驯化促进雨生红球藻生长和虾青素积累的方法
【技术领域】
[0001]本发明是关于生物活性保健品开发技术领域，特别涉及烟气0)2驯化促进雨生红球藻生长和虾青素积累的方法。
【背景技术】
[0002]虾青素是目前已知的自然界最强的抗氧化剂，其抗氧化性是维生素C的6000倍，维生素E的1000倍，茶多酚的200倍，葡萄籽提取物的50倍。虾青素可以增强机体的抗衰老、消炎、抗紫外线和免疫功能，因此，被用于保健品、化妆品、食品和饲料添加剂等多种功能产品中。自然虾青素来源中，雨生红球藻的虾青素含量最高，约占其干重的1-5 % (Minxi Wana，2014)，并且，其所含虾青素的结构与生物体所需虾青素结构一致，这是合成虾青素和其他天然虾青素所不能比拟的，被公认为天然虾青素最好的生物来源，是目前投入虾青素商业化应用的唯一藻类。然而，雨生红球藻生长缓慢，比生长速率约为0.15/d-0.64/d(0rOsa，2005 ；Kaewpintong, 2006 ； Imamoglu ,2010) 0缓慢的生长速率带来其它藻类入侵、原生动物污染等多种问题，是雨生红球藻大规模生产中存在的主要难题。
[0003]由于空气中低浓度⑶2在水中的传质速率较低，微藻养殖40%的能耗用于空气栗持续提供空气维持微藻生长，而利用烟气高浓度CO2养殖微藻，不仅可以将微藻养殖的能源投入降低70%(Lam et al，2012)，还可以促进微藻生长和虾青素积累。借助平板反应器、连续管式反应器等，雨生红球藻对2 %~5%高浓度⑶^^的固碳效率可达到13.55 % to49.15%,生物质和虾青素产量显著提高(1^呢，2010;1^6，2015;6丨3111^11丨，2015;1^31^!^，2015)。以5%⑶2为碳源培养雨生红球藻可将虾青素的产量提高至175.7mg/l，是以醋酸盐为碳源的异养培养的2.7倍(Kang等，2005)。此外，高浓度的CO2可以代替缺氮培养基和醋酸盐培养基诱导虾青素的合成和积累，降低成本。向蒸馏水中间歇性通入纯二氧化碳可促使虾青素积累，其含量与缺氮培养基中虾青素含量相近(Imamoglu，2009)。但是，在燃煤电厂烟气的高浓度(12?15% )C02条件下，雨生红球藻生长会受到抑制。Cheng等人(2016)利用高浓度CO2培养雨生红球藻核诱变突变藻株发现，当⑶2浓度由空气提高至6%，生物生产力提高了82%。但是，当⑶2浓度提高至10%以上时，雨生红球藻的生长受到抑制。Yin等人(2015)将20%CO2通入生物膜反应器中培养雨生红球藻发现其生物量比1.5%CO2降低了 15 %，虾青素含量降低了40%，将直接导致工业生产时间的延长和生产效益的降低，所以，如何利用燃煤电厂烟气CO2提高雨生红球藻的生长速率和虾青素产量仍是一个技术难题，如果能有所突破将对提高虾青素生产效率和降低生产成本具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用燃煤电厂烟气CO2驯化提高雨生红球藻生长速率和虾青素含量的方法。为解决上述技术问题，本发明的解决方案是:
[0005]提供烟气0)2驯化促进雨生红球藻生长和虾青素积累的方法，燃煤电厂烟气中含有12?15%的高体积浓度C02，所述烟气0)2驯化促进雨生红球藻生长和虾青素积累的方法具体包括下述步骤:
[0006](I)按10?20%的接种量将雨生红球藻液体接种到400ml液体BG-1l培养基中，然后将接种后的培养基置于光合反应器中，再向光合反应器中通入体积浓度为6%的高浓度CO2气体，在气体流量为60ml/min、光照强度为3000?3500Lux、温度25?28°C的条件下，培养4?6天；
[0007]然后，将上述以体积浓度为6%的⑶2培养后的藻株，以10?20%的接种量转接入新的液体BG-1I培养基中，然后通入体积浓度为10 %的高浓度CO2气体，在气体流量为60ml/min、光照强度为3000?3500Lux、温度25?28°C的条件下，培养4?6天；
[0008](2)取步骤(I)中在以体积浓度为1 %的CO2气体中培养4?6天后的藻液，以1?20%的接种量转接入新的液体BG-1I培养基中，然后将接种后的培养基置于光合反应器中，再向光合反应器中通入C02体积浓度为12?15%的燃煤电厂烟气，在气体流量为60ml/min、光照强度为3000?3500LUX、温度为25?28 °C的条件下，连续培养5?10代，即获得在燃煤电厂烟气条件下快速生长的目标藻株；
[0009 ] (3)取对数生长期的目标藻株，以1?20 %的接种量接种到400ml液体BG-11培养基中，然后将接种后的培养基置于光合反应器中，再向光合反应器中通入CO2体积浓度为12?15%的燃煤电厂烟气促进藻株生长，在气体流量为60ml/min、光照强度3000?3500Lux、温度为25?28°C的条件下，培养目标藻株7?10天，能通过测量藻细胞个数计算生长速率；
[0010](4)将步骤(3)培养结束后的目标藻株，置于高光照强度7500?lOOOOLux下继续培养，并持续通入CO2体积浓度为12?15%的燃煤电厂烟气胁迫提高藻株中的虾青素含量，培养条件为:气体流量为120ml/min、培养温度为25?28°C，培养10?15天后，将藻液离心和冷冻干燥后，即得到雨生红球藻干藻粉，能测量评价雨生红球藻粉的生物质干重和虾青素含量。
[0011]在本发明中，所述光合反应器采用容积为600ml的圆柱光合反应器。
[0012]在本发明中，所述液体BG-1l培养基的成分组成为:1.5g/L NaN03、0.2g/L Na2C03、0.075g/L MgS04.7H20、0.4g/L K2HP04、0.036g/L CaCl2.2H20、2.2 X 10—4g/L ZnSO4.7H20、1.8X10—3g/L MnCl2.4H20、2.1X10—5g/L NaMoOh0.8 X 10—5g/L C11SO4.5H20、2.8X10-3g/L H3BO3、0.001g/L EDTA、0.006g/L柠檬酸。
[0013]在本发明中，所述步骤(3)中，生长速率的测定计算方法为:
[OOM]每隔24h取2mL藻液，向藻液中加入0.2mL鲁哥试剂，震荡摇勾，制片，在光学显微镜下观察，利用血球计数板计数，计算藻细胞数N(个/mL)再利用公式μ= (InN2-1n Ni)/(t2-)计算细胞平均生长速率，作为生长速率；
[0015]其中，μ为细胞平均生长速率为第&天时的藻细胞数(个/mL)，N2为第t2天时的藻细胞数(个/mL)。
[0016]在本发明中，所述步骤(4)中，生物质干重M(g/L)的测定方法为:
[0017]取1mL藻液以SOOOrmp离心10分钟，去上清液，用蒸馏水冲洗获得的藻泥两次，再将藻泥离心脱水后置于_70°C下冷冻24小时后，放入低温真空干燥仪中干燥24小时，对所得藻粉称重并计算生物质干重M(g/L)。
[0018]在本发明中，所述步骤(4)中，虾青素含量的测定方法采用高效液相色谱法(HPLC)。具体为:取1mL藻液，8000rmp离心10分钟，去除上清液，将藻泥置于-70°C冷冻24小时后，放入低温真空干燥仪中干燥24小时;将冷冻干燥所得的藻粉置于15ml分散机试管中，加入5mL甲醇-二氯甲烷混合溶液(25:75，v/v)，在5500rmp均质研磨萃取2分钟，所得混合液在SOOOrmp离心5分钟，取上清液，反复萃取至藻渣无色;将反复萃取后留存的含有虾青素的上清液混合，并用甲醇-二氯甲烧混合溶液定容至25mL；取5mL混合液，加入ImL 0.05mol/LNaOH-甲醇溶液，于室温、暗光、氮气环境下进行皂化反应(至少8小时)；反应产物用氮吹仪定容至5mL，用0.45μπι滤膜过滤，滤液用于高效液相色谱(HPLC)测定虾青素含量;HPLC工作条件如下:流动相为A水、B甲醇、C异丙醇、D乙腈，洗脱梯度为:Omin，20 % A、50 % B、30 % D;511^11，20%厶、50%8、30%0;1511^11，60%8、10%(:、30%0;流速为11111/11^11;取47611111波长下的虾青素吸收峰面积，依据虾青素含量与峰面积对应的标准曲线计算虾青素浓度Dast(mg/L);则干藻粉中好青素含量的计算方法如下:(^(11^/^)=0331；(11^/1)/]\^/1)，其中1(8/1)为藻液烘干后的生物质干重。
[0019]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0020]本发明采用燃煤电厂烟气高浓度(12?15%)0)2驯化雨生红球藻，显著提高了生长速率和虾青素产量，其生长速率比空气条件下提高了47 %，虾青素含量提高了 25%。这是由于利用烟气高浓度C02使雨生红球藻的光合作用关键固碳酶Rubisco表达上调，促进了卡尔文循环和光合生长效率;光捕获叶绿素a/b结合蛋白的表达量上升，提高了光能利用效率;叶绿素合成效率提高，ATP合成酶表达上调，从而提高了生长速率。本发明在虾青素合成阶段，烟气高浓度CO2为油脂合成提供了充足的碳源，为虾青素酯化和存储提供了有利条件。
【附图说明】
[0021]图1为本发明的工艺流程图。
【具体实施方式】