专利名称：富硒红球藻粉的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及富硒红球藻制品，更具体涉及一种富硒红球藻的生产方法，该制品富
含具有抗氧化、抗衰老、抗病毒等特性的有机硒化合物。本发明还涉及一种富硒红球藻制品在食品、各类保健品和药品中的应用。
背景技术：
硒(selenium, Se)是人体及动物生长发育所必须的微量元素，是1817年由瑞典化学家Berzelius发现并命名。在20世纪40年代前，硒_直被认为是一种有毒致癌物质。直到1957年Schwarz和Foltz发现硒是有效预防肝坏死的第三因素，从而证实了硒是动物及人体必需的营养元素，硒在营养学方面的意义得到重视。1973年美国Robruck等确定硒是谷胱甘肽氧化酶(GPX)的辅助因子，它和维生素E—道能防止不饱和脂肪酸氧化生成有害的氧化物。这种抗氧化特性具有清除生物机体内自由基的作用。如果缺硒，机体内的某些代谢过程就会受阻，致使大量自由基积累而引发各种疾病。进一步研究发现，硒还具有增强机体免疫力、保护心血管、抗肿瘤、抗衰老、调节代谢等功能。 雨生红球藻属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属，是一种单细胞真核生物。其藻细胞能大量累积虾青素。天然虾青素具有特殊的分子结构，体外实验发现它是单线态氧的强大淬灭剂，具有清除氧自由基的强大能力，是一种极有效的抗氧化剂。在雨生红球藻活细胞内，它作为光保护剂和强抗氧化剂，能够淬灭由强光和过度氧化产生的多种活性氧，防止活性氧对细胞的伤害。天然虾青素比角黄素(canthaxanthin) 、 P-胡萝卜素(13-carotene)和玉米黄素(zeaxanthin)能更有效地阻止不饱和脂肪酸甲酯的过度氧化，其抗氧化活性是维生素E的550倍，被誉为"超级抗氧化剂"。 富硒雨生红球藻除了含有丰富的营养组分和天然虾青素外，还具有大量的硒蛋白，由于硒蛋白的抗氧化机制与天然虾青素存在区别，所以当两者结合后的生物学活性具有协同效应，这就是本发明制备富硒红球藻的理论基础。由于硒的缺乏常常会导致动物及人体产生各种疾病(如克山病、大骨节病等)，而普通食物中硒含量较低，通过一定途径补充硒是非常必要的。由于无机硒具有毒性且细胞吸收缓慢，通过食用富硒红球藻中的有机硒是最好的补硒途径之一。另一方面，红球藻中含有的天然虾青素也是人体及动物所必须且体内不能合成，必须从食物中摄取，因此富硒雨生红球藻在食品、保健品和药品制备中具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富硒红球藻的制备方法，该方法制得的富硒雨生红球藻有机硒含量达到99%以上，与其藻细胞累积的天然虾青素协同作用，是富硒红球藻具有超强的抗氧化特性。 本发明的另一个目的是在于提供了一种富硒红球藻产品在食品、保健品和药品中的应用。由于有机硒和红球藻中的天然虾青素是许多食品、保健品和药品中的有效成分，他们最大的特点是易被氧化，而红球藻作为载体具有保护作用，能在常温条件下加入到食品、保健品和药品中，通过人体和动物的消化系统吸收利用。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施
—种富硒红球藻粉的制备方法，其步骤是 A、筛选硒耐受性强、硒蛋白和虾青素含量高、生长快速的雨生红球藻新品系由于雨生红球藻是一种具有鞭毛的单细胞真核藻类，其对无机硒的耐受性较弱。 一般的藻种只能在含有较低浓度亚硒酸盐的培养基中生长，生产出的富硒红球藻产品的含硒量较低。本发明利用理化诱变和分子生物学育种技术，筛选出对无机硒耐受性强、硒蛋白和虾青素含量高、生长快速的雨生红球藻新品系。 B、在温度22-30°C、 pH 6. 5-7. 0、光照1000-3000勒克斯以上，利用红球藻培养基(如改良的BBM等)进行培养2-15天。 C、根据雨生红球藻品种对硒耐受性的不同，可以采用接种培养基(如BBM等)中
直接加硒或当藻细胞达到一定生物量(如进入对数期或平台期)后加入无机硒的方法，其
培养基中无机硒的浓度可以是低浓度(10-30mg/L)或高浓度(200-500mg/L)。 D、藻细胞连续培养12-15天后，通过过滤或离心的方法采收，并用清水或清洗液
冲洗新鲜藻泥，洗去藻细胞表面的无机硒。利用烘干、喷雾干燥或冷冻干燥等方法获得富硒
雨生红球藻藻粉。该发明制备的富硒雨生红球藻藻粉硒化合物含量介于10-2000 ii g/g，其
中有机硒含量可达到99%以上。 —种富硒红球藻产品在食品、保健品和药品中的应用，可以直接将富硒红球藻粉直接添加到食品、保健品和药品中，也可以从富硒红球藻中提取有机硒化合物和虾青素，然后加入到食品、保健品和药品中。本发明以富含天然虾青素和各种营养成分的雨生红球藻作为硒的生物载体，开发出集有机硒、虾青素、藻蛋白、藻多糖等于一体的富硒雨生红球藻，作为食品、保健品或药品的添加剂。可以作为生物体所必须的硒蛋白来源，也可以与其它含硒组分联合使用。在食品、保健品、预防或治疗药品中可以作为营养补充剂或抗氧化剂或其它功能成分。除了上述应用范围外，本发明也可用于其他类型的富硒产品(如饮料、面粉、中成药、化妆品等)。 本发明的主要特点在于(1)硒蛋白具有预防癌症和由R0S引起的疾病的功效，天然虾青素比能更有效地阻止不饱和脂肪酸甲酯的过度氧化，被誉为"超级抗氧化剂"。尽管两者有类似的作用效果，但其在生物体内的作用机制存在差异，两者的结合表现出协同的生物学效应，这是本发明的重要创新点之一 ；(2)雨生红球藻是一类单细胞真核绿藻，是自然界含天然虾青素最高的生物类群，已有大量研究表明，雨生红球藻具有重要的食用、药用价值，其安全性已得到证明。(3)本发明采用在培养基中加入无机硒(如亚硒酸钠等)，藻在生长过程中，细胞内累积大量的硒蛋白，洗脱掉吸附于细胞表面的无机硒后，富硒雨生红球藻产品有机硒含量占99%以上，其食用安全性大大提高。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明
实施例1 : 富硒雨生红球藻的制备方法，其步骤包括
A、筛选无机硒耐受性强、硒蛋白和虾青素含量高、生长快速的雨生红球藻新品系。利用野生雨生红球藻或通过上述途径获得的雨生红球藻新品系。 (1)紫外线诱变是最为常用的物理诱变剂之一。根据波长将紫外线分为UVA、UVB、 UVC三种，其波长分别为320-400nm、280-320nm、100-280nm，但对诱变有效的范围仅是200-300nm，其中以260nm左右的效果最好。紫外线的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上的两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。经紫外诱变处理后的藻株要暗处理后，再进行光照培养。所述藻株经诱变后进行暗处理是因为紫外线辐射引起的DNA损伤可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚
体解开恢复原状。 将20W的紫外灯打开，预热20分钟，使紫外灯发出的波长处于稳定状态后，分别取处于对数生长期藻液6mL，置于小培养皿内，在磁力搅拌下，在距离紫外灯30cm处进行照射，时间分别为3、4、5分钟，各重复3次。 取5mL紫外照射处理后的藻液接种到装有20mL培养液的50mL小锥形瓶中，遮光3小时以避免光修复，再重新放回到光照培养箱中培养3天，血球计数法对藻细胞进行计数，并计算出致死率，选择致死率在50% _80%的处理，进行双层平板分离，挑取生长快、体积较大的克隆，接种于25mL小锥形瓶(BBM培养基10mL)中培养。将能够达到正常生长状态的克隆分别接种至250mL锥形瓶(BBM培养基100mL)中继续培养。以野生型为对照，测定并比较不同突变株系的生长速率、硒难受性、虾青素与硒蛋白含量，并进行形态学观察，筛选对无机硒耐受性强、硒蛋白和虾青素含量高、生长快速的雨生红球藻突变株，每10天继代培养一次，共4次，突变株表现特性稳定的克隆，即为新的突变株系。
(2)化学诱变方法。化学诱变成功与否的关键是采用与诱变对象最适合的化学诱变剂以及最恰当的诱变技术。常用的化学诱变剂有碱基类似物(如5-溴尿嘧啶等)、烷化剂(如甲基甲烷碘酸、氮芥等)、移码突变剂(如吖啶类试剂)、脱氨剂(如羟胺、亚硫酸盐等)，其中以烷化剂的诱变效果最好且应用最广泛。烷化剂一般具有一个或多个活性烷基，它们易于取代DNA分子中活泼的氢原子，直接与一个或多个碱基起烷化反应，从而改变DNA的分子结构，引起突变。1-甲基_3-硝基-1-亚硝基胍(简称亚硝基胍，NTG、 NG或MNNG)是最常用也是最有效的烷基诱变剂，有超级诱变剂之称，一次处理能使细胞发生一次或多次突变。还能使多基因并发突变，在复制叉附近一个基因突变能诱发临近位置的基因陆续连锁突变。 取对数期藻液4mL， 4000rpm， 25°C ，离心5min，弃上清液，加入pH值6. 5的无菌磷酸钾缓冲液5mL，洗涤三次，定容，加入NTG溶液，使终浓度分别为1. Og/L和2. Og/L，各3次重复，于25t:水浴中处理30分钟，加入等量的硫代硫酸钠终止反应。 处理过的藻液用无菌去离子水洗涤三次，彻底去掉NTG溶液，最后重新接种到BBM培养基中，遮光处理12小时，再于光照培养箱中培养。稀释后的雨生红球藻液采用与紫外线诱变相同的方法进行双层平板分离单克隆、硒难受性等生物学特性检测和突变株的筛选。 通过上述两种诱变方法，筛选得到硒耐受性强、硒蛋白和虾青素含量高、生长快速的雨生红球藻新品系。 B、在温度22-30°C、 pH 6. 5-7. 0、光照1000-3000勒克斯以上，利用红球藻培养基(如改良的BBM等)进行培养2-15天。 C、根据雨生红球藻品种对硒耐受性的不同，可以采用接种培养基(如BBM等)中直接加硒或当藻细胞达到一定生物量(106-109CellS/mL)后加入无机硒的方法，其培养基中无机硒的浓度可以是低浓度(10-30mg/L)或高浓度(200-500mg/L)。
D、藻细胞连续培养2-15天后，通过过滤或离心的方法采收，并用清水或清洗液冲洗新鲜藻泥，洗去藻细胞表面的无机硒。利用烘干、喷雾干燥或冷冻干燥等方法获得富硒雨生红球藻藻粉。该方法制备的富硒雨生红球藻藻粉硒化合物含量介于10-2000 g/g，其中有机硒含量可达到99%以上。
实施例2 ; —种富硒雨生红球藻的生产流程包括下面几个方面内容 ①固体或液体保持培养的藻种接种到改良的BBM液体培养基，培养到对数期后，进行分级(2-3级)扩大培养，以达到大规模生产所需要的雨生红球藻生物量。
②雨生红球藻在温度22-30°C、 pH 6. 5-7. 0、光照1000-3000勒克斯以上，利用红球藻培养基(如BBM等)进行培养。其培养基的主要成分包括75mg/L K2HP04，175mg/L KH2P04，250mg/L NaN03，25mg/L NaCl，75mg/L MgS04 7H20， 25mg/LCaCl2. 2H20，3ml/L Fe-EDTA， lml/L A5微量元素[金传荫，宋立荣，刘永定等红球藻水生748株(Haematocococcus sp. HB748)培养基的选择与对维生素的需求[J]应用与环境生物学报，1997,3(2)177-179]。 ③根据雨生红球藻不同品系对硒耐受性的不同，采用直接将藻接种在加无机硒的BBM培养基或采用当藻细胞达到一定生物量(如106-109cells/mL)后加入无机硒到BBM培养基中的方法，其BBM培养基中无机硒的浓度可以是低浓度(10-30mg/L)或高浓度(200-500mg/L)。藻细胞连续培养12-15天后，通过过滤或离心的方法采收，并用清水或清洗液冲洗新鲜藻泥，洗去藻细胞表面的无机硒。 ④利用烘干、喷雾干燥或冷冻干燥等方法获得富硒雨生红球藻藻粉，并采用氢化
物原子荧光光谱法测定硒含量。 实施例3 :富硒雨生红球藻在食品中的应用 按实施例2方法制备的富硒雨生红球藻粉，经过纳米粉碎机粉碎后，加入制作面包、面条、饮料的面粉或奶粉、咖啡等中，根据藻粉硒蛋白的含量确定食品中添加富硒雨生红球藻粉的比例(1-50% )，经混合均匀后，按面包、面条、饮料等食品的常规加工方法制得含富硒雨生红球藻的食品。 实施例4 :富硒红球藻在保健品中的应用 按实施例2方法制备的富硒雨生红球藻粉，经过纳米粉碎机粉碎，在粉碎后的富
硒雨生红球藻粉中加入纤维素等片剂辅料(藻粉辅料=1 : 3)，利用传统方法混合压縮
成片剂或利用传统的软硬胶囊制备方法做成富硒雨生红球藻胶囊。制得的片剂和胶囊具有
抗氧化、抗衰老等保健作用。 实施例5 :富硒红球藻在药品中的应用 按实施例2方法制备的富硒雨生红球藻粉，利用高压液相色谱、氢化物原子荧光光谱法检测虾青素和硒蛋白的含量。藻粉直接用于药品制备或与其它组分混合后制备药品，或将藻粉中的硒蛋白、虾青素等有效成分利用传统方法提取出来后，应用于药品制备。将富硒雨生红球藻粉中的虾青素和硒蛋白加入治疗黄斑衰退药物、抗癌药物、抗衰老药物、维生素E替代药物、抗病毒药物等。
权利要求
一种富硒红球藻粉的制备方法，其步骤是A、筛选硒耐受性强、硒蛋白和虾青素含量高、生长快速的雨生红球藻新品系藻种在红球藻培养基中生长，利用理化诱变和分子生物学育种技术，筛选出对无机硒耐受性强、硒蛋白和虾青素含量高、生长快速的雨生红球藻新品系；(1)紫外线诱变为物理诱变剂之一，根据波长将紫外线分为UVA、UVB、UVC三种，其波长分别为320-400nm、280-320nm、100-280nm，对诱变有效的范围是200-300nm，紫外线的作用是使DNA双链之间或同一条链上的两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的配对，引起突变；经紫外诱变处理后的藻株要暗处理后再进光照培养，将20W的紫外灯打开，预热20分钟，紫外灯发出的波长处于稳定后，分别取处于对数生长期藻液6mL，置于小培养皿内，在磁力搅拌下，在距离紫外灯30cm处进行照射，时间分别为3、4、5分钟，各重复3次；取5mL紫外照射处理后的藻液接种到装有20mL培养液的50mL小锥形瓶中，遮光3小时以避免光修复，再重新放回到光照培养箱中培养3天，血球计数法对藻细胞进行计数，选择致死率在50％-80％的处理，进行双层平板分离，挑取生长快、体积的克隆，接种于25mL小锥形瓶中培养，将正常生长状态的克隆分别接种至250mL锥形瓶中继续培养，每10天继代培养一次，共4次，突变株表现特性稳定的克隆，并进行硒难受性、硒蛋白和虾青素含量等特性检测，筛选得到稳定的突变株系；(2)化学诱变方法采用与诱变对象的化学诱变剂，化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂、移码突变剂、脱氨剂、羟化剂，烷化剂有一个或活性烷基，它们易于取代DNA分子中活泼的氢原子，直接与一个或碱基起烷化反应，改变DNA的分子结构，引起突变，1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍，一次处理使细胞发生一次或突变，使基因并发突变，在复制叉附近一个基因突变能诱发临近位置的基因陆续连锁突变；取对数期藻液4mL，4000rpm，25℃，离心5min，弃上清液，加入pH值6.5的无菌磷酸钾缓冲液5mL，洗涤三次，定容，加入NTG溶液，使终浓度分别为1.0g/L和2.0g/L，各3次重复，于25℃水浴中处理30分钟，加入等量的硫代硫酸钠终止反应；处理过的藻液用无菌去离子水洗涤三次，去掉NTG溶液，最后接种到BBM培养基中，遮光处理12小时，再于光照培养箱中培养，稀释后的藻液采用与紫外线诱变相同的方法进行双层平板分离单克隆，进行硒难受性、硒蛋白和虾青素含量等生物学特性检测，筛选得到稳定的突变株系；B、将筛选得到的目标藻株在温度22-30℃、pH 6.5-7.0、光照1000-3000勒克斯，利用红球藻培养基进行培养2-15天；C、根据雨生红球藻品种对硒耐受性的不同，采用接种培养基中直接加硒或当藻细胞达到生物量后加入无机硒的方法，其培养基中无机硒的浓度是低浓度10-30mg/L或高浓度200-500mg/L；D、藻细胞连续培养2-15天后，通过过滤或离心的方法采收，并用清水或清洗液冲洗新鲜藻泥，洗去藻细胞表面的无机硒，利用烘干、喷雾干燥或冷冻干燥方法获得富硒雨生红球藻藻粉。
2. 权利要求1所述的一种富硒雨生红球藻藻粉在制备食品中的应用。
3. 权利要求1所述的一种富硒雨生红球藻藻粉在制备保健品中的应用。
4.权利要求1所述的一种富硒雨生红球藻藻粉在制备药品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种富硒红球藻粉的制备方法及应用，其步骤A、筛选无机硒耐受性强、硒蛋白和虾青素含量高、生长快速的雨生红球藻新品系；B、在一定温度、pH值、光照下，利用红球藻培养基进行培养；C、根据雨生红球藻品种对硒耐受性的不同，采用接种培养基中直接加无机硒或当藻细胞达到一定生物量后加入不同量的无机硒，配制高浓度含硒培养基或低浓度含硒培养基；D、藻细胞连续培养后，通过过滤或离心的方法采收，并用清水冲洗新鲜藻泥，洗去藻细胞表面的无机硒。烘干、喷雾干燥或冷冻干燥获得富硒雨生红球藻藻粉。制备的富硒雨生红球藻藻粉硒化合物含量介于10-2000μg/g，有机硒含量达到99％以上。富硒红球藻制品可在制备食品、保健食品和药品中应用。
文档编号A23L1/337GK101715986SQ20091027287
公开日2010年6月2日 申请日期2009年11月20日 优先权日2009年11月20日
发明者胡章立, 高彦东 申请人:深圳大学