专利名称：固体培养基及其生产方法
技术领域：
本发明涉及用于生长和测试各种微生物的固体培养基等，以及用于生产所述固体培养基的方法。
背景技术：
作为干燥固体培养基的一种例子，通常一种干燥的固体培养基是已知的，这种培养基是通过将一种培养基注入塑料培养皿中并且固化，然后冷冻干燥而制备的(JP60-19988B，以下称之为“现有技术1”)。
另外，一种薄膜形式的干燥固体培养基也是已知的，这种培养基含有诸如琼脂的胶凝剂，并且可以通过添加无菌水将其基本上恢复到在将它制成薄膜以前的状态(JP6-311880A，以下称之为“现有技术2”)。
不过，所述常规材料存在以下问题。
采用上述现有技术1和现有技术2是为了提高培养基的储存稳定性，并且对培养基进行干燥，以便最终获得的固体培养基组合物中的含水量为50％或更低。因此，这种培养基的问题是，在使用时，需要长达大约3小时的较长时间来完全恢复所述培养基。
另外，由于通过上述常规技术获得的干燥固体培养基需要上文所述的较长时间来进行恢复，诸如1-10分钟时间的相对短时间的恢复，会导致不充分的恢复。如果将这种培养基用于微生物试验，金黄色葡萄球菌ATCC6538P、嗜热脂肪芽孢杆菌热乳变种NIZO C953等的生长会由于这种培养基的恢复不充分而受到部分抑制，导致对微生物数量测定的不准确，正如在下面提到的试验实施例中所证实的，所述微生物是食品等的微生物测试中的重要的细菌物种。
就是说，常规的干燥固体培养基具有需要很长时间来恢复的问题，因此，这种培养基不适用于对微生物数量进行快速和准确的测定试验。
另外，已知对固体培养基进行干燥是为了在生产出这种培养基之后除去它表面上的多余的水分。由于这种干燥工艺会除去按规定组成制备的所述固体培养基中的一部分溶剂水，在实际培养微生物时，该培养基的含水量会明显不同于构成该固体培养基组成中的规定用量。培养基干燥对培养微生物的影响不可忽视。例如，已知微生物的生长有时候会由于干燥等而减弱，即使将培养基保存在试管中，并且加盖棉塞数周也会如此。另外，不加控制地除去水分，有时候会使得固体培养基的组成不稳定。因此，在微生物，特别是有可能受到培养基含水量影响的微生物的培养试验中，不能获得可再现的和准确的结果。
发明公开本发明的目的是提供一种具有卓越吸水速度的固体培养基，以便能够在短时间内使用大量的样品，并且适合对微生物的数量进行快速而又准确地测定试验，并且提供用于生产所述培养基的方法。
本发明人对现有技术的上述问题进行了不懈研究，结果本发明人通过以下方法获得了一种固体培养基将固体培养基的各种成分溶解在溶剂水中，溶剂水的量大于规定用量，固化所得到的溶液，并且干燥所述固化培养基，以便除去一定量的水分，所除去的水的量几乎等于所述溶剂水超出的量。本发明人业已发现，所述培养基不会由于干燥而导致微生物的生长抑制。本发明人还发现这种培养基具有卓越的吸水速度，使它能够在短时间内使用大量的样品，并且适合对微生物数量进行快速而又准确的测定试验。因此，本发明人完成了本发明。
本发明提供了一种具有至少为0.05毫升/分钟的10分钟时间平均吸水速度的固体培养基(以下又称之为“本发明的固体培养基”)。这种培养基是通过一种用于生产固体培养基的方法获得的，该方法包括以下步骤将除了溶剂水以外的所述固体培养基的成分溶解到溶剂水中，固化所获得的溶液，并且干燥所述固化的培养基，以便除去水，其中，所除去的水的量使得所述固体培养基在除去水之后具有至少为0.05毫升/分钟的10分钟时间平均吸水速度，并且所述溶剂水的量大于规定用量，所超出的量几乎等于要除去的水的量。
在本发明的固体培养基中，被除去的水的量优选至少为溶剂水的5％，更优选至少为溶剂水的30％。
本发明的固体培养基优选具有至少90％的含水量。
本发明还提供了一种用于生产固体培养基的方法，该方法包括以下步骤将除了溶剂水以外的所述固体培养基的成分溶解到溶剂水中，固化所获得的溶液，并且干燥所述固化的培养基，以便除去水，其中，所除去的水的量使得所述固体培养基在除去水之后具有至少为0.05毫升/分钟的10分钟时间平均吸水速度，并且所述溶剂水的量大于规定用量，所超出的量几乎等于要除去的水的量。
在本发明的生产方法中，被除去的水的量优选至少为溶剂水的5％，更优选为溶剂水的至少30％。
在本说明书中，固体培养基表示在使用时处于固体状态的培养基，例如，平板培养基、斜面培养基等，所述培养基是用诸如琼脂的胶凝剂固化的。
培养基通常是根据其组成鉴别(确定)的。因此，规定用量的溶剂水是所述组成中用于鉴别所述培养基的水的量。规定用量的溶剂水，表示为了溶解固体培养基中除了溶剂水以外的每一种成分而添加的水的量，并且当固体培养基的成分为水溶液时，该成分中的水的量不包括在内。
10分钟时间的平均吸水速度是使用按照以下方法测定的A和B，按照以下公式计算的。测定样品平板(圆形，外径9厘米，内径8.6厘米(面积，58.1平方厘米)，培养基的用量15克)的总重量(B)，并且通过将10毫升离子交换水添加到平板培养基上开始吸水。10分钟时间之后，倒掉没有被吸收的水，擦去培养皿侧壁上的水分，并且测定吸水之后样品平板的重量(A)。所述测定是在25℃下进行的。当所述样品平板的面积不同于上述面积时，所述测试是通过使用离子交换水进行的，水的用量为每单位上述面积10毫升，并且将结果转化成每单位上述面积的吸水速度。
吸水速度(毫升/分钟)＝(A-B)/10通过干燥除去的水的量，是通过测定因为干燥而减少的重量计算的。就是说，由于干燥造成的重量减少，即所谓的水分损失(c)可以由干燥之前的培养基重量(a)和干燥之后的培养基重量(b)，按照公式a-b＝c计算获得。然后，可以由所添加的溶剂水的总量(d)和由于干燥导致的上述重量减少(c)，按照以下公式获得所除去的水的比例，即通过干燥所除去的水的百分比(e，％)。
e(％)＝c/d×100固体培养基的含水量表示含水量的百分比(％)，它被定义为(固体培养基中水的量)/(固体成分的量+水的量)×100。在这里，水和固体成分的量都是以重量形式表示的。
实施本发明的最佳方式培养基是用于生长或繁殖诸如细菌、酵母和霉菌的微生物的营养物质，它还是微生物的生长环境。作为培养基的成分，培养基通常含有诸如葡萄糖和乳糖的糖类，诸如氨基酸、蛋白胨、硝酸盐和铵盐的氮源，诸如钾盐、磷酸盐和镁盐的无机盐，诸如维生素的生长因子等。培养基大体上可以划分为液体培养基和固体培养基，其中，液体培养基的成分被简单地溶解在溶剂水中，而固体培养基是通过向液体培养基中添加胶凝剂固化的。本发明提供了一种固体培养基，正如上文所定义的，它是一种在使用时呈固体状态的培养基(培养介质)，例如，平板培养基，或斜面培养基等，这种培养基是通过用诸如琼脂的胶凝剂生产的。
胶凝剂的例子包括琼脂、明胶、吉南糖胶、和角叉菜胶等。
本发明固体培养基组成的具体例子包括以下组成营养琼脂培养基，标准琼脂培养基、脱氧胆酸盐琼脂培养基，E.M.B.培养基，Endo培养基，含有B.C.P的平板计数琼脂培养基，具有卵黄的甘露糖醇盐琼脂，马铃薯葡萄糖琼脂培养基，紫红胆乳糖(VRBL)琼脂培养基，酵母提取物-葡萄糖-氯霉素琼脂培养基，酸化MRS培养基，培养基M17，和Baird-Parker琼脂培养基(ETGP琼脂培养基)等，以上培养基是在日本食品卫生法、日本药典、和国际乳品联合会标准(IDFSTANDARD)等所披露的微生物试验方法中所定义的[“乳制品测试方法注释”，日本药品协会，pp.1111-25，1990年40日，KaneharaShuppan有限公司(参考文献1)；“IDF标准(1991年的修改版)”，P.306，P.470，P.645-647，1991年12月25日，由日本国际乳制品联合会出版(参考文献2)；细菌培养基科学报告，vo1.2，II”，第2版，editorshipSakazaki Toshikazu，pp.62-63，1996年8月15日，Kindai Shuppan有限公司(参考文献3)]。
作为参考，下文披露了在参考文献1中所披露的上述固体培养基中所包含的相应成分的规定用量。
营养琼脂培养基(pH7.0-7.4)的固体培养基组成中各种成分的规定用量为5克肉膏，10克蛋白胨，1-2克氯化钠(NaCl)，12-15克琼脂和1000毫升(1升)纯化水(溶剂水)。
标准琼脂培养基(pH6.8-7.2)的固体培养基组成中各种成分的规定用量为2.5克酵母提取物，5克蛋白胨，1克葡萄糖，15克琼脂和1000毫升(1升)纯化水(溶剂水)。
脱氧胆酸盐琼脂培养基(pH7.0-7.4)的固体培养基组成中各种成分的规定用量为10克蛋白胨，10克乳糖，10克脱氧胆酸钠，5克氯化钠(NaCl)，2克磷酸氢二钾，0.033克中性红，2克柠檬酸铁铵，15克琼脂和1000毫升(1升)纯化水(溶剂水)。
E.M.B.培养基(pH6.6-7.0)的固体培养基组成中各种成分的规定用量为10克蛋白胨，10克乳糖，2克磷酸氢二钾，0.4克伊红Y，0.065克亚甲基兰，18克琼脂和1000毫升(1升)纯化水(溶剂水)。
Endo培养基(pH7.0-7.4)的固体培养基组成中各种成分的规定用量为10克蛋白胨，3克肉膏，10克乳糖，1.6克亚硫酸钠，0.1克碱性品红，15克琼脂和1000毫升(1升)纯化水(溶剂水)。
含有B.C.P.的平板计数琼脂培养基(pH6.0-7.0)的固体培养基组成中各种成分的规定用量为2.5克酵母提取物，5克蛋白胨，1克葡萄糖，1克Tween80，0.1克L-半胱氨酸，0.6克溴甲酚紫，15克琼脂和1000毫升(1升)纯化水(溶剂水)。
具有卵黄的甘露糖醇盐琼脂[pH7.2-7.6，在用高压蒸汽消毒之后，在将培养基注入平板之前，添加50-60毫升新鲜卵黄溶液(通过将卵黄溶解到相同量的生理盐水中获得)]的固体培养基组成中各种成分的规定用量为2.5克肉膏，10克蛋白胨，10克甘露糖醇，75克氯化钠(NaCl)，0.025酚红，15克琼脂和1000毫升(1升)纯化水(溶剂水)。
马铃薯葡萄糖琼脂(pH5.6-5.7)的固体培养基组成中各种成分的规定用量为200克马铃薯浸剂，20克葡萄糖，15克琼脂和1000毫升(1升)纯化水(溶剂水)。
下面将提供在参考文献2中所披露的固体培养基中所含有的相应成分的规定用量。
紫红胆盐乳糖(VRBL)琼脂培养基(pH7.4±0.1)的固体培养基组成中各种成分的规定用量为7克蛋白胨，3克酵母提取物，10克乳糖(C12H22O11·H2O)，5克氯化钠，1.5克胆酸盐，0.03克中性红，0.002克结晶紫，12-18克琼脂和1000毫升(1升)水(溶剂水)。
酵母提取物-葡萄糖-氯霉素琼脂培养基(pH6.6)的固体培养基组成中各种成分的规定用量为5克酵母提取物，20克葡萄糖(C6H12O6)，0.1克氯霉素(C11H12Cl2N2O5)或土霉素(C22H30N2O11)，12-15克琼脂和1000毫升(1升)水(溶剂水)。
酸化MRS培养基(用乙酸调节到pH5.4)的固体培养基组成中各种成分的规定用量为10克蛋白胨1(酪蛋白的胰蛋白酶消化产物)，10克肉膏，5克酵母提取物(粉末)，20克葡萄糖(C6H12O6)，1毫升Tween80(山梨聚糖单油酸酯)，2克磷酸氢二钾(K2HPO4)，5克三水合乙酸钠(CH3CO2Na·3H2O)，2克柠檬酸铵(C6H6O7(NH4)2)，0.2克七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)，0.05克四水合硫酸锰(MnSO4·4H2O)，9-18克琼脂和1000毫升(1升)水(溶剂水)。
培养基M17[pH7.1-7.2，在通过高压蒸汽消毒之后，在将培养基注入平板中之前，以消毒的10％乳糖(C12H22O11)水溶液形式添加乳糖(C12H22O11)]的固体培养基组成中各种成分的规定用量为2.50克蛋白胨1(酪蛋白的胰蛋白酶消化产物)，2.50克蛋白胨2(肉的胃蛋白酶消化产物)，5.00蛋白胨3(大豆的木瓜蛋白酶消化产物)，2.50克酵母提取物(粉末)，5.00克肉膏，19.00克β-甘油磷酸盐(二钠盐，C6H7O6PNa2)，0.25克七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)，0.50克抗坏血酸(C6H8O6)，5克乳糖(C12H22O11)，9-18克琼脂和1000毫升(1升)水(溶剂水)。
下面将提供在参考文献3中所披露的固体培养基中所含的各种成分的规定用量。
Baird-Parker琼脂培养基(ETGP琼脂培养基，pH6.8，其中，在通过高压蒸汽消毒之后，在将培养基注入平板之前，添加10毫升1％的亚碲酸钾水溶液和50毫升50％的卵黄乳液)的固体培养基组成中各种成分的规定用量为10克蛋白胨，5克肉膏，1克酵母提取物，5克氯化锂，12克甘氨酸，10克丙酮酸钠，17克琼脂和1000毫升(1升)纯化水(溶剂水)。
下面将说明用于生产本发明固体培养基的方法。
在用于生产本发明固体培养基的方法中，将固体培养基的成分溶解到溶剂水中以及所述溶液的固化，可以用与生产常用固体培养基的相同方法进行，所不同的是溶剂水的用量大于其规定用量，并且在固化之后通过干燥除去所述水。例如，可以将在文献等或新鉴别的固体培养基组成(确定的)中所披露的培养基成分的规定用量溶解在溶剂水中，需要时调整pH，然后可以胶凝剂添加到所述溶液中；和对所述混合物进行加热以便溶解胶凝剂，消毒，注入诸如培养皿的容器中，并且固化。
要除去的水的量使得在除去水分之后，所述固体培养基的10分钟时间平均吸水速度至少为0.05毫升/分钟。尽管这一量可能根据培养基组成(特别是根据胶凝剂)而不同，可以通过生产含有各种多余量溶剂水的培养基，并且按照在下文所提供的试验实施例3中所披露的方法，测定其10分钟时间平均吸水速度而测定。
被除去的水的量优选为溶剂水的至少5％，更优选为溶剂水的至少30％。
在通过上述方法除去用规定用量的溶剂水制备的固体培养基中的水时，在除去水之后所述固体培养基中的含水量可能显著减少，导致由于干燥而造成的微生物的生长抑制。根据本发明，事先确定的固体培养基中溶剂水的量大于规定用量，以便在除去水之后，固体培养基中的含水量相当于规定用量。因此，溶剂水的用量大于规定用量，所多出的量几乎等于要除去的水的量。在本文中，几乎等于要除去的水的量的量表示从所添加的溶剂水的总量中扣除要除去的水的量之后所获得的量基本上等于水的规定用量(通常为97-103％)，所述总的量包括水的规定用量和额外用量。
通常，当将文献中所披露的组成或新确定为固体培养基组成中的溶剂水量(溶剂水的规定用量)被视为100％时，溶剂水的额外量为5-150％。溶剂水的这一量是作为水的规定用量的补充配制进去的。作为通过干燥除去溶剂水所获得的最终产品，所生产的本发明固体培养基含有规定用量的水，并且具有足够的吸水速度。
当把琼脂作为胶凝剂时，以上述规定用量的溶剂水为100％，所添加的琼脂的浓度优选为1.0-3％(重量百分比)。另外，为了溶解而进行的加热优选在100℃或更高温度下进行，因为在这种温度下琼脂能完全溶解。如果加热在121℃下进行15分钟或更长时间的话，还可以在溶解的同时实现消毒。消毒可以使用高压蒸汽消毒方法等按常规方式进行。
在将培养皿用作容器时，将固体培养基注入每一个培养皿中的固体培养基的量优选为，在通过干燥除去水分之后其体积应当为10-30毫升。
从培养基中除去水的干燥方法的例子包括减压干燥方法，真空蒸发方法，热空气干燥方法，红外线干燥方法，和高频干燥方法等。不过，干燥方法并不局限于上述方法。
按照上文所述的定义，本发明的固体培养基具有至少0.05毫升/分钟的10分钟时间平均吸水速度。如果所述固体培养基表现出上文所定义的每一个标准大小的平板在10分钟时间至少吸水0.5毫升，就可以在短时间内将大量的样品用于固体培养基上。通过干燥培养基除去上文所述的适当量的水分，可以制备表现出至少为0.05毫升/分钟的10分钟时间平均吸水速度的固体培养基。所述固体培养基的每一个暴露面积的(与控制接触的面积)培养基量，可以是可以获得上述范围的10分钟时间平均吸水速度的量。如果培养基的量太小，就不能获得足够的10分钟时间平均吸水速度。
由于本发明的固体培养基所含的溶剂水的量在除去水之后几乎等于规定用量，在它上面不会出现由于干燥而造成的微生物的生长抑制。这是因为在被确定为固体培养基的组成中溶剂水的规定用量是确定的，以便所培养的微生物可以生长。另外，因为选择了具有不会导致要培养的微生物的生长抑制的组成的培养基。
所述固体培养基优选具有至少90％的含水量。这种含水量可以培养需要高含水量的微生物。例如，正如在下面将要提到的试验实施例中所证实的，诸如金黄色葡萄球菌ATCC6538P的微生物的生长在含水量低于90％时几乎被完全抑制，为了培养这种微生物，必须保持所述固体培养基中的含水量至少为90％。
另外，本发明的固体培养基适合培养对干燥比较脆弱，但是对于食品等的微生物试验又很重要的微生物，如金黄色葡萄球菌ATCC6538P和嗜热脂肪芽孢杆菌热乳变种NIZO C953，而又不会导致这种微生物的任何生长抑制。如上文所述，本发明的固体培养基是在含有其量大于规定用量的溶剂水的状态下干燥的。因此，它保留了足够的吸水速度，并且不会因为干燥导致生长抑制。
为了更容易理解用于生产本发明固体培养基的方法，举在上文所述的参考文献1中所提到的用于生产标准琼脂培养基的方法为例进行说明。
就是说，所述标准琼脂培养基的固体培养基组成中各种成分的规定用量为2.5克酵母提取物，5克蛋白胨，1克葡萄糖，15克琼脂和1000毫升纯化水(溶剂水)，正如在参考文献1中所披露的。
因此，将2.5克酵母提取物，5克蛋白胨和1克葡萄糖的成分溶解在溶剂水中，溶剂水的用量优选比规定用量(1000毫升)多5-150％(50-15000毫升)，以便获得大约1050-2500毫升的溶解溶液。将所述溶解溶液调整到pH6.8-7.2。将15克琼脂添加到该溶液中，并且通过高压蒸汽消毒方法，以121℃的温度将该混合物加热15分钟，以便同时完成溶解和消毒。
在无菌条件下将消毒培养基注入培养皿中，每个培养皿的注入量为16-38克，并且通过冷却固化。然后使用干燥器(LABCONCO)通过减压干燥方法，在103Pa的压力下干燥固化的培养基，以便除去溶剂水。
通过上述方法通过干燥除去水，除去所述多余量的水，以便生产出其10分钟时间的平均吸水速度至少为0.05毫升/分钟的固体培养基。
通过上述方法生产的固体培养基不会因为干燥而导致微生物的生长抑制。另外，它表现出卓越的吸水速度，并且能够在短时间内使用大量的样品，并且适合对微生物数量进行快速而又准确的测定试验。
实施例将通过以下实施例对本发明作更详细的说明。不过，本发明并不局限于以下实施例。
实施例1将2.5克酵母提取物(东方酵母)，5克蛋白胨(Difco)和1克葡萄糖(Wako Pure Chemical Industries)溶解在1200毫升溶剂水中，在已知的固体培养基组成中，该溶剂水除了被视为100％的规定用量的溶剂水(纯化水，1000毫升)之外，还包括10％(200毫升)多余的水，以便获得大约1200毫升的溶解溶液。用0.1M/L的氢氧化钠溶液将该溶液调整到pH7.2。将15克琼脂(Ina Shokuhin Kogyo)添加到该溶液中，并且用高压釜(Iwatate Iryo Kikai Seisakusho)，在121℃下将该混合物加热15分钟，以便同时完成溶解和消毒。
在无菌室中，以每个培养皿18克的用量将消毒的固体培养基注入每一个直径为9厘米的塑料培养皿(Eiken Kizai)中，通过冷却固化，并且使用干燥器(LABCONCO)按照减压干燥方法在103Pa的压力下干燥，以便除去3毫升水。结果获得了分别装有15克培养基的固体培养基平板。
上述除去的水分相当于通过干燥除去配制进去的除了规定用量的水以外的所有溶剂水的总量(200毫升)，即除去了视为100％的所添加的溶剂水(纯化水)总量(1200毫升)中的大约17％(200毫升)。
因此，通过上述除水方法将所述固体培养基的含水量调整到了大约98％。
通过下面所披露的方法测试按上述方法生产的固体培养基(营养琼脂培养基)平板，并且发现这种平板具有0.15毫升/分钟的10分钟时间平均吸水速度。业已发现，这种培养基是能够在短时间内使用大量样品的固体培养基，并且它没有出现通过干燥导致的生长抑制，因此，它适用于对微生物数量进行快速而又准确的测定试验。
实施例2将2.5克肉膏(Merck)，10克蛋白胨(Difco)，75克氯化钠(WakoPure Chemical Industries)，10克甘露糖醇(Wako Pure ChemicalIndustries)和0.025克酚红(Wako Pure Chemical Industries)溶解在1066毫升溶剂水中，在已知的固体培养基组成中，除了被视为100％的规定用量的溶剂水(纯化水，1000毫升)之外，还含有6.6％(66毫升)多余的水，以便获得大约1066毫升的溶解溶液。用0.1M/L的氢氧化钠溶液将该溶解溶液调整到pH7.4。将15克琼脂(InaShokuhin Kogyo)添加到该溶液中，并且用高压釜(Iwatate Iryo KikaiSeisakusho)在121℃下将该混合物加热15分钟，以便同时完成溶解和消毒。
在无菌室中，以每个培养皿18克的用量将消毒的固体培养基注入每个直径为9厘米的塑料培养皿(Eiken Kizai)中，通过冷却固化，并且使用干燥器(LABCONCO)按照负压干燥方法在103Pa的压力下干燥，以便除去大约1毫升的溶剂水。结果获得了分别装有15克培养基的固体培养基平板。
上述除去的水相当于通过干燥除去配制进去的除了规定用量的水之外的所有溶剂水的总量(66毫升)，即除去了被视为100％的所添加的溶剂水(纯化水)的总量(1066毫升)中的大约6％(66毫升)。
因此，通过上述除水方法将所述固体培养基的含水量调整到了大约90％。
通过下面所披露的方法测试按上述方法生产的固体培养基(含有卵黄的甘露糖醇盐琼脂)平板，发现这种平板具有0.07毫升/分钟的10分钟时间平均吸水速度。业已发现，这种培养基是能够在短时间内使用大量样品的固体培养基，并且它没有出现通过干燥导致的葡萄球菌属细菌的微生物生长抑制，因此，它适用于对微生物数量进行快速而又准确的测定试验。
实施例3通过改进已知固体培养基的组成制备具有新组成的固体培养基。
将10克蛋白胨(Difco)，5克肉膏(Merck)，和2克氯化钠(WakoPure Chemical Industries)溶解在1200毫升溶剂水中，除了被视为100％的规定用量的900毫升水(改良成少于已知固体培养基组成中的溶剂水(纯化水，1000毫升)的规定用量)之外，它还含有33.3％(300毫升)的多余的水，以便获得大约1200毫升的溶解溶液。用0.1M/L的氢氧化钠溶液将该溶解溶液调整到pH7.0。将15克琼脂(InaShokuhin Kogyo)添加到该溶液中，并且用高压釜(Iwatate Iryo KikaiSeisakusho)在121℃下将该混合物加热15分钟，以便同时完成溶解和消毒。
在无菌室中，以每个培养皿20克的用量将消毒的固体培养基注入每个直径为9厘米的塑料培养皿(Eiken Kizai)中，通过冷却固化，并且用干燥器(LABCONCO)按照负压干燥方法在103Pa的压力下干燥，以便除去5毫升的溶剂水。结果获得了分别装有15克培养基的固体培养基平板。
上述除去的水相当于通过干燥除去配制进去的除了规定用量的水之外的水的总量(300毫升)，即除去了被视为100％的所添加的溶剂水(纯化水)的总量(1200毫升)中的大约25％(300毫升)。
因此，通过上述除水方法将所述固体培养基的含水量调整到了大约96％。
通过下面所披露的方法测试按上述方法生产的固体培养基(营养琼脂培养基)平板，并且发现这种平板具有0.17毫升/分钟的10分钟时间平均吸水速度。业已发现，这种培养基是能够在短时间内使用大量样品的样品，并且它没有出现通过干燥导致的微生物生长抑制，因此，它适用于对微生物数量进行快速而又准确的测定试验。
试验实施例1进行该试验是为了通过使用微生物生长实验的结果作指标对本发明和现有技术进行比较。
(1)样品的制备将以下三种样品中的每一种重复制备5份。
样品1用与本发明的实施例1相同方法生产的固体培养基。
样品2用与现有技术1的实施例1相同方法生产的固体培养基，所不同的是，培养基的类型变成了营养琼脂培养基，将15毫升培养基注入每一个培养皿中，将15毫升的水(消毒水)用于恢复，将所述固体培养基恢复5分钟，并且通过倾倒除去用于恢复的多余的水(游离水)。
样品3用与现有技术2的实施例1相同方法生产的固体培养基，所不同的是，培养基的类型变成了营养琼脂培养基，将15毫升培养基注入每一个培养皿中，将15毫升的水(消毒水)用于恢复，将所述固体培养基恢复5分钟，并且通过倾倒除去用于恢复的多余的水(游离水)。
(2)试验方法通过以下试验方法测试微生物在每一种样品上的生长。
作为测试菌株，使用了从美国典型培养物保藏中心(微生物保藏机构)获得的金黄色葡萄球菌ATCC6538P，和从荷兰乳制品研究所获得的嗜热脂肪芽孢杆菌热乳变种NIZO C953。
制备每一种测试菌株的稀释液，以便在将0.1毫升的该稀释液加样到标准琼脂培养基平板上，并且在37℃下培养48小时时，可以获得100个测试菌株菌落，所述标准琼脂培养基平板是通过使用在已知固体培养基组成中所确定的规定用量的溶剂水制备的，即直接使用在已知固体培养基组成中所确定的规定用量的溶剂水，而不进行任何干燥处理。
所述标准琼脂培养基的固体培养基组分由2.5克酵母提取物，5克蛋白胨，1克葡萄糖，15克琼脂和1000毫升(溶剂水的规定用量)纯化水组成。
将0.1毫升的测试菌株的稀释液加样到每一种样品的一个平板上，在37℃下培养48小时，并且通过肉眼检查确定所出现的菌落的数量。所述试验重复进行5次，并且计算菌落的平均数。
(3)试验结果该试验的结果如表1所示。从表1所示的结果可以明确的看出，发现本发明的样品1好于现有技术的样品2和3，因为可以检测到作为食品等的微生物检测的重要细菌的金黄色葡萄球菌ATCC6538P和嗜热脂肪芽孢杆菌热乳变种NIZO C953，而又没有任何生长抑制作用，并且使用样品1能够准确而又快速地测定微生物数量。
根据上述结果，发现现有常规技术的干燥的固体培养基需要很长时间来恢复，因此这种培养基不适用于微生物数量的快速而又准确地测定试验。
另外，当通过改变培养基的类型、注入每一个培养皿中的培养基的用量、用于恢复干燥的固体培养基的水(无菌水)的用量以及干燥固体培养基的恢复时间(在1-10分钟时间范围内)重复上述实验时，获得了几乎类似的结果。
表1
试验实施例2进行该试验是为了通过使用微生物生长试验的结果作指标确定固体培养基中的合适的含水量。
(1)样品的制备将以下两种样品的每一种重复制备5份。
样品4用与本发明的实施例2相同方法制备的固体培养基，所不同的是，通过干燥除去了溶剂水，以便该固体培养基的含水量为90％。
样品5用与本发明的实施例2相同方法制备的固体培养基，所不同的是，通过干燥除去了溶剂水，以便该固体培养基的含水量为80％。
(2)试验方法用上文所述的试验实施例1的试验方法相同的方式检验微生物在每一种样品上的生长，所不同的是，仅将上述金黄色葡萄球菌ATCC6538P用作实验菌株。
通过监测由干燥所导致的重量减少，监测由干燥所导致的固体培养基含水量的变化。就是说，由干燥所导致的重量减少，即所谓的水分损失(c)是由干燥之前的培养基重量(a)和干燥之后的培养基重量(b)根据公式a-b＝c计算获得的。然后，通过从所添加的总的溶剂水重量中扣除上述水分损失(c)，获得所保留的含水量。干燥之后的含水量是根据保留的含水量和上述含水量的定义获得的，以便监测由于干燥导致的固体培养基含水量的变化。
甘露糖醇氯化钠琼脂培养基的固体培养基组分由2.5克肉膏，10克蛋白胨，75克氯化钠，10克甘露糖醇，0.025克酚红，15克琼脂和1000毫升(溶剂水的规定用量)纯化水组成。
(3)试验结果该试验的结果如表2所示。从表2所示的结果可以明确地看出，当固体培养基的含水量为80％，即所谓的低于90％时，金黄色葡萄球菌ATCC6538P的生长几乎完全被抑制，从而使得不可能统计微生物的数量，因此证实了为了准确测定微生物的数量，必须至少有9 0％的含水量。
另外，当通过改变培养基的类型和各种含水量重复所述实验时，获得了几乎类似的结果。
表2
试验实施例3该试验是通过使用吸水速度测试结果作指标进行的，以便确定要除去的溶剂水的合适量(％)，此时将文献等中所披露的固体培养基组成中的溶剂水用量视为100％。
(1)样品的制备将以下四种样品的每一种重复制备5份。
样品6用与本发明的实施例1相同方法制备的固体培养基，所不同的是，没有配制除了规定用量以外的溶剂水，因此不进行通过干燥除去溶剂水的操作。
样品7用与本发明的实施例1相同方法制备的固体培养基，所不同的是，额外添加了占规定用量2.5％的溶剂水，并且通过干燥除去了溶剂水总量的2.5％。
样品8用与本发明的实施例1相同方法制备的固体培养基，所不同的是，额外添加了占规定用量5％的溶剂水，并且通过干燥除去了溶剂水总量的5％。
样品9用与本发明的实施例1相同方法制备的固体培养基，所不同的是，额外添加了占规定用量40％的溶剂水，并且通过干燥除去了溶剂水总量的30％。
(2)试验方法通过以下试验方法测定每一种样品的吸水速度，测定是在25℃下进行的。
测定样品平板的总重量(B)，然后将10毫升离子交换水添加到平板培养基(圆形，外径9厘米，内径8.6厘米(面积58.1平方厘米)，培养基用量15克)上，以便开始吸水；10分钟之后倒掉没有被吸收的水，擦去培养皿侧壁上的水分；然后测定在吸水之后所述样品平板的总重量(A)。然后，按照以下公式计算10分钟时间的平均吸水速度吸水速度(毫升/分钟)＝(A-B)/10另外，通过干燥除去的溶剂水的百分比(e)是根据被视为100％的配制备溶剂水总量(d)，和监测到的水分损失(c)，用与试验实施例2相同的方法按照以下公式计算的e(％)＝c/d×100(3)试验结果该试验的结果如表3所示。从表3所示的结果可以明确地看出，在通过干燥培养基除去至少5％的溶剂水时，吸水速度变成至少0.05毫升/分钟，因此，可以在短时间内使用大量的样品。因此，证实了为了对微生物数量进行快速测定试验，必须除去至少5％的溶剂水。另外，当除去至少30％的溶剂水时，吸水速度变成至少0.2毫升/分钟，因此，可以在短时间内使用较大量的样品。因此，证实了为了对微生物数量进行快速测定实验，优选除去至少30％的溶剂水。
另外，在通过改变各种培养基的类型而重复该实验时，获得了几乎类似的结果。
表3
工业实用性本发明的优点如下1)通过本发明的生产方法制备的本发明的固体培养基具有优越的吸水速度，能够在短时间内使用大量的样品，并且适用于微生物数量的快速测定试验。
2)由于通过本发明的生产方法制备的本发明的固体培养基能够使用大量的样品，它能够提供微生物检测的高准确度，并因此适用于微生物数量的准确测定试验。
3)由于本发明的生产方法制备的本发明的固体培养基不表现出因为干燥导致的生长抑制，它适用于对微生物数量进行准确测定。
4)通过本发明的生产方法可以制备出具有卓越吸水速度的固体培养基，该培养基能够在短时间内使用大量的样品，并且适用于对微生物的数量进行快速而又准确的测定试验。
权利要求
1.一种固体培养基，该培养基具有至少为0.05毫升/分钟的10分钟时间平均吸水速度，该培养基可以通过一种用于生产固体培养基的方法获得，该方法包括以下步骤将所述固体培养基的除了溶剂水以外的成分溶解在溶剂水中，固化所获得的溶液，并且干燥所述固化的培养基以便除去水，其中，所除去的水的量使得在除去水之后所述固体培养基具有至少为0.05毫升/分钟的10分钟时间平均吸水速度，并且所述溶剂水的量大于规定用量，所超出的量几乎等于要除去的水的量。
2.如权利要求1的固体培养基，要除去的水的量至少为溶剂水的5％。
3.如权利要求1的固体培养基，要除去的水的量至少为溶剂水的30％。
4.如权利要求1-3中任意一项的固体培养基，该培养基的含水量为至少90％。
5.一种用于生产固体培养基的方法，该方法包括以下步骤将所述固体培养基的除了溶剂水以外的成分溶解在溶剂水中，固化所获得的溶液，并且干燥所述固化的培养基以便除去水分，其中，所除去的水的量使得在除去水之后所述固体培养基具有至少为0.05毫升/分钟的10分钟时间平均吸水速度，并且所述溶剂水的量大于规定用量，所超出的量几乎等于要除去的水的量。
6.如权利要求5的生产方法，其中，要除去的水的量至少为溶剂水的5％。
7.如权利要求5的生产方法，其中，要除去的水的量至少为溶剂水的30％。
全文摘要
一种固体培养基，它具有至少为0.05毫升/分钟的10分钟时间平均吸水速度，这种固体培养基是通过一种制备方法制备的，该方法的特征是，它包括将所述固体培养基的除了溶剂水以外的各成分溶解在溶剂水中，固化所得到的溶液，干燥所述固化培养基，以便除去水分，其中，以一定量除去水分，以便所述固体培养基在除去水分之后具有至少为0.05毫升/分钟的10分钟时间平均吸水速度，并且所述溶剂水的量大于用于培养基的特定量，所多出的量几乎等于要除去的水的量。所述固体培养基不会由于干燥条件导致微生物的生长抑制，在短时间内具有增加量的样品，并且因此特别适用于对微生物的集落计数进行快速和准确的测量。
文档编号C12N1/20GK1487994SQ01822377
公开日2004年4月7日 申请日期2001年8月9日 优先权日2001年1月29日
发明者外山一吉, 清泷兼司, 狩野健一郎, 佐佐木一枝, 福渡康夫, 矢野阳一郎, 中川稔, 一枝, 一郎, 司, 夫 申请人:森永乳业株式会社