专利名称：藻体内叶黄素的保存方法
技术领域：
本发明涉及一种叶黄素、特别是含有虾青素的藻体内叶黄素的保存方法。另外，本发明涉及一种提高叶黄素在含叶黄素的干燥藻体内的保存稳定性的方法。
背景技术：
叶黄素(如虾青素、角黄素、玉米黄质、阿多尼如宾(adonirubin)、金盏花黄质、隐黄质等)是一种类胡萝卜素，具有多种用途。例如，已知虾青素是红色的类胡萝卜素一种，具有极强的抗氧化作用。因此被用作鱼类等的重染用饲料、食用色素、化妆品、保健食品等。作为含有虾青素的饲料，例如将法夫酵母经过氢氧化钠处理而生产出的饲料(专利文献1)；将藻体粉碎后，经过冷冻干燥再研成粉末而生产出的饲料(专利文献2)。
虾青素或通过化学合成得到，或从磷虾、甜虾等虾类以及法夫酵母、藻类等天然物质提取。在提取虾青素的情况下，由于磷虾、甜虾、螃蟹等甲壳类，法夫酵母等虾青素的产量少，所以收率非常低。因此，一般地是从虾青素含量高的藻类，如从红球藻属的绿藻内提取虾青素。
虾青素相对热、氧、光等不稳定，因而，不能直接保存藻体的培养液。为此，多数情况下是在藻体培养后立即进行虾青素的提取(例如，参照专利文献3和4)。这种情况下，必须将培养设备和提取设备安置在同一场所。在一次培养了大量藻体的情况下，需要暂时保存培养液或者提取液，为了防止虾青素的氧化及分解，必须将其在氮气环境下遮光、低温保存。再则，还要防止因细菌繁殖等而产生的腐烂。这样，还必须增添保存设备，涉及到提取工序的成本增加。
为了解决上述问题，行之有效的办法是，使含有虾青素的藻体干燥。专利文献5刊载的方法是，将含有类胡萝卜素的藻体干燥，将其在食用植物油中粉碎。专利文献6也刊载了使含有虾青素的藻体干燥的方法。但是，在专利文献5及专利文献6中，并没有对虾青素自身相对干燥时的热、氧、光等条件的稳定性进行讨论。例如，通过本发明者的研究证明，使用专利文献6记载的干燥方法单单对藻体进行干燥的情况下，藻体内的虾青素分解，虾青素含量降低。
另外，也曾有人开发了一种方法，就是把藻体破碎物与各种添加物混合在一起，制作成粉状混合物，由此来提高虾青素的长期保存性(专利文献7)。但是，就这种方法而言，由于必需表面活性剂、抗氧化剂等添加物，所以提高了成本，或者由于含有表面活性剂，在提取物中混入这些添加物，必须将其去掉，因而不理想。
如上所述，在本发明之前，还没有一种保存方法，通过简单的手段使得叶黄素类在藻体内长期且稳定地得以保存。
特开平6-105657号公报[专利文献2]特开平3-83577号公报[专利文献3]特开平9-111139号公报[专利文献4]特开昭53-38653号公报[专利文献5]特开平7-8212号公报[专利文献6]特开2004-129504号公报[专利文献7]国际公开第2002/077105号小册子[非专利文献1]佐藤恭子等，日本食品卫生杂志，39卷，6号，368～374页，1998年发明内容本发明的目的在于，提供一种含叶黄素藻体内叶黄素的保存方法，由此提供提高含叶黄素的干燥藻体内的叶黄素，特别是虾青素的保存稳定性的方法。
本发明提供一种藻体内叶黄素的保存方法，该方法包含培养含叶黄素的藻体后、回收的工序，和对该回收的藻体进行干燥使水分含量为3质量％以下的工序。
本发明还提供一种提高含叶黄素干燥藻体内的叶黄素的保存稳定性的方法，该方法包含使该藻体干燥，使藻体中的水分含量为3质量％以下的工序。
在某实施方式中，无论对上述哪种方法，上述叶黄素是虾青素。
在另一实施方式中，无论对上述哪种方法，上述藻体是属于红球藻属的绿藻。
在进一步的实施方式中，无论对上述哪种方法，上述绿藻指的是雨生红球藻。
在另外的实施方式中，无论对上述哪种方法，上述干燥是通过喷雾干燥法来进行的。
在进一步的实施方式中，无论对上述哪种方法，上述喷雾干燥法是使用喷雾干燥装置来进行的，该喷雾干燥装置中，排风温度调整为125℃以上。
本发明还提供一种叶黄素的制造方法，该方法包含上述任一种提高叶黄素的保存稳定性的方法。
发明效果通过使用本发明的方法，能够在室温条件下(即无须冷冻或冷却保存)持久而稳定地保存含有叶黄素的干燥藻体内的叶黄素。用本发明的方法生产出来的含有叶黄素的干燥藻体，能够在室温下长期保存，适合用于叶黄素特别是虾青素的提取和精制加工。因此比如，能够将含虾青素藻体的培养工序和虾青素的提取、精制工序分开，能够有效且低成本地制造虾青素。再则，通过使用本发明的方法，可以使得高浓度虾青素的保存变得简单易行，因而提高了虾青素提取、回收的效率。特别是使用本发明的方法制造出的含有虾青素的干燥藻体，当被用作鱼类饲料时，由于饲料中的虾青素得以长期稳定地保存，因而提高了鱼类的重染效果。
图1是可用于本发明的方法的喷雾干燥装置模式2是表示各干燥藻体内的虾青素含量时效变化的图具体实施方式
(藻体)本发明所采用的藻体，只要是产生叶黄素的藻体则不特别限定。代表性地优选使用绿藻类，例如，属于红球藻属的单细胞藻类。红球藻属例如有雨生红球藻(H.pluvialis)、湖生红球藻(H.lacustris)、H.capensis、H.droebakensi、H.zimbabwiensis等等。
雨生红球藻(H.pluvialis)例如，NISE144株被保藏在独立行政法人国立环境研究所，UTEX2505株被保藏在美国德克萨斯大学的藻类保存设施，K0084株被保藏在丹麦哥本哈根大学的Scandinavian CultureCenter for Algae and Prtozoa，Botanical Institute等。
湖生红球藻(H.lacustris)例如有，保藏在ATCC的ATCC30402株以及30453株，保藏在东京大学分子细胞生物研究所的IAM C-392株、IAM C-393株、IAM C-394株以及IAM C-339株，或者还有UTEX 16株和UTEX 294株等。
H.capnsis例如有UTEX LB1023株等。
H.droebakensi例如有UTEX 55株等。
H.zimbabwiensis例如有UTEX LB1758株等。
在这些藻类中，优选使用雨生红球藻。
(含有叶黄素的藻体的培养)含有叶黄素的藻体，能够在产生叶黄素的条件下，通过培养上述藻体生产出来。对于产生叶黄素的条件并无特别限制。例如有如下方法，例如，在明亮的条件下，一边通入二氧化碳气体，一边使藻体的营养细胞在氮源及含有微量金属的培养基中繁殖，然后对繁殖后的藻体，通过单独或组合施于光照射等物理性应激、营养饥饿等生物学应激、过氧化氢和/或铁化合物等添加剂方面的化学物质应激等应激，促使营养细胞包囊化。另外，也可以添加醋酸等作为碳源进行暗培养，促使其营养繁殖，然后使其包囊化(例如可参照专利文献2和6)。
得到的藻体通过离心分离而回收，根据需要，经水洗过后，调整藻体浓度使其固态成分的浓度约为5～40％，优选浓度10～30％，附加以下详述的干燥工序。
在本发明中，所谓的叶黄素是指具有含氧官能团的类胡萝卜素的总称，非指特定的化合物。在本发明中，主要是指由藻体生产的叶黄素，这种叶黄素具代表性的有虾青素、角黄素、玉米黄质、阿多尼如宾、金盏花黄质、隐黄质等、这些物质的脂肪酸酯等。
(藻体的干燥)
含叶黄素藻体的干燥，以使干燥藻体内的水分含量为3质量％以下。如果干燥藻体内的水分含量超过3质量％，就会导致干燥藻体内的叶黄素在保存时分解，降低叶黄素的保存稳定性。
对于干燥方法无特殊限制。比如有下述干燥方法滚筒干燥(实例可参照国际公开第2000/057724号小册子)、热风干燥法(实例可参照特开2002-119252号)、冷冻干燥法(实例可参照美国专利第6163979号说明书)以及喷雾干燥法等。从防止叶黄素热分解的角度来分析，优选冷冻干燥法等低温干燥，但其不足之处是，干燥过程需要较长时间，干燥设备需要高成本投入等。在使用滚筒干燥法、热风干燥法或者喷雾干燥法的情况下，由于担心由于加热而叶黄素分解，所以要注意加热的温度和加热的时间。
藻体干燥时，为了防止藻体内的叶黄素(特别是脂肪酸酯)分解，优选尽可能低的温度条件，优选使藻体内的温度不超过100℃。在滚筒干燥法以及热风干燥法中，其加热温度一旦超过100℃，藻体内的温度有时会超过100℃。而且，由于被干燥的藻体颗粒一个个粒径都比较大，干燥时就需要一定的时间。鉴于此，在本发明中，优选采用喷雾干燥法。
喷雾干燥法，可以通过任意的喷雾干燥装置来实施。如图1模式性地显示典型的喷雾干燥装置。根据图1，下面对借助该喷雾干燥装置的对藻体的干燥工序加以说明。
含藻体的生料通过生料槽2送入喷雾干燥装置的主体1内。生料与压气机3喷出的压缩空气一起从喷雾器4的前端喷向主体1内。通过加热室5内的加热器6，向主体1内输送暖空气，以干燥被喷雾的藻体。向主体1内边喷雾干燥，边下落的藻体堆积在主体1内的斜面部7。在斜面部7设有冲击锤8，其作用在于提供冲击以使该堆积物落下。在流路9的末端设有风扇10，借助风扇10的运转，将加热器6产生的暖空气从加热室5导入主体1内，将已干燥的藻体送入旋风收尘器(回收器)11内。此外在流路9内设有温度计12，其作用在于，准确指示送入旋风收尘器(回收器)11的含干燥藻体的空气的温度。在旋风收尘器11内，因为干燥藻体堆积在下部，所以通过阀门13的开启，就能把藻体回收到容器14内。
在这种喷雾干燥装置中，由加热室6向主体1输送的热风温度优选200～400℃，更优选250～350℃，特别优选300℃左右。在这种喷雾干燥装置中，在流路9内的排风温度优选高于120℃，更优选125℃以上，特别优选130℃以上。但是，如果排风温度超过150℃，就会导致藻体内的温度过高，有可能引起叶黄素的热分解，因此，排风温度优选不超过150℃，更优选140℃以下。通过使用这种喷雾干燥法来进行干燥，在比较短的时间内使干燥藻体内的水分含量为3质量％以下。特别是当叶黄素为虾青素的情况，优选按照这样的条件进行。尤其是喷雾干燥法，通过调整排风温度，可以几乎不依赖干燥的藻体浓度，调整干燥藻体内的水分含量，故优选使用。
经过这些工序，使其水分含量降到3％以下，优选采用喷雾干燥法，将排风温度调整到125℃以上来对藻体进行干燥，使干燥藻体内的水分浓度为3％以下。将得到的干燥藻体，在空气湿度为30～40％的条件下，放入玻璃瓶等容器中密封遮光，即使在常温条件下保存，也几乎不会引起叶黄素的分解。在第一实施方式中，曾把含有虾青素且水分含量在3％以下的藻体，在室温条件下放置在湿度为30～40％的空气中，保存50天后，虾青素的分解率不到10％。另外，使干燥体内的水分含量超过3％时，在同等条件下保存50天后，虾青素的分解率竟达40％。从如上效果来看，使用本发明的方法，藻体内的虾青素其保存稳定性提高了，因此能够使得藻体内的虾青素得以长期保存。对于干燥后的干燥藻体，为进一步防止其叶黄素分解，优选保持在低湿度、且低氧环境中，比如，将其装入真空铝罐中保存，以使其不吸收水分。
需要说明的是，干燥藻体内的水分含量通过下述方法求得。把玻璃皿放入预置好温度的低温干燥机内，加热一个小时后移到干燥器。放置冷却到室温温度，立刻测其质量，测量单位为0.1mg。然后重复上述加热、放置冷却和测重这些操作，求得衡重(W0g)。其次，快速取1～2g试样均匀摊放在玻璃皿中，盖上盖，正确测量(W1g)。把盖和玻璃皿错开放入低温干燥机内，低温干燥机的温度达到105℃后，经过3个小时的干燥，然后，快速在干燥机内把盖盖上，移动到干燥器内放置冷却。等冷却到室温后，立刻称量(W2g)。样品中的水分浓度由下述公式求得。
样品内水分含量(％)＝(W1-W2)/(W1-W0)×100(叶黄素的提取、回收、精制)本发明能够从水分含量在3质量％以下的干燥藻体中，提取、回收叶黄素。提取、回收叶黄素的方法无特别限制，通常使用同行业常用的方法。例如有使用三氯甲烷、己烷、丙酮、甲醇、乙醇等有机溶剂、食用油脂等进行化学提取的方法；或者采用压榨等的物理提取的办法。或者可以用超临界提取法来进行提取、回收。提取后，可以经浓缩、晶析、以及借助合成树脂(例如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物等)进行分离等方法进行精制。
根据本发明，因为使藻体内水分含量降到3质量％以下时，藻体内的叶黄素保持在较高的浓度，所以从该藻体内提取回收的叶黄素数量不会减少。因此，通过使用本发明的保存方法或提高保存稳定性的方法，能够高效益地从大批量培养的藻类中回收和制造叶黄素。
实施例下面，通过使用红球藻属藻体的实施例，对本发明进行详细说明。毋庸置疑，本发明绝不仅仅局限于该实施例。
首先，对叶黄素的测定方法、虾青素同分异构体的测定方法、以及藻体干燥质量的测定方法，加以说明。
(叶黄素的测定方法)取一定量的样品放入颗粒搅拌器专用的微管中。在相同管中加入氧化锆颗粒，之后加入丙酮，用颗粒搅拌器把样品打碎。破碎后，经离心器分离使试样分为上清和下沉淀，回收上清部分(即丙酮部分)。在沉淀物中再加入丙酮，重复上述同样的操作，直至沉淀物几乎完全发白为止。把回收的丙酮组分装到一起，用二甲基亚砜(DMSO)稀释到10倍，测定492nm对应的吸光度(A492)以及750nm对应的吸光度(A750)。回收丙酮组分(样品)中叶黄素的浓度(按游离体换算)，由下述公式求得。
样品中叶黄素的浓度(μg/mL)＝4.5×100×(A492-A750)另外，在下述实施例中使用雨生红球藻生产的叶黄素，绝大多数是虾青素。上述叶黄素的测定方法也同样适用于虾青素的测定。
(虾青素同分异构体的测定方法)将上述测定叶黄素而配制的样品(回收丙酮组分)，溶解于0.15M磷酸缓冲液(pH值7.0)中，再添加甾醇酯酶，使虾青素水解。通过使用ODS柱的高效液相色谱，来分析这种水解物。这里使用的检测器是紫外线检测器或光电二极管阵检测器。高效液相色谱的分析条件跟非专利文献1上记载的条件相同。在这一条件下，按照反式-虾青素(保持时间约7.9分钟)、9-顺式-虾青素(保持时间约8.9分钟)、以及13-顺式-虾青素(保持时间约9.3分钟)顺序依次溶解析出。假定这些化合物的摩尔吸光系数是相同的，通过比较面积值就能求得各种化合物的比例。
(藻体浓度的测定方法)
藻体浓度通过下述方法求得。取一定量的培养液，用GC50玻璃纤维滤纸(TOYO ADVANTEC制)进行吸引过滤。为了溶解无机盐类，用5毫升pH4的盐酸溶液将滤纸清洗2次。然后，将滤纸用105℃的恒温干燥机进行3个小时的干燥，再在真空干燥器中冷却1个小时至室温，测定滤纸的干燥质量。再者，预先将GC50玻璃纤维滤纸，用上述恒温干燥机在105℃、干燥1小时，测定滤纸的质量。从吸附藻体的干燥滤纸质量中，扣除预先测定的滤纸干燥质量，来求得藻体的干燥质量，由此测定每单位容积或每单位质量的藻体浓度。另外，对于干燥藻体在分散液中的藻体浓度的测定，除了不用盐酸溶液清洗之外，其它同上述方法一样。
(配制实例含虾青素藻体的培养)采用产生虾青素的雨生红球藻K0084株(以下简单地称作K0084株)。在容积为1.5L、光程25mm的密封扁平培养瓶中，加入1L如下表1所示的MBG-11培养基，接种K0084株，使起始浓度为0.6g/L。
表1
以600mL/分钟的速度(即0.6vvm)通入含有3体积％二氧化碳的空气，同时将培养温度调整到25℃、pH值调整到6～8之间，在下述光照条件下培养5天。
光照射采用的光源为白色荧光灯(松下电器产业株式会社制、FL40SSW/37)。调整光照射强度，使其用L1COR-190SA平面光量子传感器测量，培养槽受光方向的PPFD为100μmol-p/m2s。
培养后的K0084株，颜色由绿色逐渐向茶色～茶褐色改变，已确定被包囊化。
接着，向与上述相同的扁平培养瓶中装入相同的培养基(MBG-11)，接种起始浓度为0.6g/L、已经包囊化了的K0084株。在与上述相同的培养条件，培养200个小时。通过这种培养，可得到含4.2质量％的虾青素的藻体。
实施例把通过上述配制例得到的藻体，经过离心分离回收、水洗，使藻体含量大致调整到18质量％左右，以便通过喷雾干燥法干燥。使用喷雾干燥装置(Anhydro APV PSD52)，将入口处的热风温度设定为300℃，出口处排风温度分别设定在105℃、120℃、1 30℃或140℃，得到各个干燥藻体A～D。对干燥藻体A～D分别测定其水分含量、虾青素浓度以及虾青素同分异构体的浓度。结果如表2所示。
表2
从该张表可知干燥藻体内的水分含量随排风温度的增高而减少，当排风温度为140℃时，藻体内的水分含量为1.87％。而藻体内的虾青素，其绝大部分9位和13位的双键都是反(trans)体。但是，随着排风温度的增高，其同分异构体9-顺(9-cis)体和13-顺(13-cis)体有增加的趋势。其显示加热促进虾青素的同分异构化。
然后，将得到的干燥藻体样品A～D，装到玻璃瓶中使其为30体积％密封，在室温温度、30～40％的湿度条件下保存。定时测定各种虾青素的浓度，作为评价其保存稳定性的指标。结果如图2所示。
从图2可知，水分含量在3质量％以下的干燥藻体C和D，尽管其保存于室温下空气环境中的玻璃瓶中，但虾青素的分解极其缓慢。特别是水分浓度在2％以下的干燥藻体D，即使保存时间超过80天，虾青素也几乎没有发生分解。而干燥藻体C，在第50天，其分解率在10％以下。另一方面，水分含量在3％质量以上的干燥藻体A和B，都发生了虾青素的分解，在第50天，30～40％的虾青素发生了分解。分析上述结果可知，对于虾青素的分解，与藻体干燥时的热相比，干燥藻体中的残存水分影响较大。从这些结果来看，通过将干燥藻体中的水分浓度控制在3质量％以下，虾青素将会稳定地保存。另外，将依照本发明的方法生产的干燥藻体C和D，与相当于比较例的干燥藻体A和B进行对比，不难看出，从保存开始到第20天之后，残存虾青素量出现很大的差异。因此，本发明的方法在保存20天以上的情况下特别有用。
由以上可知在使用喷雾干燥法的情况下，即使容许部分虾青素进行热分解，但将藻体内水分含量降到3质量％以下这一方法，最终对于虾青素稳定地保存是有效的。
根据本发明的方法，能够使叶黄素，特别是含有遇到热、氧、光易于分解的虾青素的干燥藻体内的叶黄素(虾青素)，在室温、空气条件下长期而稳定地保存。因此，对于叶黄素，特别是虾青素的稳定化及制造有用。另外，根据本发明的方法，当把含有虾青素的干燥藻体用作鱼类饲料时，因为饲料中的虾青素能够长期而稳定地保存，所以提高了鱼的重染效果。
权利要求
1.一种藻体内叶黄素的保存方法，其包括培养含叶黄素的藻体后，将其回收的工序；以及对该回收的藻体进行干燥以使藻体内的水分为3质量％以下的工序。
2.如权利要求1记载的方法，所述叶黄素是虾青素。
3.如权利要求1或2记载的方法，所述藻体是属于红球藻属的绿藻。
4.如权利要求3记载的方法，所述绿藻是雨生红球藻。
5.如权利要求1～4中任一项记载的方法，所述干燥是通过喷雾干燥法进行的。
6.如权利要求5记载的方法，所述喷雾干燥法是使用喷雾干燥装置来进行，该喷雾干燥装置中，排风温度调整在125℃以上。
7.一种提高含叶黄素的干燥藻体中的叶黄素保存稳定性的方法，其包括使藻体干燥成而使藻体中水分含量为3质量％以下的工序。
8.如权利要求7记载的方法，所述叶黄素是虾青素。
9.如权利要求7或8记载的方法，所述干燥是通过喷雾干燥法进行的。
10.如权利要求9记载的方法，所述喷雾干燥法是使用喷雾干燥装置来进行，该喷雾干燥装置中，排风温度调整在125℃以上。
11.如权利要求7～10中任一项记载的方法，所述藻体是属于红球藻属的绿藻。
12.如权利要求11记载的方法，所述绿藻是雨生红球藻。
13.一种叶黄素的制造方法，包括权利要求7～12中任一项记载的方法。
全文摘要
本发明提供一种含叶黄素的藻体内的叶黄素的保存方法。本发明的藻体内叶黄素的保存方法，包含回收工序和干燥工序。回收工序是培养含叶黄素的藻体之后，进行回收；干燥工序是对该回收的藻体进行干燥使其水分含量降到3质量％以下。干燥优选采用喷雾干燥法，在喷雾干燥装置的排风温度为125℃以上的干燥条件下进行。在这样的干燥藻体中，即使放置在室温空气中保存，叶黄素也能得以长期而稳定地保存。
文档编号C07C403/00GK1869194SQ20061008478
公开日2006年11月29日 申请日期2006年5月17日 优先权日2005年5月17日
发明者石仓正治 申请人:雅马哈发动机株式会社