专利名称：制造d-丝氨酸的方法
技术领域：
本发明关于D-丝氨酸的制造方法以及与该制造方法有关的微生物，其特征在于，在含有DL-丝氨酸的介质中，使已修饰为具有比大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α菌株所具有的L-丝氨酸脱氨酶活性高的L-丝氨酸脱氨酶活性的微生物细胞、该细胞的培养物或它们的加工产物和DL-丝氨酸接触，分解L-丝氨酸，从该介质中提取残存的D-丝氨酸。D-丝氨酸是一种有用的化合物，可作为D-环丝氨酸等药物的合成中间体。
背景技术：
关于D-丝氨酸，已知有以下的制造方法。
(i)通过微生物作用，由DL羟基甲基乙内酰脲生成N氨基甲酰基-D-丝氨酸，然后水解，得到D-丝氨酸的方法(特开昭61-152291)。
(ii)在含有DL-丝氨酸的培养基中，培养假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、隐球菌属(Cryptococcus)、复膜孢糖酵母属(Saccharomycopsis)、汉森酵母属(Hansenula)、埃希氏杆菌素(Escherichia)、克雷白氏杆菌素(Klebsiella)、普罗威登斯菌属(Providencia)、微杆菌素(Microbacterium)或沙雷氏菌属(Serratia)中同化L-丝氨酸而不同化D-丝氨酸的微生物，从培养液中分离D-丝氨酸的方法(特开昭64-2594)。
(iii)使具有酪氨酸酶活性的微生物和含有DL-丝氨酸和酚的反应液相互作用，将L-丝氨酸转换成L酪氨酸，提取残存的D-丝氨酸的方法(特开平5-91895)。
这些制造方法的任何一种，用作工业D-丝氨酸的制造方法都存有难度。即(i)的方法中，从DL羟基甲基乙内酰脲得到N氨基甲酰基-D-丝氨酸的收率低至40％，同时需要大量用作催化剂的菌；(ii)的方法中，反应结束后，仍然残存有L-丝氨酸，最终需要进行DL-丝氨酸的分离；(iii)的方法中，基质浓度低至1％，同时反应中需要有害的酚，这些方面造成这些制造方法在工业生产中的利用困难。
已知大肠杆菌具有将L-丝氨酸分解成氨、丙酮酸和水的L-丝氨酸脱氨酶活性[J.Bacteriol.，171，5095-5102(1989)，Eur.J.Biochem.，212，777-784(1993)]。可是，据报道，从大肠杆菌中提取的该酶在反应时需要添加铁和还原剂等复杂的条件[J.Bacteriol.，162，1270-1275(1985)]，而将这种纯化酶用于D-制造丝氨酸的的方法也不实用。
此外，已知大肠杆菌还具有分解D-丝氨酸的D-丝氨酸脱氨酶活性[J.Bacteriol.，121，1092-1101(1975)]。因此，使用大肠杆菌利用L-丝氨酸脱氨酶从DL-丝氨酸中生产的D-丝氨酸，由于该D-丝氨酸脱氨酶的作用，发生分解，造成生成效率低下。
因此，按照已知的方法，不能建立从DL-丝氨酸有效生产D-丝氨酸的方法。
发明内容
本发明的目的是提供工业上有利的D-丝氨酸的制造方法。
本发明者发现，在修饰为具有比大肠杆菌DH5α菌株高的L-丝氨酸脱氨酶活性的大肠杆菌中，不提取或纯化L-丝氨酸脱氨酶的条件下，使该菌或者菌加工产物和DL-丝氨酸接触，由此，意外地几乎没有减少D-丝氨酸，同时可迅速地将L-丝氨酸分解减少到检测限以下，可工业制造D-丝氨酸，至此完成了本发明。
本发明关于下面的(1)～(12)。
(1)D-丝氨酸的制造方法，其特征在于，在含有DL-丝氨酸的介质中，使修饰为具有比大肠杆菌DH5α菌株高的L-丝氨酸脱氨酶活性的微生物细胞、该细胞的培养物或它们的加工产物与DL-丝氨酸接触，分解L-丝氨酸，从介质中提取残留的D-丝氨酸。
(2)D-丝氨酸的制造方法，其特征在于，在含有DL-丝氨酸的培养基中，培养修饰为具有比大肠杆菌DH5α菌株高的L-丝氨酸脱氨酶活性的微生物，分解L-丝氨酸，从该培养物中提取残留的D-丝氨酸。
(3)上述(1)和(2)的D-丝氨酸制造方法，其中经过修饰的微生物是具有L-丝氨酸脱氨酶活性的微生物经过突变处理后得到的突变微生物。
(4)上述(1)和(2)的D-丝氨酸制造方法，其中经过修饰的微生物是将L-丝氨酸脱氨酶基因引入到微生物中得到的转化微生物。
(5)上述(1)～(4)中任何一项的D-丝氨酸制造方法，其中经修饰的微生物的L-丝氨酸脱氨酶活性为大肠杆菌DH5α株所具有的L-丝氨酸脱氨酶活性的2倍以上。
(6)上述(1)～(4)中任何一项的D-丝氨酸制造方法，其中经修饰的微生物的L-丝氨酸脱氨酶活性为大肠杆菌DH5α株所具有的L-丝氨酸脱氨酶活性的5倍以上。
(7)上述(4)中的D-丝氨酸制造方法，其中L-丝氨酸脱氨酶基因是来源于大肠杆菌的sdaA基因或sdaB基因。
(8)上述(1)～(7)中任何一项的D-丝氨酸制造方法，其中经修饰的微生物都是大肠杆菌属微生物。
(9)上述(1)～(8)中任何一项的D-丝氨酸制造方法，其中经过修饰的微生物选自大肠杆菌DH5α/pHIB、大肠杆菌NM522/pHIA1、大肠杆菌MM294/pHIA1、大肠杆菌MM294/pHIA2、大肠杆菌MM294/pHIB以及大肠杆菌ME5 386/pHIA2的微生物。
(10)上述(1)～(9)中任何一项的D-丝氨酸制造方法，其中修饰的微生物是D-丝氨酸脱氨酶活性低或者没有这种酶活性的微生物。
(11)属于大肠杆菌属并修饰为具有比大肠杆菌DH5α菌株的L-丝氨酸脱氨酶活性高的L-丝氨酸脱氨酶活性的微生物。
(12)上述(11)中的微生物，选自大肠杆菌DH5α/pHIB、大肠杆菌NM522/pHIA1、大肠杆菌MM294/pHIA1、大肠杆菌MM294/pHIA2、大肠杆菌MM294/pHIB以及大肠杆菌ME5386/pHIA2。
以下对本发明进行详细说明1.得到修饰为具有比大肠杆菌DH5α株高的L-丝氨酸脱氨酶活性的微生物。
本发明所用的修饰为具有比大肠杆菌DH5α菌株(东洋纺制造、以下同)高的L-丝氨酸脱氨酶活性的微生物(以下略称为修饰的微生物)可以按照以下的方法得到。
待修饰的微生物(以下称为亲代株)可以是具有L-丝氨酸脱氨酶活性的微生物，也可以是不具有L-丝氨酸脱氨酶活性的微生物。
如果亲代株具有L-丝氨酸脱氨酶活性，则可以按以下(1)到(2)的方法得到修饰的微生物。
如果亲代株不具有L-丝氨酸脱氨酶活性，则可以按以下(2)所记载的方法得到修饰的微生物。
此外，本发明的制造方法可以高回收率制造D-丝氨酸，因此，即使存在D-丝氨酸脱氨酶造成的D-丝氨酸的水解，也能够高效率制造D-丝氨酸。
所以，亲代株不论是否具有D-丝氨酸脱氨酶活性都可以。
(1)根据突变处理法得到目的菌株修饰的微生物可以由通过对亲代株进行诱变处理、发生突变而得到的微生物(以下略称为突变微生物)中得到。
突变处理法可以采用任何常用的方法。例如使用诱变剂的方法、紫外线照射的方法。
采用诱变剂的方法，优选使用例如N-甲基N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)的方法(微生物试验手册，131页，1986年，讲谈社サイエンテイフイツク出版社)。
经过突变处理的微生物按照下述的方法进行培养，筛选L-丝氨酸脱氨酶活性比大肠杆菌DH5α菌株高的微生物，由此可得到修饰的微生物。
L-丝氨酸脱氨酶活性至少比大肠杆菌DH5α菌株高即可，优选高2倍以上，更优选高5倍以上。
L-丝氨酸脱氨酶活性的测定可以按照《酶方法》(Meth.Enzymol.)，17B，346(1971)，《酶方法》，17B，351(1971)等记载的方法进行。此外，作为简便方法，可以按照下述的方法进行。
即，在修饰的微生物和DL-丝氨酸接触后，测定反应液中残留的L-丝氨酸的量，可以计算出单位时间内L-丝氨酸减少的量，以此进行测定。
例如从反应开始到反应的某一个时间内，测定L-丝氨酸的减少量即测定分解量，将所得到的分解量的值除以反应时间，计算单位时间L-丝氨酸的分解量，所得到的值为L-丝氨酸脱氨酶的活性。
具体而言，将得到的突变微生物在30℃培养1天，把得到培养液离心分离得到菌。培养基只要是能够培养该突变微生物的培养基即可，可以采用这样的任何培养基。将该菌悬浮在50mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.5)中，将离心得到的菌(湿菌重量约2g)用于反应。
于含有50g/LDL-丝氨酸的磷酸缓冲液(pH7.5)中悬浮得到的菌，在37℃反应10～22小时。反应结束后，用HPLC定量测定D-丝氨酸和L-丝氨酸的浓度，计算缓冲液中的含量。
(2)基因重组方法用以下所述的方法得到L-丝氨酸脱氨酶的基因，将该基因引入到宿主细胞中，由此可得到修饰的微生物。
(a)L-丝氨酸脱氨酶基因的获得在已知的大肠杆菌的L-丝氨酸脱氨酶的基因序列[J.Bacteriol.，171，5095-5102(1989)、Eur.J.Biochem.，212，777-784(1983)]的基础上，可以进行L-丝氨酸脱氨酶的基因的克隆。下面，举例说明得到大肠杆菌的L-丝氨酸脱氨酶基因sdaA、sdaB的方法。但L-丝氨酸脱氨酶基因的来源只要是具有L-丝氨酸脱氨酶活性的微生物即可，不限于大肠杆菌。
例如，可通过以下的方法得到。
在适于培养大肠杆菌的培养基，例如LB培养基(在1升水中含有细菌用胰蛋白胨(Difco公司制造)10g、酵母提取物(Difco公司制造)5g和NaCl5g，并调节pH值至7.2的培养基)，按照常规方法培养大肠杆菌，例如大肠杆菌W3110菌株。培养后，离心分离培养物得到菌。
将得到的菌按照已知的方法[例如Sambrook，J.Etal.，MolecularCloningAlaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)，以下简称为分子克隆第3版]分离得到染色体DNA。
利用J.Bacteriol.，171，5095-5102(1989)以及Eur.J.Biochem.，212，777-784(1993)所记载的L-丝氨酸脱氨酶基因的碱基序列信息，采用DNA合成仪，合成含有与sdaA基因和sdaB基因相对应的碱基序列的有义引物和反义引物。
用得到的有义和反义引物以及染色体DNA，根据PCR法，扩增得到DNA片断。为了能将扩增DNA片断导入到质粒中去，优选在有义引物和反义引物的5’末端添加适当的限制酶位点，例如BamHI等限制性酶位点。
作为该有义和反义引物的组合，可以列举例如具有序列号1和序列号2所记载的碱基序列的2种引物的组合，以及具有序列号1以及序列号3所记载的碱基序列的2个引物的组合(用于sdaA)、具有序列号4以及序列号5所记载的碱基序列的2个引物的组合(用于sdaB)。
以染色体DNA作为模板，使用这些引物、TaKaRaLA-PCRTMKitVer.2(宝酒造社制)或ExpandTMHigh-FidelityPCRSystem(BoehringerMannheim社制)，在DNAThermalCycler(PerkinElmerJapan公司制造)中，进行PCR。
作为PCR条件，在上述引物为2Kb以下的DNA片断时，以由94℃、30秒，55℃、30秒到1分钟，72℃、2分钟组成的反应工序作为1个循环，超过2kb以上的DNA片断时，以由98℃、20秒，68℃、3分钟组成的反应工序作为1个循环，各自进行30个循环后，在72℃反应7分钟。
由PCR扩增得到的DNA片断和可在大肠杆菌中扩增的载体，采用限制性酶，在和上述引物中添加的限制性酶位点相同的位点切断，然后进行琼脂糖凝胶电泳、蔗糖密度梯度超离心分离，回收DNA片断。
采用回收的DNA片断，按照常规方法，例如《分子克隆》第2版，CurrentProtoclolsinMolecularBiology，Supplement1～38，JohnWiley&Sons(1987-1997)以下，简称为分子生理学的现代方法-补篇，DNACloning1CoreTechniques，APracticalApproach，第二版，OxfordUniversityPress(1995)等记载的方法，或市售的试剂盒、例如SuperScriptPlasmidSystemforcDNASynthesisandPlasmidCloning(LifeTechcologies公司制造)和ZAP-cDNASynthesisKit[Stratagene公司制造]制备克隆载体，使用制备的克隆载体，转化大肠杆菌，例如大肠杆菌DH5α菌株(东洋纺社制)。
作为可用于大肠杆菌转化的克隆载体，只要是能够在大肠杆菌K12株中自主复制就可以，可以使用嗜菌体载体、质粒载体等。也可使用大肠杆菌表达载体作为克隆载体。具体有ZAPExpress[Stratagene公司、Strategies，5，58(1992)]、pBluescriptIISK(+)[NucleicAcidsResearch，17，9494(1989)]、LambdaZAPII(Stratagene公司制造)、λgt10、λgt11[DNACloning，APracticalApproach，1，49(1985)]、λTriplEx(Clontech公司制造)、λExCell(Pharmacia公司制造)、pT7T318U(Pharmacia公司制造)、pcD2[Mol.Cell.Biol.，3，280(1983)]、pMW218(和光纯药工业制造公司)、pUC118、pSTV28(宝酒造社制)、pEG400[J.Bacteriol.，172，2392(1990)]、pHMV1520(MoBiTec公司制造)、pQE-30(QIAGEN公司制造)等。
从得到的转化菌株中，按照常规方法，例如分子克隆第3版、分子生理学的现代方法-补篇、DNACloning1CoreTechniques，APracticalApproach，第二版，OxforduniversityPress(1995)等记载的方法得到含有目的基因的质粒。
根据上述方法，可以得到含有编码具有L-丝氨酸脱氨酶活性的蛋白质的基因的质粒。该质粒可以是例如实施例所示的pHIA1、pHIA2、pHIB。
用同样的方法，可以从基因组的DNA碱基序列公知的生物中得到L-丝氨酸脱氨酶的基因。此外，即使是基因组的DNA碱基序列尚未知的生物，也可以使用适当的载体，建立以大肠杆菌为宿主的染色体DNA文库，通过检测文库中各个菌株的L-丝氨酸脱氨酶的活性，得到含有编码具有L-丝氨酸脱氨酶活性的蛋白质的DNA的质粒。
(b)L-丝氨酸脱氨酶基因的表达方法为使在上述方法中得到的编码L-丝氨酸脱氨酶的DNA在宿主细胞中表达，首先，用限制酶或者DNA分解酶切割编码目的L-丝氨酸脱氨酶的DNA，切成含有编码区域的适当长度的DNA片断，然后，将该DNA片断插入到表达载体启动子的下游，然后，将插入该DNA的表达载体导入到适合该表达载体的宿主细胞中。
宿主细胞可以是原核生物、酵母、动物细胞、昆虫细胞等，只要是能够表达目的基因的都可以使用。
作为表达载体，只要能够在上述宿主细胞中自主复制并且能够重组到染色体中，在能够转录上述目的DNA的位置含有启动子即可使用。
用细菌、放线菌等原核生物作为宿主细胞时，优选的是，用于表达上述DNA的表达载体在该原核生物中能够自主复制的同时，为由启动子、核糖体结合序列、上述DNA以及转录中止序列构成的重组载体。也可以含有控制启动子的基因。
作为表达载体，可以示例例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均为BoehringerMannheim公司制造)、pKK233-2(Pharmacia公司制造)、pSE280(Invitrogen公司制造)、pGEMEX-1(Promega公司制造)、pQE-8(QIAGEN公司制造)、pQE-30(QIAGEN公司制造)、pKYP10(特开昭58-110600)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4306(1985)]、pBluescriptIISk+、pBluescriptIISK(-)(Stratagene公司制造)、pTrS30(FFRMBP-5407)、pTrS32(FFRMBP-5408)、pGEX(Pharmacia公司制造)、pET-3(Novagen公司制造)、pTerm2(USP4686191、USP4939094、USP5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18[Gene，33，103(1985)]、pUC19[Gene，33，103(1985)]、pSTV28(宝酒造社制)、pSTV29(宝酒造社制)、pUC118(宝酒造社制)、pPA1(特开昭63-233798)、pEG400[J.Bacteriol.，172，2392(1990)]、pQE-30(QIAGEN公司制造)、PHY300(宝酒造社制造)、pHW1520(MoBiTec公司制造)等。
作为启动子，只要能够在宿主细胞中进行表达的即可。例如可以是trp启动子(Ptrp)、lac启动子(Plac)、PL启动子、PR启动子、PSE启动子等大肠杆菌和噬菌体等来源的启动子、SP01启动子、SP02启动子、penP启动子等。此外也可使用2个Ptrp串连的启动子(Ptrpx2)、tac启动子、letI启动子、lacT7启动子等人为设计修饰的启动子等。此外，也可以使用用于在芽孢杆菌(Bacillus)属细菌中表达的xylA启动子和用于在棒状杆菌属细菌中表达的P54-1启动子。
核糖体结合序列，只要能够在宿主细胞中表达的就可以。优选使用SD序列(Shine-Dalgarno序列)和起始密码子间调节为适当距离(例如6～18个碱基)的质粒。
为了有效的进行翻译和转录，可以表达这样的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合具有L-丝氨酸脱氨酶活性的蛋白质的N末端或者其一部分的蛋白质和表达载体编码的蛋白质的N-末端部分而得。
在表达目的蛋白时，转录中止序列并不总是必要的，但是优选在紧接着结构基因的下游处配置转录中止序列。
作为宿主细胞，可以采用大肠杆菌属(Escherichia属)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽胞杆菌属(Bacillus)、微杆菌属(Microbacterium)、沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、组囊蓝细菌属(Anacystis)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azobacter)、着色菌属(Chromatium)、欧文氏菌属(Erwinia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、席蓝细菌属(Phormidium)、红细菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、Scenedesmus属、链霉菌属(Streptomyces)、聚球蓝细菌属(Synnechococcus)、发酵单胞菌属(Zymomonas)等属的微生物。
例如可以使用大肠杆菌、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、短杆菌(Brevibacteriumimmariophilum)、解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、嗜氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)、金黄节杆菌(Arthrobacteraurescens)、烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)、硫磺节杆菌(Arthrobactersulfureus)、产脲节杆菌(Arthrobacterureafaciens)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、席蓝细菌属(Phormidiumsp.)、类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)、深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)、金霉素链霉菌(Streptomycesaureofaciens)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)等。
更具体而言，可以列举大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene公司制造)、大肠杆菌XL2-Blue(Stratagene公司制造)、大肠杆菌DH1(分子克隆第2版p505)、大肠杆菌DH5α(东洋纺社制)、大肠杆菌MC1000[Mol.Biol.，138，179-207(1980)]、大肠杆菌W1485(ATCC12435)、大肠杆菌JM109(Stratagene公司制造)、大肠杆菌HB101(东洋纺社造)、大肠杆菌W3110(ATCC14948)、大肠杆菌NM522(Stratagene公司制造)、枯草杆菌ATCC33712、芽孢杆菌属(Bacillussp.)FERMBP-6030、短杆菌(Brevibacteriumimmariophilum)ATCC14068、解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)ATCC14066、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)ATCC14067、乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)ATCC13869、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC14297、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC13870、嗜氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)ATCC15354、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)ATCC13880、发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)ATCC11325、金黄节杆菌(Arthrobacteraurescens)ATCC13344、烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)ATCC15236、硫磺节杆菌(Arthrobactersulfureus)ATCC19098、产脲节杆菌(Arthrobacterureafaciens)ATCC7562、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)ATCC15390、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)ATCC21434、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)DSM1337、席蓝细菌属(Phormidiumsp.)ATCC29409、类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)ATCC21286、深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)ATCC11170、金霉素链霉菌(Streptomycesaureofaciens)ATCC10762、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)ATCC10137、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)ATCC10988等。
作为D-丝氨酸脱氨酶活性低的微生物或者D-丝氨酸脱氨酶活性缺损的微生物，可以列举例如大肠杆菌ME5386菌株(可以从国立遗传研究院得到)。
作为将重组载体导入到宿主细胞的方法，只要能将DNA导入宿主细胞的方法就可以使用。例如可列举钙离子法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)]、原生质体法(特开昭63-248394)、电穿孔法以及Gene，17，107(1982)和Molecular&GeneralGenetics，168，111(1979)等所记载的方法。
用酵母作为宿主细胞时，作为表达载体可以列举如YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
作为启动子，只要能够在酵母中表达的就可以，例如PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、ga11启动子、ga110启动子、热激蛋白启动子、MFa1启动子、CUP1启动子等启动子。
作为宿主细胞，可以列举糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、丝孢酵母属(Trichosporon属)、许旺氏酵母属(Schwanniomyces)、毕赤氏酵母属(Pichia属)、假丝酵母属(Candida属)的微生物，例如啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyceslactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporonpullulans)、河岸许旺氏酵母(Schwanniomycesalluvius)、产朊假丝酵母(Candianutilis)等。
作为重组载体的导入方法，只要是能够将DNA导入到酵母中的方法就可以采用，例如可列举电穿孔法[MethodsinEnzymol.，194，182(1990)]、原生质球法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)]、醋酸锂法[J.Bacteriol.，153，163(1983)]、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)中记载的方法等。
宿主细胞是动物细胞时，表达载体可以列举pcDNAI、pcDM8(フナコシ公司制造)、pAGE107[特开平3-22979；Cytotechnology，3，133，(1990)]、pAS3-3(特开平2-227075)、pCDM8[Nature，329，840，(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制造)、pREP4(Invitrogen公司制造)、pAGE[J.Biochem.1011307(1987)、pAGE210等。
启动子只要是可以在动物细胞中进行表达的启动子就可以使用。例如可列举巨细胞病毒(人CMV)的IE(立即早期)基因的启动子、SV40早期启动子、反转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热激启动子以及SRα启动子等。此外，也可以把人CMV的IE基因的增强子和启动子一起使用。
作为宿主细胞，可以列举Namalwa(ナマルバ)细胞、HBT5637(特开昭63-000299)、COS1细胞、COS7细胞、CHO细胞等。
作为向动物细胞导入重组载体的方法，只要能将DNA导入到动物细胞中的方法即可使用，例如可以采用电穿孔法[Cytotechnology，3，133(1990)]、磷酸钙法(特开平2-227075)、脂转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84，7413，(1987)]、Virology，52，456(1973)所记载的方法等。得到以及培养转化体的方法可以按照特开平2-227075号和特开平2-257891号公报所记载的方法进行。
用昆虫细胞作为宿主细胞时，例如，根据《杆状病毒表达载体》(BaculovirusExpressionVectors，ALaboratoryManual，W.H.FreemanandCompany，NewYork(1992))，《分子生理学的现代方法》(CurrentProtocolsInMolecularBiology，SupplementandBio/Technology，6，47(1988))等所记载的方法，能够实现蛋白表达。即，将重组基因导入载体和杆状病毒共同导入到昆虫细胞中，得到昆虫细胞培养物上清夜中的重组病毒，再用重组的病毒感染昆虫细胞，实现蛋白表达。
作为在该方法中使用的基因导入载体，例如可以使用pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(均由Invitrogen公司制造)。
作为杆状病毒病毒，例如可以使用感染夜盗蛾科昆虫的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus)等。
作为昆虫细胞，可以使用草地粘虫(Spodopterafrugiperda)的卵巢细胞Sf9、Sf21[BaculovirusExpressionVectors，ALaboratoryManual，W.H.FreemanandCompany，NewYork(1992)])、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)的卵巢细胞High5(Invitrogen公司制造)等。
为了制备重组病毒，向昆虫细胞中导入上述重组基因导入载体和上述杆状病毒的共导入方法可以使用例如磷酸钙法(特开平2-227075)、脂转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]等。
作为基因的表达方法，除了直接表达外，还可以按照分子克隆第2版所记载的方法，进行分泌生产、融合蛋白表达等。
用酵母、动物细胞以及昆虫细胞进行表达的时候，可以得到添加糖或者糖链的蛋白质。
2.培养修饰的微生物上述1得到的本发明的修饰的微生物在培养基中培养的方法，可以按照培养宿主细胞常用的方法。当本发明的修饰的微生物是大肠杆菌等原核微生物、酵母菌等真核微生物时，培养这些微生物的培养基可以是天然培养基，也可以是合成培养基，只要它们含有可以被这些微生物同化的碳源、氮源、无机盐等，并能够有效培养转换体。
作为碳源，只要是能够被修饰的微生物同化的物质就可以。可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖以及含有这些糖的糖蜜、淀粉或者淀粉的水解物等碳水化合物、乙酸、丙酸等有机酸、乙醇、丙醇等醇类物质。
作为氮源、可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等各种无机酸以及有机酸的铵盐、其它的含氮化合物，还可以采用蛋白胨、肉膏、酵母膏、玉米浆、酪蛋白水解物、豆饼、豆饼水解物、各种发酵菌以及其消化物。
作为无机盐，可以使用磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养可以采用震荡培养或者深部通气搅拌培养等的需氧条件。培养温度可以在15～50℃之间，培养时间通常为16小时～7天。培养时的pH保持在3.0～9.0。可以使用无机酸或者有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨水等调节pH。
此外，根据培养需要，可以添加苄氨青霉素或者四环素等抗生素到培养基中。
在培养采用可诱导的启动子作为启动子的表达载体转化的微生物时，根据需要，可以向培养基中加入诱导物。例如培养使用了lac启动子的表达载体转化的微生物时，可以向培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(thiogalactopyranoside)(IPTG)等，培养使用了trp启动子的表达载体转化的微生物时，可以加入吲哚丙烯酸(IAA)、培养使用xy1A启动子的表达载体转化的微生物时，可以加入木糖。
本发明修饰的微生物是动物细胞时，作为培养修饰的动物细胞的培养基，可以使用一般使用的RPMI1640培养基[TheJournaloftheAmericanMedicalAssociation，199，519(1967])、Eagle的MEM培养基[Science，122，501(1952)]、DMEM培养基[Virology，8，396，(1959)]、199培养基[ProceedingoftheSocietyfortheBiologicalMedicine，73，1(1950)]或向这些培养基中添加了胎牛血清等的培养基等。
培养通常在pH6～8，30～40℃，5％CO2存在等的条件下进行1～7天。
此外，根据培养需要，可以向培养基中加入卡那霉素、青霉素等抗生素。
当本发明的修饰的微生物是昆虫细胞时，作为培养修饰的昆虫细胞的培养基，可使用一般使用的TNM-FH培养基[PharMingen公司制造]、Sf-900IISFM培养基(GIBCOBRL公司制造)、ExCell400、ExCell405[均为JRHBiosciences公司制造]、Grace’sInsectMedium[Grace，T.C.C.，Nature，195，788(1962)]等。
培养通常在pH6～7，25～30℃等条件下进行1～5天。
此外，根据培养需要，可以在培养基中添加庆大霉素等抗生素。
3.D-丝氨酸的制造在含有DL-丝氨酸的介质中，将修饰的微生物与DL-丝氨酸接触，分解L-丝氨酸，从该介质中提取残留的D-丝氨酸，由此可制造D-丝氨酸。
转化体以及突变微生物中的L-丝氨酸脱氨酶活性的增强程度，与大肠杆菌DH5α株相比较活性必须得到增强，比大肠杆菌DH5α株的L-丝氨酸脱氨酶活性强即可，优选为2倍以上，尤其优选为5倍以上。
此外，使用D-丝氨酸脱氨酶活性低的，或者不具有该活性的菌株，也能够提高D-丝氨酸的制造效率。
L-丝氨酸脱氨酶活性的测定可以按照上述1.(1)的方法。
用这些微生物制造D-丝氨酸可以按照以下的方法进行。
即，将上述方法得到的修饰的微生物细胞、该细胞的培养物或其加工产物(以下称酶源)在介质中与DL-丝氨酸接触。
细胞或该细胞的加工产物可以是细胞干燥物、冻干物、表面活性剂加工产物、酶加工产物、超声破碎物、机械磨碎物、溶剂加工产物等细胞加工产物、培养物的浓缩物、干燥物等培养加工产物、细胞蛋白组分、细胞以及细胞加工产物的固定化物、或者从细胞中得到的纯化酶等。
修饰的微生物和DL-丝氨酸的接触可以是向培养该修饰的微生物的培养基中事先添加DL-丝氨酸的方法，也可是在培养过程中添加DL-丝氨酸的方法。此外，将经培养该修饰的微生物而得到的酶源添加到含有DL-丝氨酸的介质中也可以。
当向培养修饰的微生物的培养基中添加DL-丝氨酸时，在培养开始时以及培养过程中，在每ml培养基中添加1～300mgDL-丝氨酸，优选添加30～100mgDL-丝氨酸。可以按照上述(2)中记载的条件进行培养。
当将从修饰的微生物中得到的酶源与DL-丝氨酸在介质中接触时，该酶源的量因该酶源的比活性等而有所不同。例如用该修饰的微生物细胞作为酶源时，每1mgDL-丝氨酸和5～1000mg湿菌作用，优选和10～400mg湿菌作用。
优选在20～50℃进行接触反应，尤其优选在25～37℃进行接触反应。反应的时间因酶源的用量和比活性不同而有所不同，通常反应2～150小时，优选5～60小时。
作为介质，可以用水或水溶性介质、有机溶剂或水或水溶性介质和有机溶剂的混合物。作为水溶性介质，例如可以用磷酸缓冲液、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸)缓冲液、三[(三羟甲基氨基甲烷)]盐酸缓冲液等缓冲液。作为有机溶剂，只要不妨碍反应的物质就可以，例如丙酮、乙酸乙酯、二甲基亚砜、二甲苯、甲醇、乙醇、丁醇等。
当向介质中添加DL-丝氨酸时，可将DL-丝氨酸溶解到能溶解DL-丝氨酸的水或水溶性溶剂、有机溶剂、或水或水溶性介质和有机溶剂的混合液中，添加到介质中去，或者保持粉末或者细颗粒状态直接添加也可以。
从反应介质中提取D-丝氨酸通常采用常规的有机合成化学中所采用的方法，例如用有机溶剂进行抽提、结晶、薄层层析、高效液相层析等。
确认以及定量本发明得到的D-丝氨酸的方法可以采用任何能够确认或者定量D-丝氨酸的方法。例如13C-NMR谱、1H-NMR谱、质谱、高效液相色谱(HPLC)等方法。
以下所示的是本发明的实施例，不过本发明不限定在这些实施例中。
实施本发明的最佳方式实施例11)L-丝氨酸脱氨酶基因的获得用白金环将大肠杆菌W3110菌株(ATCC14948)接种到10mlLB培养基中，30℃培养过夜。培养结束后，将得到的培养液进行离心分离(3000rpm、10分钟)，进而得到菌。从该菌中按照常规方法(分子克隆，第2版所记载的方法)分离纯化染色体DNA。
以编码L-丝氨酸脱氨酶的基因sdaA[J.Bacteriol.，171，5095-5102(1989)]的碱基序列信息为基础，用DNA合成仪分别合成具有为有义引物和反义引物的组合的序列号1和2所记载的碱基序列的2种引物、序列号1和3所记载的碱基序列的2种引物，并基于和sdaA同样编码L-丝氨酸脱氨酶的基因sdaB[Eur.J.Biochem.，212，777-784(1993)]所具有的碱基序列信息，用DNA合成仪合成具有序列号4和5所记载的碱基序列的2种引物。
以染色体DNA为模板，用这些引物、pfupolymerasecloned(Stratagene公司制造)以及pfupolymerse1OXReactionBuffer(standardbuffer)在DNAThermalCycler(PerkinElmerJapan公司制造)中进行PCR。
PCR采用94℃30秒，55℃30秒～1分钟，72℃2分钟组成1个循环的反应步骤，30个循环后，72℃反应7分钟的反应条件。PCR扩增得到的DNA片断分别用限制酶HindIII和限制酶BamHI处理、将处理后的限制酶处理DNA片断进行琼脂糖电泳，获得各个限制酶处理得到的DN片断。
(2)重组DNA的制造将具有氨苄西林抗性基因和Trp启动子的载体质粒pTrS30(按照常规方法从FERMBP-5407中抽提得到)用限制酶HindIII和BamHI消化后，进行琼脂糖电泳，得到HindIII-BamHI处理pTrS30片断。
将上述得到HindIII-BamHI处理DNA片断和HindIII-BamHI处理pTrS30片断混合后，通过链接反应得到重组DNA。
采用该重组DNA，按照常规方法转化大肠杆菌DH5α菌株中(东洋纺社制)，将该转化体涂布在含有100μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养基[1升水中含有蛋白胨(Difco公司制造)10g、酵母膏(Difco公司制造)5g、NaCl5g，调整pH7.2，添加1.5％的琼脂的培养基]上，30℃培养1天。
将在该培养基上生长的转化体克隆挑取数个分别在含有100μg/mL氨苄西林的10mlLB培养基中30℃培养一天。
离心分离得到的培养液，得到菌，从该菌中按照常规方法分离质粒。
HindIII-BamHI处理DNA片断(用含有序列号1和2记载的碱基序列的2种引物组合，PCR扩增得到的DNA片断)和HindIII-BamHI处理pTrS30片断连接所得到的质粒，定名为pHIA1，HindIII-BamHI处理DNA片断(用含有序列号1和3记载的碱基序列的2种引物组合，PCR扩增得到的DNA片断)和HindIII-BamHI处理pTrS30片断连接所得到的质粒定名为pHIA2，HindIII-BamHI处理DNA片断(用含有序列号4和5记载的碱基序列的2种引物组合，PCR扩增得到的DNA片断)和HindIII-BamHI处理pTrS30片断连接所得到的质粒定名为pHIB1。
3)转化体的制备将这些得到的质粒按照常规方法导入到大肠杆菌NM522(Stratagene公司制造)、大肠杆菌MM294(ATCC33625)以及D-丝氨酸脱氨酶活性缺失的大肠杆菌ME5386菌株(从国立遗传研得到)中。
这些菌株中，在平成12年9月28日，将含有pHIA1的大肠杆菌MM294/pHIA1、含有pHIA2的大肠杆菌MM294/pHIA2以及含有pHIB的大肠杆菌MM294/pHIB，按照布达佩斯条约，分别以FERMBP-7309、FERMBP-7310和FERMBP-7311交给独立行政法人产业技术综合研究所专利生物寄托中心日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6(旧工业技术院生命工学工业技术研究所日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号)保存。
实施例2L-丝氨酸脱氨酶的表达以及D-丝氨酸的制造将上述得到的转化体和具有不含L-丝氨酸脱氨酶基因的质粒pTrS30的大肠杆菌DH5α/pTrS30菌株在含有100μg/mL氨苄西林的100mLLB培养基中于30℃下培养1天。离心分离得到的培养液得到菌，将这些菌在50mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.5)中再次重悬，离心分离，将得到的菌(湿菌重量约5g)用于反应。
用含有50g/LDL-丝氨酸的磷酸缓冲液(pH7.5)悬浮上述菌，在37℃反应10小时～22小时。
用HPLC定量反应开始时、反应过程中以及反应结束后的反应液中的D-丝氨酸以及L-丝氨酸的浓度。
HPLC的条件如下所示柱CRAWNPAKCR(+)(DaicelChemicalIndustries，Ltd.)流动相过氯酸水溶液(pH1.0)流速；0.2mL/分柱温2℃以采用邻苯二甲醛(OPA)检测器的柱后衍生物化法检测[J.Chromatogr.，33，353-355(1973)]。
结果示于表1表1L-丝氨酸D-丝氨酸L-丝氨酸反应时间 相对活性总分解量浓度浓度菌株 质粒(小时)(g/l) (g/l) (g/l)DH5α pTrS3012 1.41.021 23.2 21.5DH5α pHIB 12 19.8 14.121 24.9 0.0NM522pHIA1 11 21.6 16.821 23.7 0.0ME5386 pHIA2 12 23.525.6 0.0 16.8MM294pHIA1 10 20.3 17.422pHIA2 10 19.4 16.622 24.3 0.0pHIB 10 8.57.322计算反应开始后第10、11以及12小时时反应液中L-丝氨酸的浓度，用和反应开始时反应液中的L-丝氨酸的浓度的差表示L-丝氨酸的总的分解量。
用L-丝氨酸的总分解量除以反应开始后的时间(10、11以及12小时)的比值作为L-丝氨酸脱氨酶的活性，以大肠杆菌DH5α/pTrS30菌株的L-丝氨酸脱氨酶活性为1时各菌株的活性作为各个菌株的相对活性。
从表1中能够明确的是，经测定大肠杆菌ME5386/pHIA2株在反应开始后第12小时、大肠杆菌DH5α/pHIB株以及大肠杆菌NM522/pHIA1株在反应开始后第21小时、大肠杆菌NM294/pHIA2株在反应开始后第22小时的L-丝氨酸和D-丝氨酸的浓度，可知反应液中残留的L-丝氨酸量是0，只残存了D-丝氨酸。
工业应用的可能性根据本发明，从DL-丝氨酸中，能够有效生成出可以用作D-环丝氨酸等有用药品的合成中间体物质的D-丝氨酸。
序列表内容序列号1合成DNA序列号2合成DNA序列号3合成DNA序列号4合成DNA序列号5合成DNA
序列表<110>协和发酵工业株式会社<120>制造D-丝氨酸的方法<130>11349WO1<140>
<141>
<150>JP00/334751<151>2000-11-01<160>5<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成DNA<400>1ccatcgataa gcttatgatt agtctattcg acatgtttaa gg 42<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成DNA<400>2cgcggatcct ggggaatatt acagcagac 29
<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成DNA<400>3cgcggatcca gaagtattag tcacactgga c 31<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成DNA<400>4cccaagctta tgattagcgt attcgatatt ttc 33<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成DNA<400>5cgggatccat gagaaatcgg gaagaggc 28
权利要求
1.制造D-丝氨酸的方法，其特征在于，在含有DL-丝氨酸的介质中，使修饰为具有比大肠杆菌DH5α菌株高的L-丝氨酸脱氨酶活性的微生物细胞、该细胞的培养物或它们的加工产物与DL-丝氨酸接触，分解L-丝氨酸，从介质中提取残留的D-丝氨酸。
2.制造D-丝氨酸的方法，其特征在于，在含有DL-丝氨酸的培养基，培养修饰为具有比大肠杆菌DH5α菌株高的L-丝氨酸脱氨酶活性的微生物，分解L-丝氨酸，从该培养物中提取残留的D-丝氨酸。
3.根据权利要求1或2的制造D-丝氨酸的方法，其中经过修饰的微生物是具有L-丝氨酸脱氨酶活性的微生物经过突变处理后得到的突变微生物。
4.根据权利要求1或2的制造D-丝氨酸的方法，其中经过修饰的微生物是将L-丝氨酸脱氨酶基因引入到微生物中得到的转化体。
5.根据权利要求1-4之一的制造D-丝氨酸的方法，其中经修饰的微生物的L-丝氨酸脱氨酶活性为大肠杆菌DH5α株所具有的L-丝氨酸脱氨酶活性的2倍以上。
6.根据权利要求1-4之一的制造D-丝氨酸的方法，其中经修饰的微生物的L-丝氨酸脱氨酶活性为大肠杆菌DH5α株所具有的L-丝氨酸脱氨酶活性的5倍以上。
7.根据权利要求4的制造D-丝氨酸的方法，其中L-丝氨酸脱氨酶基因是来源于大肠杆菌的sdaA基因和sdaB基因。
8.根据权利要求1-7之一的制造D-丝氨酸的方法，其中经修饰的微生物都是大肠杆菌属微生物。
9.根据权利要求1-8之一的制造D-丝氨酸的方法，其中经过修饰的微生物选自大肠杆菌DH5α/pHIB、大肠杆菌NM522/pHIA1、大肠杆菌MM294/pHIA1、大肠杆菌MM294/pHIA2、大肠杆菌MM294/pHIB以及大肠杆菌ME5386/pHIA2的微生物。
10.根据权利要求1-9之一的制造D-丝氨酸的方法，其中修饰的微生物是D-丝氨酸脱氨酶活性低或者没有这种酶活性的微生物。
11.属于大肠杆菌属，并修饰为具有比大肠杆菌DH5α菌株的L-丝氨酸脱氨酶活性高的L-丝氨酸脱氨酶活性的微生物。
12.根据权利要求11的微生物，选自大肠杆菌DH5α/pHIB、大肠杆菌NM522/pHIA1、大肠杆菌MM294/pHIA1、大肠杆菌MM294/pHIA2、大肠杆菌MM294/pHIB以及大肠杆菌ME5386/pHIA2。
全文摘要
本发明关于D－丝氨酸的制造方法以及与该制造方法有关的微生物，其特征在于，在含有DL－丝氨酸的介质中，使已修饰为具有比大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α菌株所具有的L－丝氨酸脱氨酶活性高的L－丝氨酸脱氨酶活性的微生物细胞、该细胞的培养物或它们的加工产物和DL－丝氨酸接触，分解L－丝氨酸，从该介质中提取残存的D－丝氨酸。D－丝氨酸是一种有用的化合物，可作为D－环丝氨酸等药物的合成中间体。
文档编号C12N1/20GK1531599SQ0182162
公开日2004年9月22日 申请日期2001年10月29日 优先权日2000年11月1日
发明者池田创, 米谷良之, 桥本信一, 一, 之 申请人:协和发酵工业株式会社