生产奥利万星前体a82846b的方法及培养基的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于生产奥利万星前体A82846B的方法及培养基。
【背景技术】
[0002]A82846B是一种天然的糖肽，是从诺卡氏土分离的东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)的培养基中分离的发酵产物,该糖肽的化学结构除多含一个4-表-万古胺(4-ep1-Vancosamine)外与万古霉素相似,分子式是C73H88NltlO26Cl2,其抗菌活性比万古霉素大4?8倍，其阻断细胞壁合成的作用机理与其他糖肽如万古霉素和Teicoplanin 相同。
[0003]奥利万星(oritavancin)是以A82846B为前体的半合成糖肽类抗生素。奥利万星是最初由美国礼来公司研发，后转让给美国Targanta Therapeutics生物制药公司，对革兰阳性菌有广谱抗菌效果(包括耐万古霉素细菌)，用于治疗皮肤感染、肺炎球菌感染和全身感染的适应征，目前均处于III期临床研究阶段。同时，奥利万星是第一个进入大规模临床试验的二代半合成糖肽类抗生素，作用机制与万古霉素、达巴万星和替考拉宁相似，但是，因其生物活性更强，半衰期更长，从而具有诱人的开发前景。随着耐药菌的不断出现，具有良好抗MRSA (耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)和VRE (耐万古霉素肠球菌)作用的抗生素的开发速度却十分的缓慢。因此，奥利万星的出现给临床治疗耐药菌带来了新的希望和突破，而其前体A82846B的微生物发酵工艺也倍受业内人士的瞩目。目前，A82846B主要由美国Targanta Therapeutics生物制药公司通过发酵进行生产,其报道的发酵培养基中的组分和含量为:10.0g/L的葡萄糖、20.0g/L的土豆糊精、10.0g/L的胰蛋白胨、2.0g/L的CaCO3和20.0g/L的糖蜜，发酵培养的温度为30°C，发酵培养的时间为260h，但是，上述发酵培养基进行发酵后菌体活力较差，发酵单位较低。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的培养基用于生产奥利万星前体A82846B的发酵单位低以及菌体活力差的缺陷，而提供了一种用于生产奥利万星前体A82846B的方法及其种子培养基和发酵培养基。本发明的种子培养基和发酵培养基及生产方法可以大大提闻A82846B的发酵单位，提闻生广效率，适用于奥利万星如体A82846B的大规模生产。
[0005]本发明提供了一种用于生产奥利万星前体A82846B的种子培养基，所述的种子培养基包含酵母粉、聚合蛋白胨、麦芽浸粉和葡萄糖；所述的种子培养基的pH值为6.5?7.5。
[0006]所述的酵母粉的含量较佳地为3g/L?5g/L。所述的聚合蛋白胨的含量较佳地为10g/L?15g/L，更佳地为llg/L?13g/L。所述的麦芽浸粉的含量较佳地为3g/L?5g/L。所述的葡萄糖的含量较佳地为15g/L?20g/L，更佳地为15g/L?17g/L。以上含量是指IL发酵培养基中各组分的质量。
[0007]本发明还提供了一种用于生产奥利万星前体A82846B的发酵培养基，所述的发酵培养基包含碳源、氮源和矿物质；所述的碳源的含量为30g/L?180g/L ;所述的氮源的含量为5g/L?60g/L ;所述的矿物质的含量为2g/L?5g/L ;所述的碳源包含葡萄糖、糊精和红糖；所述的氮源包含蛋白胨和/或水解酪蛋白；所述的矿物质包含碳酸钙(CaCO3);以上含量是指IL发酵培养基中各组分的质量；所述的发酵培养基的PH值为6.5?7.5。
[0008]所述的发酵培养基中，所述的碳源的含量较佳地为50g/L?105g/L。所述的氮源的含量较佳地为5g/L?30g/L。所述的矿物质的含量较佳地为2g/L?4g/L。
[0009]所述的发酵培养基还可按照本领域常规的酸碱调节剂进行调节，使得发酵培养基的pH值在6.5?7.5之间。
[0010]所述的发酵培养基中，所述的葡萄糖的含量较佳地为10g/L?20g/L。所述的糊精的含量较佳地为10g/L?50g/L。所述的红糖的含量较佳地为10g/L?60g/L，更佳地为40g/L?60g/L。所述的蛋白胨的含量较佳地为5g/L?30g/L。所述的水解酪蛋白的含量较佳地为5g/L?10g/L。所述的碳酸钙的含量较佳地为lg/L?5g/L。
[0011]所述的糊精可为本领域常规使用的糊精，较佳地包含土豆糊精和/或麦芽糊精。其中，所述的土豆糊精的含量较佳地为O?40g/L ;所述的麦芽糊精的含量较佳地为O?50g/L，且土豆糊精和麦芽糊精的含量不同时为O。
[0012]当糊精包含土豆糊精时，所述的土豆糊精的含量较佳地为20g/L?40g/L。当糊精包含麦芽糊精时，所述的麦芽糊精的含量较佳地为10g/L?50g/L。
[0013]所述的蛋白胨可为本领域常规使用的蛋白胨，较佳地包含鱼粉蛋白胨、肉胨、大豆蛋白胨和胰蛋白胨中的一种或多种；更佳地为鱼粉蛋白胨。其中，所述的鱼粉蛋白胨的含量较佳地为O?30g/L ;所述的肉胨的含量较佳地为O?15g/L ;所述的大豆蛋白胨的含量较佳地为O?15g/L ;所述的胰蛋白胨的含量较佳地为O?30g/L，且鱼粉蛋白胨、肉胨、大豆蛋白胨和胰蛋白胨的含量不同时为O。
[0014]当蛋白胨包含鱼粉蛋白胨时，所述的鱼粉蛋白胨的含量较佳地为5g/L?30g/L，更佳地为10g/L?15g/L。当蛋白胨包含肉胨时，所述的肉胨的含量较佳地为10g/L?15g/L0当蛋白胨包含大豆蛋白胨时，所述的大豆蛋白胨的含量较佳地为5g/L?15g/L。当蛋白胨包含胰蛋白胨时，所述的胰蛋白胨的含量较佳地为10g/L?30g/L。
[0015]较佳地，所述的碳源还可进一步包含糖蜜、甘油和玉米淀粉中的一种或多种。其中，所述的糖蜜的含量较佳地为O?20g/L ;所述的甘油的含量较佳地为O?30g/L ;所述的玉米淀粉的含量较佳地为O?30g/L，且糖蜜、甘油和玉米淀粉的含量不同时为O。
[0016]当碳源包含糖蜜时，所述的糖蜜的含量较佳地为3g/L?20g/L。当碳源包含甘油时，所述的甘油的含量较佳地为15g/L?30g/L。当碳源包含玉米淀粉时,所述的玉米淀粉的含量较佳地为20g/L?30g/L。
[0017]较佳地，所述的氮源还可进一步包含麸质粉、豆柏、烤黄豆粉和酵母粉中的一种或多种，更佳地为麸质粉。其中，所述的麸质粉的含量较佳地为O?20g/L ;所述的烤黄豆粉的含量较佳地为O?15g/L ;所述的豆柏的含量较佳地为O?10g/L ;所述的酵母粉的含量较佳地为O?10g/L，且麸质粉、豆柏、烤黄豆粉和酵母粉的含量不同时为O。
[0018]当氮源包含麸质粉时，所述的麸质粉的含量较佳地为10g/L?20g/L。当氮源包含烤黄豆粉时，所述的烤黄豆粉的含量较佳地为5g/L?15g/L。当氮源包含豆柏时，所述的豆柏的含量较佳地为5g/L?10g/L。当氮源包含酵母粉时，所述的酵母粉的含量较佳地为5g/L ?10g/Lo
[0019]所述的发酵培养基中，所述的矿物质一般作为渗透压调节剂，所述的矿物质还可进一步包含KH2P04、MgS04和Mg3 (PO4) 2中的一种或多种。其中，所述的KH2PO4的含量较佳地为O?1.25g/L ;所述的MgSO4含量较佳地为O?1.0g/L ;所述的Mg3(PO4)2的含量较佳地为O?1.5g/L，且KH2P04、MgS04和Mg3 (PO4)2的含量不同时为O。
[0020]当矿物质包含KH2PO4时，所述的KH2PO4的含量较佳地为0.25g/L?1.25g/L。当矿物质包含MgSO4时，所述的MgSO4含量较佳地为0.5g/L?lg/L。当矿物质包含Mg3 (PO4) 2时，所述的Mg3(PO4)2的含量较佳地为lg/L?1.5g/L。
[0021]在本发明的一较佳实施例中，所述的碳源为葡萄糖、糊精和红糖，以及下述物质中的一种或多种:糖蜜、甘油和玉米淀粉。
[0022]在本发明的另一较佳实施例中，所述的氮源为蛋白胨和/或水解酪蛋白，以及下述物质中的一种或多种:麸质粉、豆柏、烤黄豆粉和酵母粉。
[0023]在本发明的另一较佳实施例中，所述的矿物质为碳酸钙，以及下述物质中的一种或多种:KH2P04、MgSO4 和 Mg3 (PO4) 2。
[0024]所述的发酵培养基中，较佳地还可以进一步包含氨基酸。所述的氨基酸一般作为前体物质，其含量较佳地为lg/L?5g/L。所述的氨基酸可为本领域培养基中常规使用的氨基酸，所述的氨基酸较佳地为亮氨酸。
[0025]所述的发酵培养基较佳地包含10g/L?20g/L的葡萄糖、10g/L?50g/L的麦芽糊精或土豆糊精、5g/L?40g/L的麸质粉、O?15g/L的烤黄豆粉、10g/L?20g/L的红糖、O?60g/L的糖蜜、10g/L?60g/L的蛋白胨中的一种或多种、lg/L?5g/L的CaCO3,以及0.25g/L ?1.5g/L 的 KH2PO4'MgSO4 和 Mg3 (PO4)2 中的一种或多种。
[0026]所述的发酵培养基更佳地包含10g/L?20g/L的葡萄糖、20g/L?40g/L的土豆糊精、10g/L?30g/L的麸质粉、40g/L?60g/L的红糖、5g/L?15g/L的鱼粉蛋白胨、2.0g/L ?4.0g/L 的 CaCO3 和 0.lg/L ?0.2g/L 的 Mg3 (PO4) 2。
[0027]所述的发酵培养基更佳地包含10g/L?20g/L的葡萄糖、20g/L?40g/L的土豆糊精、10g/L?30g/L的麸质粉、40g/L?60g/L的红糖、5g/L?15g/L的鱼粉蛋白胨、2.0g/L ?4.0g/L 的 CaCO3 和 0.25g/L ?1.25g/L 的 KH2PO4。
[0028]本发明还提供了一种用于生产奥利万星前体A82846B的方法，其包含下列步骤:
[0029](I)将东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)活化后接种于上述种子培养基中培养，得种子液；所述的培养的温度为20°C?40°C ;所述的培养的时间为24?48小时；
[0030](2)将所述的种子液接种于上述发酵培养基中进行发酵培养，即得含有奥利万星前体A82846B的发酵液；所述的发酵培养的温度为20°C?40°C ;所述的发酵培养的时间为5?15天。
[0031]步骤(I)中，所述的东方拟无枝酸菌可为本领域常规使用的东方拟无枝酸菌菌株，只要能产生奥利万星前体A82846B即可，较佳地为从诺卡氏土分离的东方拟无枝酸菌NRRL18099ο该菌株已在US005843437A中公开。
[0032]步骤(I)中，所述的东方拟无枝酸菌活化的方法和条件可为本领域常规的方法和条件，本发明优选将东方拟无枝酸菌划线于种子斜面培养基，在28?30°C的条件下培养5?8天，即可。其中，所述的斜面培养基可为本领域常规使用的斜面培养基。
[0033]步骤(2)中，所述的东方拟无枝酸菌的种子液的用量较佳地为5%?15%，所述的百分比是指种子液的体积与发酵培养基的体积百分比。所述的发酵培养的温度较佳地为25°〇?321:，更佳地为28°C?30°C。所述的发酵培养的时间较佳地为6?8天。所述的含有奥利万星前体A82846B的发酵液可按照本领域常规的方法将奥利万星前体A82846B分离出来，较佳地为将所述的含有奥利万星前体A82846B的发酵液进行离心处理，取上清液，即可。
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