含有将多能干细胞诱导至损伤部位的迁移因子的药物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及含有将多能干细胞诱导至损伤部位的迁移因子的药物组合物。
【背景技术】
[0002] 近年来，能对组织再生做出贡献的生物体来源的细胞正受到关注。作为从成体得 到的具有分化能力的细胞，例如已知的具有向骨、软骨、脂肪细胞、神经细胞、骨骼肌等分化 的能力的骨髓间充质细胞部分（MSC)(非专利文献1和2)，但它是包括各种细胞的细胞群， 承担其分化能力的细胞实体未知，治疗效果的偏差较大。另外，公布了iPS细胞（专利文献 1)作为成体来源的多能干细胞，但是iPS细胞的建立需要在作为间充质细胞部分的皮肤纤 维芽细胞等中将特定的基因、特定的化合物导入体细胞运样极其复杂的操作，而且iPS细 胞还具有高的肿瘤形成能力，因此在临床应用中存在极高的障碍。
[0003] 根据本发明的发明人之一的出泽氏的研究，发现了在间充质细胞部分中存在、不 进行诱导操作能够获得的、WSSEA-3(Stage-SpecificEmkryonicAntigen-3 :阶段特异 性胚胎抗原-3)作为表面抗原的多能干细胞（Multilineage-differentiatingStress 化化ringcells;Muse细胞）承担了间充质细胞部分所具有的多能性，了解到具有能应用 于W组织再生为目标的疾病治疗的可能性（专利文献2 ;非专利文献3 ;非专利文献4)。另 夕F，了解到多能干细胞（Muse细胞）存在于生物体内的间充质组织中，当生物体组织发生损 伤时，聚集于该部位，担负组织再生（专利文献2 ;非专利文献3)。然而，不仅Muse细胞被诱 导到损伤的组织的机理尚未阐明，将Muse细胞诱导至损伤部位的迁移因子也未鉴定出来。
[0004] 现有技术文献 阳00引专利文献
[0006] 专利文献1 :日本专利第4183742号公报
[0007] 专利文献2 :国际公开第W02011/007900号
[0008] 非专利文献
[0009] 非专利文献 1 :Dezawa，M.，etal.，J.Clin.Invest.，Vol. 113，p. 1701-1710(2004)
[0010] 非专利文献 2 :Dezawa，M.，etal.，Science,Vol. 309,p. 314-317 (200f5)
[0011] 非专利文献 3 :Kuroda，Y.，etal.，Proc.化tl.Acad.Sci.USA，Vol. 107， p.8639-8643(2010)
[0012] 非专利文献 4 :Wakao,S，etal.，Proc.化tl.Acad.Sci.USA，Vol. 108， p. 9875-9880(2011)
【发明内容】
柳1引 发巧要解决的间颗
[0014] 本发明的目的是提供在再生医疗中，使用多能干细胞（Muse细胞）的医疗用途，和 鉴定增强Muse细胞的迁移活性，使Muse细胞高效地聚集于损伤部位的迁移因子，并且提供 含有迁移因子的药物组合物。 引解决间颗的丰段
[0016] 本发明的发明人通过运用蛋白质组学分析，成功地鉴定了将Muse细胞诱导至损 伤部位的迁移因子，发现作为迁移因子之一的1-憐酸-銷氨醇（S1巧与Muse细胞的迁移 活性的增加，向损伤部位的聚集有关，完成了本发明。所谓迁移活性增加包括使存在于间充 质组织内的Muse细胞开始向损伤部位迁移。
[0017] 旨P，本发明如下所述。
[0018] [1] 一种活化多能干细胞迁移的药物组合物，含有活化1-憐酸-銷氨醇受体2的 化合物作为有效成分。
[0019] [2]根据上述[1]所述的药物组合物，活化1-憐酸-銷氨醇受体2的化合物为 1-憐酸-銷氨醇受体2的促效剂。
[0020] [3]根据上述[2]所述的药物组合物，1-憐酸-銷氨醇受体2的促效剂是1-憐 酸-銷氨醇或者其衍生物。
[0021] [4]根据上述[2]所述的药物组合物，1-憐酸-銷氨醇受体2的促效剂是从包括W 下物质的组中选出的：1- (2- (1-苯甲基-2, 5-二甲基-IH-祇咯-3-基）-2-氧乙基）-5-(二 氣甲基）化晚-2 (IH)-酬、1-(2-(1-苯甲基-2,5-二甲基-IH-祇咯-3-基）-2-氧乙基） 化咯烧-2, 5-二酬、1- (2- (1-苯甲基-2, 5-二甲基-IH-祇咯-3-基）-2-氧乙基）-3-甲基 咪挫嘟-2,4, 5-S酬、1-(1-苯甲基-2, 5-二甲基-IH-祇咯-3-基）-2-((1-甲基-IH-四 氮挫-5-基）硫代）乙酬W及（S)-l-(2-(l-苯甲基-2,5-二甲基-IH-祇咯-3-基）-2-氧 乙基）-2' ,3'-二氨螺[咪挫烧-4,1'-巧]-2,5-二酬。
[0022] [引根据上述[1]所述的药物组合物，活化1-憐酸-銷氨醇受体2的化合物为 1-憐酸-銷氨醇裂解酶抑制剂。
[0023] [6]根据上述[引所述的药物组合物，1-憐酸-銷氨醇裂解酶抑制剂是从包括W 下物质的组中选出的：巧)-1- (4- ((IR, 2S，3R) -1，2, 3,4-四径基下基）-IH-咪挫-2-基） 乙酬朽、（IR, 2S，3R) -1- (2-(异嗯挫-3-基）-IH-咪挫-4-基）下烧-1，2, 3,4-四醇W及 1-巧-((IR, 2S，3R) -1，2, 3,4-四径基下基）-IH-咪挫-2-基）乙酬。
[0024] [7]根据上述[1]~[6]所述的药物组合物，迁移的活化为向生物体损伤部位的诱 导。
[00巧][引根据上述[1]~[7]所述的药物组合物，所述的多能干细胞为SSEA3阳性。
[0026] [9]根据上述山~閒所述的药物组合物，所述的多能干细胞为CD105阳性。
[0027] [10]根据上述山~[9]所述的药物组合物，所述的多能干细胞为CD117阴性和 CD146阴性。
[00測[山根据上述山~[10]中任一项所述的药物组合物，所述多能干细胞为CD117 阴性、CD146阴性、NG2阴性、CD34阴性、vWF阴性W及CD271阴性。
[0029] [切根据上述山~山]所述的药物组合物，上述多能干细胞为CD34阴性、 CDl17阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、SoxlO阴性、Snail阴性、Slug阴 性、Ty巧1阴性W及化t阴性。
[0030] [切根据上述山~[切所述的药物组合物，所述的多能干细胞是具有W下全部 性质的多能干细胞：（i)端粒酶活性低或者无活性；（ii)具有分化为=种胚层中的任一胚 层的细胞的能力；（iii)不表现出肿瘤性增殖；W及（iv)具有自我更新能力。
[00川发明效果
[0032] 根据本发明，在通过Muse细胞的组织再生中，提供一种药物组合物，含有增强 Muse细胞的迁移活性，将Muse细胞诱导至损伤部位的迁移因子。
【附图说明】
[0033] 图1是表示使用实时PCR(定量的PCR)，WNHDF(正常人类皮肤纤维细胞）中的表 达量为基准，Muse细胞中的各种1-憐酸-銷氨醇受体（SlPR)的表达量的相对值的测试结 果图。
[0034] 图2是表示为了测试Muse细胞的迁移所使用的Boyden小室和迁移因子造成的细 胞迁移的模拟图。Boyden小室在其内部具有微孔径为8ym的嵌套室。在嵌套室的上部添 加含有Muse细胞或者非Muse细胞的培养液，在嵌套室的下部添加含有迁移因子的培养液， 18小时后对通过了嵌套室的细胞数进行计数。
[0035] 图3是对用Boyden小室测试的迁移细胞计数进行相对评价的图。图中，横轴表示 迁移因子的不同浓度，纵轴表示将由于迁移因子（OnM)而迁移的Muse细胞设为1的情况下 的相对值。
[0036] 图4是用于测试Muse细胞的迁移的简易细胞动态分析装置巧Z-TAXIScan)的概 念图。装置中有2个狭缝，分别添加细胞和迁移因子，用箭头表示在平板上细胞指向迁移因 子的样子。
[0037] 图5是表示用简易细胞动态分析装置测试的细胞迁移的照片。Muse细胞W通过长 度为250ym深度为8ym被称为平台的结构的方式，按照迁移因子的浓度梯度而移动。照 片左边表示添加了 2yM的1-憐酸-銷氨醇（SlP)的情况，照片右边表示未添加SlP的情 况下的细胞移动。
[00測图6表示利用简易细胞动态分析装置分析SlP造成的Muse细胞的迁移的结果。左 图表示Muse细胞向SlP直线地迁移的样子的实时测试结果。右图表示在不包含SlP的情 况下Muse细胞随机扩散的样子的实时测试结果。
[0039] 图7是说明使用了小鼠的迁移因子造成Muse细胞迁移的试验过程图。所使用的 小鼠为不排斥人源细胞的免疫缺陷的SCID小鼠（7周龄）。将浸染有SlP溶液的可降解水 凝胶移植到小鼠的后背，将GFP阳性人类Muse细胞进行尾静脉给药后，采集水凝胶移植部 位周边的组织，验证Muse细胞是否聚集在该部位。 W40] 图8是表示将浸染于水凝胶的SlP溶液的浓度设为SOOnM和1000 nM的情况下的聚 集于水凝胶中的GFP阳性人类Muse细胞的聚集图。GFP的染色采用抗GFP抗体（Alexa568)。 其结果显示了Muse细胞聚集取决于SlP溶液的浓度。
[0041] 图9为在水凝胶中，用每Imm2的细胞数评价聚集的Muse细胞。与图8的结果相 同，Muse细胞聚集取决于SlP浓度。
【具体实施方式】
[0042] 本发明设及含有将多能干细胞诱导至损伤部位的迁移因子的组合物及其应用。W 下详细说明本发明。
[0043] I.多能干细胞（Muse细胞）
[0044] 利用本发明的迁移因子诱导至损伤部位的多能干细胞，是本发明的发明人之一 的出泽在人类体内发现其存在并命名为"Muse(Multilineage-differentiatingStress 化化ring:多系分化持续应激）细胞"的细胞。Muse细胞能从骨髓液、真皮结缔组织等 的皮肤组织得到，也散布在各脏器的结缔组织中。另外，该细胞是具有多能干细胞和间充 质干细胞两者的性质的细胞，例如各自的细胞表面标记分子即"SSEA-3 (Stage-specific embiTonicantigen-3)"和"CD105"鉴定为双阳性。因此，包含Muse细胞或