0D669在 0. 240左右。
[0060] ⑵每5天取一次样，用紫外分光光度计测其0D669，以公式μ= (lnNt-lnN(j)/(t-t。） 计算生长速率（μ为生长速率），Nt为t时间的0D669,N。为起始时0D669。
[0061] ⑶测得诱变藻株TUSTE16的比生长速率比原藻株有提高，并且显微镜观察其生长 初期细胞形态与原藻株相似，很快进入指数生长期。诱导虾青素积累后，细胞相比原藻株更 快的变红。
【主权项】
1. 一种雨生红球藻高产虾青素的方法，其特征在于：步骤如下： ⑴先在带有遮阳网的管道或者塑料袋中进行高密度培养，温度为18-33°c，光照强度为 1000-2500Lux，培养5-8天，待藻细胞进入稳定期； ⑵接入跑道池中培养，跑道池中为BBM完全培养基，用于进一步扩大培养藻细胞，培养 至待细胞密度不再继续升高； ⑶将跑道池中藻细胞收集接入等盐度的氮、磷、硫缺失的BBM培养基进行胁迫培养，用 于雨生红球藻虾青素的积累，培养温度为18-33Γ，光照强度为无遮挡太阳光，太阳光强度 在lOOOOLux以上； ⑷在3到5天胁迫培养后，细胞颜色不再加深，细胞体积不再继续增大，鞭毛脱落丧失 游动能力，即可收集细胞，然后破碎，提取虾青素。2. 根据权利要求1所述的雨生红球藻高产虾青素的方法，其特征在于：所述细胞收集 方法是：将跑道池中的藻细胞抽入到铺有双层滤布的培养池中。第一层300目滤布用来除 虫，第二层1000目滤布用来收集细胞，滤液通过培养池底部流出培养池，藻细胞留在滤布 上，随后添加一定体积等盐度的氮、磷、硫缺失的BBM培养基进行胁迫培养。3. 生长速率快且虾青素产量高的雨生红球藻的诱变方法，其特征在于：所述的诱变方 法的步骤是： ⑴取适量培养至对数期的雨生红球藻藻液，离心收集用磷酸缓冲液洗涤两次，然后在 藻悬液内加入甲基磺酸乙酯，避光并使该藻细胞与其接触4h; ⑵加入lml5%的硫代硫酸钠终止诱变反应，离心去除诱变液，用新鲜营养液洗涤两 次，避光12h后置于光照条件下培养； ⑶将诱变处理后的藻株接种于固体培养基上，筛选培养基上生长快速且藻落较大的藻 株，即得到生长速率快且高产虾青素的诱变藻株。4. 根据权利要求3所述的生长速率快且虾青素产量高的雨生红球藻的诱变方法，其特 征在于：所述的诱变藻株在BBM、BG-11等自养培养基中良好生长。5. 根据权利要求3所述的生长速率快且虾青素产量高的雨生红球藻的诱变方法，其特 征在于：经过胁迫培养后，其虾青素的含量可达干重的5%以上，生长速率比原藻株提高达 30%以上，生理生化特性稳定，具有稳定遗传性能。
【专利摘要】本发明涉及一种雨生红球藻高产虾青素的方法，⑴稳定期培养；⑵扩大培养藻细胞，培养至待细胞密度不再继续升高；⑶胁迫培养，用于雨生红球藻虾青素的积累，培养温度为18-33℃，光照强度为无遮挡太阳光，太阳光强度在10000Lux以上。本发明提供的高产虾青素的方法中在高光条件下使用等盐度的氮、磷、硫缺失的BBM培养基进行胁迫培养，可以更大限度的增加虾青素的产量，而且使用双层滤布过滤，既可以去除培养过程中引入的虫害，又方便培养末期雨生红球藻细胞的采收。
【IPC分类】C12R1/89, C12N15/01, C12P23/00
【公开号】CN105420332
【申请号】CN201510908701
【发明人】吕和鑫, 夏锋, 崔相敢, 韩培培, 王世磊, 贾士儒
【申请人】天津科技大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月10日