一种烟草花药分化培养基及配制方法
【专利摘要】本发明提供了一种烟草花药分化培养基及配制方法。培养基配方由大量元素、微量元素、铁盐及络合剂、有机成分、无机添加物、植物生长调节剂、生理活性物质、碳源、凝固剂及其它添加物所组成。培养基的配制方法包括配制母液、制备生理活性物质、配制培养液、培养液加热溶解与分装、培养基高压蒸汽灭菌、培养基加入IAA等步骤。本发明所述的培养基具有对烟草花药愈伤组织分化成苗率高、培养基褐化轻的优点，可以显著提高烟草花药培养效率，大大加快烟草花培育种进程。
【专利说明】
一种烟草花药分化培养基及配制方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种烟草花药分化培养基及配制方法，具体涉及一种可以显著提高烟 草花药培养效率的烟草花药分化培养基及其配制方法，属于农业科学技术领域。
【背景技术】
[0002] 烟草(A^icoiia/ja 在植物分类学上属于双子叶植物纲、管花目、前科、烟 属，为一年年生或多年生经济作物。烟属多数是草本，少数呈灌木或乔木状，多数一年生，少 数多年生，植株在种间差异较大，但都能产生植物碱。一般把烟属分为3个亚属，即黄花烟亚 属、普通烟亚属和碧冬烟亚属，共计66个种。目前可直接利用的栽培种有普通烟草种和黄花 烟草种，其它为野生种。
[0003] 烟草起源于美洲、大洋洲及南太平洋的某些岛屿。大量考古发现证明，人类尚处于 原始社会时，美洲印第安人就开始种植烟草，16世纪中叶烟草传入中国，并在中国迅速发 展，现在我国烤烟种植面积、总产量和总销售额均居于世界首位，占据了全球1/3的卷烟市 场、全球1/3的卷烟产量和全球1/3的烟叶产量，是名副其实的烟草大国。烟草在国民经济中 具有很高的价值，在我国云南、河南、贵州等烟草大省，种烟面积为当地耕地面积的1/4,而 烟草的经济效益则为农业总收入的一半以上。烟草是我国税收贡献率最高的产业之一，在 云南等烟草大省地方财政收入的一半来自于烟草税。作为发展地方经济的主要来源，烟草 业连续20年贡献近一成国家财政，烟草业作为第一大经济产业的地位难以动摇。如今烟草 行业已发展成为一个十分庞大的产业链，涉及工、农、商、贸及与其生产配套的许多相关行 业，据中国社科院工经所的相关统计，中国烟草行业拥有千亿资产和千万从业人员。可见， 烟草业作为国民经济的一个重要产业，不仅可以推动农业发展，提高农民生活质量，增加地 方和国家财政收入，促进就业，而且烟草是一种外销产品，能给国家带来大量的外汇收入。 [0004]近年来，我国烟草育种研究者通过杂交育种与传统育相结合的方法，从国外引进 优良品种，并自己培育了红花大金元、云烟85、云烟87、中烟100、龙911等一批具有抗病性的 优质烤烟新品种，丰富了烟草种质资源。然而我国在烟草育种和生产应用中却面临着如品 种遗传基础狭窄、亲本匮乏、盲目性、重复性大等诸多严峻问题。具体体现在3个方面：1)目 前我国烟草生产以引进品种为主，品种普遍表现抗病性弱、适应能力差，影响了我国烟草产 量与品质的提高。2)部分国内选育的品种，不只特色品种少，而且烟叶香气质差、化学成分 不协调、田间产量低、缺乏低危害草品种等，造成生产表现一般、外观及内在质量工艺性状 等有所不足。3)常规育种周期长，盲目性大，不能满足烟叶生产的需要。
[0005]随着生物技术的快速发展，单倍体育种技术开始应用于烟草育种研究，目前运用 单倍体技术成功地进行了体细胞远缘杂交、细胞培养以及理化诱变和加压选择等。烟草花 药培养是单倍体技术最重要的操作手段，通过对烟草花药的离体培养诱导雄核发育、获得 单倍体或双单倍体植株从而迅速获得烟草纯合系的花培育种技术不但可以缩短烟草的育 种周期、加快烟草的育种进程，而且所获得的纯合系很有可能结合双亲的优点，获得更加优 良的新种质，因而烟草花药离体培养技术的研究具有十分重要的理论意义和实际应用价 值。
[0006] 烟草花药培养育种虽取得很大的成功，但在理论和应用上仍存在一些问题。目前 烟草花药胚状体或愈伤组织的诱导率和分化率还比较低，离实际应用要求有较大差距。因 此，加快烟草花培育种机理研究，开发出花药愈伤诱导率分化率更高的培养基配方，具有重 要的现实需求。
[0007] 多年来我们对烟草花药培养进行了大量的摸索和实践，进一步优化了基本培养 基，不断尝试加入一些提高烟草愈伤组织分化率的有机添加物并组合其种类搭配及浓度， 最终摸索出了一种可大大提高烟草花药愈伤绿苗分化率的烟草花培分化培养基。我们的研 究对烟草花培育种产业化具有重要的价值。
【发明内容】
[0008] 本发明是针对目前烟草花药培养中愈伤组织绿苗分化率低的现状，提供了一种烟 草花药分化培养基及其配制方法。
[0009] 本发明的目的是通过以下方式实现的： 一种烟草花药分化培养基及配制方法，其特征在于:所述培养基的组成为： 大量元素：KNO3 900~1000mg/L，NH4N03 800~850mg/L，KH2P〇4 650~700mg/L，MgS〇4· 7出0 1400~160011^/1，谷氨酰胺 360~42011^/1，〇&(：12.2!120 200~24011^/1; 微量元素：MnS〇4.4H20 17~19mg/L，ZnS〇4.7H20 25~30mg/L，H3B03 5.5~7.0mg/L，KI 0·75~0·85mg/L; 铁盐及络合剂小65〇4.7!12〇80~9〇11^/1，恥240了厶.2!12〇105~12〇11^/1; 有机成分：肌醇45~55mg/L，维生素 Bl 0.35~0.45mg/L，维生素 B6 0.45~0.55mg/L， 烟酸4.5~5.5mg/L，腺嘌呤22~28mg/L，甘氨酸1.8~2.2mg/L，叶酸0.35~0.45mg/L，生物 素 0.09~0.11mg/L; 无机添加物:活性炭12~14g/L，甲基磺酸乙酯28~32mg/L; 植物生长调节剂：2,4-D 0.55~0.65mg/L，IAA 0.16~0.2mg/L; 生理活性物质：马铃薯提取液25~30g/L，椰乳18~22g/L; 碳源:葡萄糖23~27g/L，麦芽糖9~llg/L; 凝固剂及其它添加物:植物凝胶6.5~7. Og/L，山梨醇23~27g/L，水解蛋白0.9~ 1·lg/L〇
[0010] 所述的培养基的组分的最佳含量为： 大量元素：KNO3 950mg/L，NH4N〇3 825mg/L，KH2PO4 675mg/L，MgS〇4.7H2〇 1500mg/L，谷 氨酰胺 390mg/L，CaCl2 ·2Η20 220mg/L; 微量元素:MnS〇4.4H20 18mg/L，ZnS〇4.7H20 27.5mg/L，H3B03 6.25mg/L，KI 0.8mg/L; 铁盐及络合剂:FeS〇4.7H20 85mg/L,Na2-EDTA·2Η20 112.5mg/L; 有机成分:肌醇50mg/L，维生素 BI 0.4mg/L，维生素 B6 0.5mg/L，烟酸5. Omg/L，腺嘌呤 25mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，叶酸0.4mg/L，生物素 O.lmg/L; 无机添加物:活性炭13g/L，甲基磺酸乙酯30mg/L; 植物生长调节剂:2,4-D 0.6mg/L，IAA 0.18mg/L; 生理活性物质：马铃薯提取液27.5g/L，椰乳20g/L; 碳源:葡萄糖25g/L，麦芽糖lOg/L; 凝固剂及其它添加物:植物凝胶6.75g/L，山梨醇25g/L，水解蛋白1.0g/L。
[0011] 所述的培养基配方的配制pH值为:5.6~6.0，最佳配制pH值为5.8。
[0012] 所述的培养基的配制方法包括如下步骤： (1) 配制母液 大量元素、微量元素、铁盐及络合剂母液分别配制成1〇、1〇〇、1〇倍的母液;肌醇单独配 制成100倍母液，其它有机成分配制成500倍母液；IAA称量好后用少量无水酒精溶解，然后 用热的蒸馏水定容，2，4-D称量好后加入lmol/L的NaOH，磁力搅拌器搅拌IOh即溶解，2，4-D 和IAA母液均配制成0.5g/L; 所有母液预先配制，4 °C冷藏保存备用，IAA需用棕色容量瓶装，避光保存； (2) 制备生理活性物质 马铃薯提取液的制备：将马铃薯块茎洗净后称取50g，带皮切成碎片，加入100mL蒸馏 水，煮沸20min，用4~6层纱布过滤静置，待沉淀后将取上清液； 椰乳的提取:将新鲜椰汁从椰壳中取出放入容器中，加热至80°C左右，稍静置后过滤至 密封塑料瓶中，-20 °C冷藏保存备用； (3) 配制培养液 先在烧杯中加入一些蒸馏水，分别量取所需量的大量元素、微量元素、铁盐及络合剂、 有机成分母液加入烧杯中，将称量好的无机添加物、山梨醇、水解蛋白、2，4-D，马铃薯提取 液和椰乳加入烧杯中，搅拌溶解定容至IL后用pH计调节pH值； (4) 培养液加热溶解与分装 将称量好的植物凝胶加入配好的培养液中，用电炉加热至沸腾，边加热边用玻璃棒搅 拌，直到液体呈透明状后停止加热，稍微冷却后，按照50ml培养基/瓶分装入200ml三角瓶 中，封口膜密封，扎紧； (5) 培养基高压蒸汽灭菌 将三角瓶置于温度为121°C、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，而后降温至55°C 左右取出，置于超净工作台中； (6) 培养基内添加 IAA 按照50ml培养基/瓶的用量计算需加入的IAA母液用量，无菌操作下加入已灭菌的IAA 母液，趁热摇匀，密封后自然冷却。
[0013] 所述步骤6中的IAA母液的灭菌方法为：用灭菌的0.22μπι的微孔滤膜无菌操作，过 滤灭菌。
[0014] 本发明所述的培养基具有对烟草花药愈伤组织分化成苗率高、培养基褐化轻的优 点，可以显著提高烟草花药培养效率，大大加快烟草花培育种进程。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施案例对本发明作进一步说明，而非限制本发明。
[0016] 实施例1 (1)配制母液 大量元素母液:按照培养基中大量元素的配方:KNO3 950mg/L，NH4N03 825mg/L，KH2P〇4 675mg/L，MgS〇4.7H20 1500mg/L，谷氨酰胺 390mg/L，CaCl2.2H20 220mg/L配制大量元素母 液，各成分溶解在一起，配制为10倍的母液； 微量元素母液：按照培养基中微量元素的配方：MnSO4 · 4H20 18mg/L，ZnS〇4 · 7H20 27 · 5mg/L，H3B〇3 6 · 25mg/L，KI 0 · 8mg/L配制微量元素母液，各成分溶解在一起，配制为100 倍的母液； 铁盐及络合剂母液:按照培养基中铁盐及络合剂的配方:FeSO4· 7H20 85mg/L，Na2-EDTA ? 2H20 112.5mg/L配制铁盐及络合剂母液，二者溶解在一起，配制为10倍的母液； 肌醇母液:按照培养基中肌醇的配方:肌醇50mg/L单独配制肌醇母液，配制成100倍母 液； 有机成分母液：按照培养基中其它有机成分的配方：维生素 BI 0.4mg/L，维生素 B6 0 · 5mg/L，烟酸5 · Omg/L，腺噪呤25mg/L，甘氨酸 2 · Omg/L，叶酸0 · 4mg/L，生物素 0 · lmg/L配 制有机成分母液，各成分溶解在一起，配制为500倍的母液； 植物生长调节剂母液:IAA称量好后用少量无水酒精溶解，然后用热的蒸馏水定容，2， 4-D称量好后加入lmol/L的NaOH，磁力搅拌器搅拌IOh即溶解，2,4-D和IAA母液均配制成 〇.5g/L； 所有母液预先配制，4 °C冷藏保存备用，IAA需用棕色容量瓶装，避光保存； (2) 制备生理活性物质 马铃薯提取液的制备：将马铃薯块茎洗净后称取50g，带皮切成碎片，加入100mL蒸馏 水，煮沸20min，用4~6层纱布过滤静置，待沉淀后将取上清液； 椰乳的提取:将新鲜椰汁从椰壳中取出放入容器中，加热至80°C左右，稍静置后过滤至 密封塑料瓶中，-20 °C冷藏保存备用； (3) 配制培养液 先在烧杯中加入一些蒸馏水，分别量取所需量的大量元素、微量元素、铁盐及络合剂、 有机成分母液加入烧杯中，将称量好的无机添加物、山梨醇、水解蛋白、2，4-D，马铃薯提取 液和椰乳加入烧杯中，搅拌溶解定容至IL后用pH计调节pH值； (4) 培养液加热溶解与分装 将称量好的植物凝胶加入配好的培养液中，用电炉加热至沸腾，边加热边用玻璃棒搅 拌，直到液体呈透明状后停止加热，稍微冷却后，按照50ml培养基/瓶分装入200ml三角瓶 中，封口膜密封，扎紧； (5) 培养基高压蒸汽灭菌 将三角瓶置于温度为121°C、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，而后降温至55°C 左右取出，置于超净工作台中； (6) 培养基内添加 IAA 将IAA母液预先用灭菌的0.22μπι的微孔滤膜无菌操作，过滤灭菌，然后按照50ml培养 基/瓶的用量计算需加入的IAA母液用量，无菌操作下加入已灭菌的IAA母液，趁热摇匀，密 封后自然冷却。
[0017]选择烟草品种云烟100和龙911作为花药培养的烟草花药供体，2015年取大田生长 的该两个烟草品种单核晚期的花药进行诱导培养，花药愈伤组织产生后，挑选直径为6~8 毫米大小的愈伤组织接种于该分化培养基上诱导绿苗，培养条件控制为:温度27°C、湿度 75%、光照2500111处/暗1011，待绿苗分化生长到苗高1.5〇11以上时，计算愈伤组织绿苗分化 率和白化苗率。绿苗分化率(％)=分化绿苗数/转移的愈伤块数X 100%;白化苗率(％)=白化苗 数/转移的愈伤块数X 1 〇〇%，结果如下表。 穩嚇纖草灘f欄議觀麵麵露
[0018] 由上表可以发现，本发明提供的烟草花药分化培养基对烟草品种云烟100和龙911 的花药愈伤平均绿苗分化率高达55.1%，而白化苗率仅23.2%，可以发现本发明的烟草花药 分化培养基是一种高效的烟草花药分化培养基。我们的研究结果对于进一步推广和应用烟 草单倍体育种具有极大的价值。
[0019] 本领域技术人员可以根据本发明公开的内容和所掌握的本领域技术对本发明内 容作出替换或变型，但是这些替换或变型都不应视为脱离本发明构思的，这些替换或变型 均在本发明要求保护的权利范围内。
【主权项】
1. 一种烟草花药分化培养基及配制方法，其特征在于:所述培养基的组成为： 大量元素：KN〇3 900~1000mg/L，NH4N03 800~850mg/L，KH2P〇4 650~700mg/L，MgS〇4· 7出0 1400~160011^/1，谷氨酰胺 360~42011^/1，〇&(：12.2!120 200~24011^/1; 微量元素：]?115〇4.4!12〇17~1911^/1，2115〇4.7!12〇25~3〇11^/1，!138〇3 5.5~7.〇11^/1，1(1 0·75~0·85mg/L; 铁盐及络合剂:FeS〇4.7H20 80~90mg/L，Na2-EDTA.2H20 105~120mg/L; 有机成分：肌醇45~55mg/L，维生素 B1 0.35~0.45mg/L，维生素 B6 0.45~0.55mg/L， 烟酸4.5~5.5mg/L，腺嘌呤22~28mg/L，甘氨酸1.8~2.2mg/L，叶酸0.35~0.45mg/L，生物 素 0.09~0.11mg/L; 无机添加物:活性炭12~14g/L，甲基磺酸乙酯28~32mg/L; 植物生长调节剂:2,4-D 0.55~0.65mg/L，IAA 0.16~0.2mg/L; 生理活性物质：马铃薯提取液25~30g/L，椰乳18~22g/L; 碳源:葡萄糖23~27g/L，麦芽糖9~llg/L; 凝固剂及其它添加物：植物凝胶6.5~7. Og/L，山梨醇23~27g/L，水解蛋白0.9~ 1·lg/L〇2. 根据权利要求1所述的烟草花药分化培养基及配制方法，其特征在于:所述的培养 基的组分的最佳含量为： 大量元素：KN〇3 950mg/L，NH4N〇3 825mg/L，KH2P〇4 675mg/L，MgS〇4.7H2〇 1500mg/L，谷氨 酰胺 390mg/L，CaCl2.2H20 220mg/L; 微量元素:MnS〇4.4H20 18mg/L，ZnS〇4.7H20 27.5mg/L，H3B03 6.25mg/L，KI 0.8mg/L; 铁盐及络合剂:FeS〇4.7H20 85mg/L，Na2-EDTA.2H2〇 112.5mg/L; 有机成分:肌醇50mg/L，维生素 B1 0 · 4mg/L，维生素 B6 0 · 5mg/L，烟酸5 · Omg/L，腺嘌呤 25mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，叶酸0.4mg/L，生物素 O.lmg/L; 无机添加物:活性炭13g/L，甲基磺酸乙酯30mg/L; 植物生长调节剂:2,4-D 0.6mg/L，IAA 0.18mg/L; 生理活性物质：马铃薯提取液27.5g/L，椰乳20g/L; 碳源:葡萄糖25g/L，麦芽糖10g/L; 凝固剂及其它添加物:植物凝胶6.75g/L，山梨醇25g/L，水解蛋白1.0g/L。3. 根据权利要求1和2所述的烟草花药分化培养基及配制方法，其特征在于:所述的 培养基配方的配制pH值为:5.6~6.0，最佳配制pH值为5.8。4. 根据权利要求1、2和3所述的烟草花药分化培养基及配制方法，其特征在于:所述的 培养基的配制方法包括如下步骤： (1) 配制母液 大量元素、微量元素、铁盐及络合剂母液分别配制成1〇、1〇〇、1〇倍的母液;肌醇单独配 制成100倍母液，其它有机成分配制成500倍母液；IAA称量好后用少量无水酒精溶解，然后 用热的蒸馏水定容，2，4-D称量好后加入lmol/L的NaOH，磁力搅拌器搅拌10h即溶解，2，4-D 和IAA母液均配制成0.5g/L; 所有母液预先配制，4°C冷藏保存备用，IAA需用棕色容量瓶装，避光保存； (2) 制备生理活性物质 马铃薯提取液的制备：将马铃薯块茎洗净后称取50g，带皮切成碎片，加入100ml蒸馏 水，煮沸20min，用4~6层纱布过滤静置，待沉淀后将取上清液； 椰乳的提取:将新鲜椰汁从椰壳中取出放入容器中，加热至80°C左右，稍静置后过滤至 密封塑料瓶中，-20 °C冷藏保存备用； (3) 配制培养液 先在烧杯中加入一些蒸馏水，分别量取所需量的大量元素、微量元素、铁盐及络合剂、 有机成分母液加入烧杯中，将称量好的无机添加物、山梨醇、水解蛋白、2，4-D，马铃薯提取 液和椰乳加入烧杯中，搅拌溶解定容至1L后用pH计调节pH值； (4) 培养液加热溶解与分装 将称量好的植物凝胶加入配好的培养液中，用电炉加热至沸腾，边加热边用玻璃棒搅 拌，直到液体呈透明状后停止加热，稍微冷却后，按照50ml培养基/瓶分装入200ml三角瓶 中，封口膜密封，扎紧； (5) 培养基高压蒸汽灭菌 将三角瓶置于温度为121°C、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，而后降温至55°C 左右取出，置于超净工作台中； (6) 培养基内添加 IAA 按照50ml培养基/瓶的用量计算需加入的IAA母液用量，无菌操作下加入已灭菌的IAA 母液，趁热摇匀，密封后自然冷却。5.根据权利要求4所述的烟草花药分化培养基及配制方法，其特征在于:所述步骤6中 的IAA母液的灭菌方法为:用灭菌的0.22μπι的微孔滤膜无菌操作，过滤灭菌。
【文档编号】A01H4/00GK105961200SQ201610315030
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】宋晓燕, 潭江, 张瑞明
【申请人】连云港秀景园林绿化工程有限公司