与aip2结合的抗感染结合蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供设及或来源于抗自动诱导肤（AIP)2的抗体的组合物和方法。更具体 地，本发明提供结合AIP2的人抗体、运些抗体的AIP2-结合片段和衍生物，W及包含运些片 段的AIP2-结合多肤。进一步地，本发明提供编码运些抗体、抗体片段和衍生物，W及多肤 的核酸，包含运些多聚核巧酸的细胞，制备运些抗体、抗体片段和衍生物W及多肤的方法， 和使用运些抗体、抗体片段和衍生物，W及多肤的方法；使用运些抗体、抗体片段和衍生物， W及多肤的方法包括治疗或诊断患有AIP2相关细菌感染（包括通常由金黄色葡萄球菌引 起的感染，特别是由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA))的受试者。
[0002] 本发明得到美国国立卫生研究院（NIH)资助1R42AI098182的部分支持。联邦政 府对本发明具有一定的权利。
【背景技术】
[0003] 自从金黄色葡萄球菌最早于1880年由AlexanderOgston爵：t发现W来，其能够 引起多种感染，已被视为对人类健康的严重威胁。在20世纪60年代和70年代耐抗生素菌 株的兴起，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA)的兴起，引起另外的治疗挑战。目前， 在美国，MRSA菌株占引起临床疾病的所有金黄色葡萄球菌巧0%菌株。与其它国家（比如， 法国为14. 5%而荷兰为3. 1% )相比，运是高得多的比例。回顾来自西欧的31项观察性研 究，作者发现在金黄色葡萄球菌中临床分离的MRSA百分比范围在5 %至54 %之间，但其受 到在研究中使用的不同方法的限制。
[0004] 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA)是造成人类几个难治疗的感染的细菌。它也 被称为多重耐药性金黄色葡萄球菌和耐苯挫西林金黄色葡萄球菌（ORSA)。MRSA是已经发 展成对P-内酷胺抗生素，包括青霉素（比如甲氧苯青霉素、dicloxam、糞夫西林和苯挫西 林）和头抱菌素耐受的金黄色葡萄球菌的任何菌株。无法抵抗运些抗生素的菌株被归类为 甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA)。相比没有抗生素抗性的金黄色葡萄球菌菌株，运种 抗性的发展不会导致有机体在本质更致命，但抗性确实使MRSA感染更难W用标准型抗生 素治疗，因而更危险。MRSA在医院、监狱、学校、养老院中特别麻烦，具有开放性伤口的患者、 侵入性装置和虚弱的免疫系统具有比公众更大的感染风险。
[0005] MRSA菌株是普遍存在的细菌病原体，其引起保健和社区相关的感染。对常用的抗 生素增加抗性使得MRSA在世界各地严重威胁公众健康。MRSA的USA300菌株一直是造成 社区相关感染（大部分设及皮肤及软组织，但也设及更严重的侵入性症状，比如肺炎，严重 的脈毒症和屯、内膜炎）在美国流行的原因。MRSA菌株是具有包括毒素、粘附素、酶和免疫 调节剂的致病机制的特别严重和潜在的致命病原体。其中之一是潘顿一瓦伦下杀白细胞素 (PVL)一一与脈肿形成和严重的坏死性肺炎相关的毒素。
[0006] 起初，MRSA菌株折磨住院患者和患有慢性疾病的患者。二十世纪九十年代观察到 社区相关MRSA(CA-MRSA)菌株在不同的健康个体（通常是儿童）的出现主要引起皮肤及软 组织感染（SSTI)。运些菌株迅速导致CA-MRSA感染（包括具有严重后果的一些感染，例如， 具有高死亡率的社区获得性肺炎）的流行。在美国，在感染的MRSA菌株之间，CA-MRSA的 高患病率主要是由于潘顿一瓦伦下杀白细胞素（PVL)阳性USA300克隆，而在欧洲，CA-MRSA 的主要菌株是P化阳性ST80克隆。数学模型预测，由于社区储主扩大，CA-MRSA将成为在 医院占主导地位的MRSA菌株，CA-MRSA菌株比医院相关类型更适应（较高的复制能力）并 且CA-MRSA感染会越来越严重值'Agata等人，Clin.Infect.Dis. 48, 274 - 284, 2009)。
[0007] 针对MRSA菌株的致病机制的药剂相比抗生素具有若干优势。首先，将不会对其它 非病原性共生细菌施加选择压力。第二，可W避免抗生素的相关毒性（例如，过敏反应、肾 毒性和艰难梭菌感染）。第=，限制抗生素可能减少抗药性细菌的进化。抗病毒疗法与传统 抗生素的结合有可能改变对付MRSA感染的规范。因为细菌存活并不受它的致病机制的作 用的影响，使对抗致病疗法的耐受放慢发展是可能的。潜在的策略是抑制agr操纵子。体外 实验表明，自动诱导肤（Al巧的变体抑制AgrC功能。体内研究证明同时施用AIP-2与agr1 型菌株降低脈肿的形成（Wri曲t等人，Proc.化tl.Acad.Sci.USA102, 1691 - 1696, 2005)。 然而，agr抑制剂可促进生物膜的形成，运可能导致慢性金黄色葡萄球菌感染度eenken等 人，PLoSONE5, 610790, 2010)。因此，需要对运种方法进行进一步的研究。
[000引另一种用于装置的策略是利用纳米材料W防止生物膜的形成Ua^orfcWebster,Int.J.Nanomedicine6, 1463 - 1473, 2011)，纳米材料定义为至少一个 尺寸小于IOOnm的材料。在临床实践中使用Silverfage内衬导尿管和中屯、静脉导管，W降 低保健相关的感染风险（Raad等人，Antimicrob.AgentsQiemother. 56, 935 - 941, 2012)。 银粒径降低到纳米范围增大了表面积，改善了材料的抗菌活性（Taylor&Webster,Int. J.Nanomedicine6, 1463 - 1473, 2011)。葡萄金黄色素是金黄色葡萄球菌的色素，其帮助金 黄色葡萄球菌抵抗活性氧类比如由嗜中性粒细胞释放的活性氧类。葡萄金黄色素生产的早 期步骤类似于胆固醇生产的步骤。人类整締合酶抑制剂阻断葡萄金黄色素在体外的生物合 成，产生无色素的细菌，在小鼠模型中，该无色素的细菌更易被人血液杀死并由先天免疫系 统清除化iu等人，Science319, 1391 - 1394, 2008)。他汀类药物被证明通过由人和鼠嗜中 性粒细胞，巨隧细胞和单核细胞产生基于抗菌DNA的胞外诱捕网增强吞隧细胞对金黄色葡 萄球菌的清除（Qiow等人，CellHostMicrobe8, 445 - 454, 2010)。
[0009] 对于CA-MRSA感染，一个具体的祀是P化毒素，并且正在调查研究针对CA-MRSA的 抗体作为潜在的疫苗。然而，在针对P化阳性MRSA感染儿童的P化的抗体水平研究中，针对 P化的中和抗体不能防止原发性或复发性CA-MRSA皮肤感染版rmos等人，Clin.Infect. Dis. 51，1138 - 1146, 2010)。使用皮肤坏死症（dermonecrosis)小鼠模型的其它研究者评 估人巧a的激动剂（称为EP67)诱导宿主对CA-MRSA免疫的能力（Sheen等人，Vaccine 30, 9 - 13, 2011)。EP67通过促进细胞因子合成和中性粒细胞流入有效限制感染。可能需要 在人中进一步调查运个充满希望的发现。
[0010] 肤聚糖（PG)包含金黄色葡萄球菌大约50%的细胞壁。针对金黄色葡萄球菌的基 于PG的疫苗，A170PG，被证明在小鼠模型中预防MRSA的若干菌株，包括A174、A175、A176 和RIMD31092(Ca卵arelli等人，PLoSONE6，e28377,2011)。该防护与存活增加和定植减 少相关并持续至少40周。该研究的一注意事项是所用的小鼠菌株不能密切模仿人感染，因 为小鼠没有预先存在的金黄色葡萄球菌的抗体。2011年6月，Merck和Intercell宣布含 有金黄色葡萄球菌抗原Is地（位于细胞表面的铁调节蛋白）的亚单位疫苗V170的发展终 止于II/lII期巧tz等人，Proc.化tl.Acad.Sci.USA99, 6573 - 6578, 2002)。相比接受无 效对照剂的接受者，由于该疫苗接种者总死亡率和多机能障碍增加，引起安全问题。
【发明内容】
[0011] 本发明提供W至少10 6M的结合亲和力结合至AIP2表位的IgG类全人抗体，其重 链可变结构域序列与选自沈QIDNO.USEQIDNO. 3、SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5、SEQID NO. 6、沈QIDNO. 7、SEQIDNO. 9、沈QIDNO. 11、沈QIDNO. 13、沈QIDNO. 15 及其组合 的氨基酸序列具有至少95%-致性，并且轻链可变结构域序列与由SEQIDNO. 2、SEQID NO. 4、沈QIDNO. 6、沈QIDNO. 8、沈QIDNO. 10、沈QIDNO. 12、沈QIDNO. 14、沈QID NO. 16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95%-致性。优选地，该全人抗体具有重链和 轻链，其中该抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO. 1/SEQIDNO. 2 (在此称为 A9)、SEQIDNO. 3/SEQIDNO. 4(在此称为C7)、沈QIDNO. 5/SEQIDNO. 6(在此称为D3)、 沈QIDNO. 7/SEQIDNO. 8(在此称为E7)、沈QIDNO. 9/SEQIDNO. 10 (在此称为巧）、沈Q IDNO. 11/沈QIDNO. 12 (在此称为G3)、沈QIDNO. 13/沈QIDNO. 14 (在此称为G4)、沈Q IDNO. 15/沈QIDNO. 16 (在此称为Hl)及其组合。
[0012] 本发明提供全人抗体Fab片段，其具有来自重链的可变结构域和来自轻链的可 变结构域，其中该重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.USEQIDNO. 3、SEQIDNO. 4、 沈QIDNO. 5、沈QIDNO. 6、沈QIDNO. 7、沈QIDNO. 9、沈QIDNO. 11、沈QIDNO. 13、 SEQIDNO. 15及其组合的氨基酸序列具有至少95%-致性，并且轻链可变结构域序列与 由沈QIDNO. 2、SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 6、SEQIDNO. 8、SEQIDNO. 10、沈QIDNO. 12、 沈QIDNO. 14、沈QIDNO. 16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95%-致性。优选地， 该全人抗体Fab片段具有重链可变结构域和轻链可变结构域，其中该抗体的重链/轻链可 变结构域序列选自沈QIDNO. 1/SEQIDNO. 2、沈QIDNO. 3/SEQIDNO. 4、沈QIDNO. 5/ 沈QIDNO. 6、SEQIDNO. 7/SEQIDNO. 8、SEQIDNO. 9/SEQIDNO. 10、沈QIDNO. 11/沈Q IDNO. 12、沈QIDNO. 13/沈QIDNO. 14、沈QIDNO. 15/沈QIDNO. 16 及其组合。
[0013] 本发明提供单链人抗体，其具有来自重链的可变结构域和来自轻链的可变结构 域，W及连接该重链和轻链可变结构域的肤接头，其中该重链可变结构域序列与选自SEQ IDNO. 1、沈QIDNO. 3、沈QIDNO. 4、沈QIDNO. 5、沈QIDNO. 6、沈QIDNO. 7、沈QID NO. 9、沈QIDNO. 11、沈QIDNO. 13、沈QIDNO. 15及其组合的氨基酸序列具有至少95% 一致性，并且轻链可变结构域序列与由沈QIDNO. 2、沈QIDNO. 4、沈QIDNO. 6、沈QID NO. 8、SEQIDNO. 10、沈QIDNO. 12、沈QIDNO. 14、SEQIDNO. 16及其组合组成的氨基酸序 列具有至少95%-致性。优选地，该人全长单链抗体具有重链可变结构域和轻链可变结构 域，其中该人全长单链抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO. 1/SEQIDNO. 2、 沈QIDNO. 3/SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5/SEQIDNO. 6、SEQIDNO. 7/SEQIDNO. 8、SEQID NO. 9/SEQIDNO. 10、沈QIDNO. 11/沈QIDNO. 12、沈QIDNO. 13/沈QIDNO. 14、沈QID NO. 15/沈QIDNO. 16及其组合。
[0014] 本发明进一步提供用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法，该方法包括服用 抗AIP2多肤，其中该全人抗体的重链可变结构域序列与选自SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 3、 沈QIDNO. 4、SEQIDNO. 5、SEQIDNO. 6、SEQIDNO. 7、SEQIDNO. 9、SEQIDNO. 11、沈Q IDNO. 13、SEQIDNO. 15及其组合的氨基酸序列具有至少95%-致性，并且轻链可变结构 域序列与由沈QIDNO. 2、SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 6、SEQIDNO. 8、SEQIDNO. 10、沈QID NO. 12、沈QIDNO. 14、沈QIDNO. 16及其组合组成的氨基酸具有至少95% -致性；
[0015] 其中该全人抗体F油片段的重链可变结构域序列与选自SEQIDNO. 1、SEQID NO. 3、SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5、SEQIDNO. 6、SEQIDNO. 7、SEQIDNO. 9、SEQIDNO. 11、 沈QIDNO. 13、沈QIDNO. 15及其组合的氨基酸序列具有至少95%-致性，并且轻链可变 结构域序列与由沈QIDNO. 2、沈QIDNO. 4、沈QIDNO. 6、沈QIDNO. 8、沈QIDNO. 10、 沈QIDNO. 12、沈QIDNO. 14、沈QIDNO. 16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95% - 致性；并且
[0016] 其中该单链人抗体的重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.USEQIDNO. 3、SEQ IDNO. 4、沈QIDNO. 5、沈QIDNO. 6、沈QIDNO. 7、沈QIDNO. 9、沈QIDNO. 11、沈QID NO. 13、SEQIDNO. 15及其组合的氨基酸序列具有至少95%-致性，并且轻链可变结构域 序列与由沈QIDNO. 2、沈QIDNO. 4、沈QIDNO. 6、沈QIDNO. 8、沈QIDNO. 10、沈QID NO. 12、沈QIDNO. 14、沈QIDNO. 16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95%-致性。优 选地，该全人抗体具有重链和轻链，其中该抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQID NO. 1/SEQIDNO. 2(在此称为A9)、沈QIDNO. 3/SEQIDNO. 4(在此称为C7)、沈QIDNO. 5/ 沈QIDNO. 6 (在此称为D3)、沈QIDNO. 7/SEQIDNO. 8 (在此称为E7)、沈QIDNO. 9/SEQ IDNO. 10 (在此称为巧）、沈QIDNO. 11/沈QIDNO. 12 (在此称为G3)、沈QIDNO. 13/沈Q IDNO. 14(在此称为G4)、SEQIDNO. 15/SEQIDNO. 16(在此称为Hl)及其组合。优选地，该 全人抗体Fab片段具有重链可变结构域和轻链可变结构域，其中该抗体的重链/轻链可变 结构域序列选自沈QIDNO. 1/SEQIDNO. 2(在此称为A9)、沈QIDNO. 3/SEQIDNO. 4(在 此称为C7)、沈QIDNO. 5/SEQIDNO. 6(在此称为D3)、沈QIDNO. 7/SEQIDNO. 8(在此称 为E7)、沈QIDNO. 9/SEQIDNO. 10 (在此称为巧）、沈QIDNO. 11/沈QIDNO. 12 (在此称 为G3)、沈QIDNO. 13/沈QIDNO. 14 (在此称为G4)、沈QID