专利名称：具有修饰的FcRn结合位点的抗体融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有经修饰的Fcto结合位点的抗体融合蛋白和编码其的核酸分子。 该抗体融合蛋白包括2条多肽链，其中第一条多肽链包括与至少部分免疫球蛋白恒定区连接的生物学活性、优选治疗活性的分子。第二条多肽链包括至少部分免疫球蛋白恒定区。两条多肽链之一在恒定区中包括突变，该突变导致Fcfoi结合的减少或丧失，但不引起所述抗体融合蛋白的血清半衰期的实质性降低。在一个优选实施方案中，本发明涉及相应地构建的Fc-IFNii融合蛋白。
背景技术：
将目的蛋白质与免疫球蛋白恒定区连接的抗体融合蛋白具有所连接的蛋白质的生物学活性以及与免疫球蛋白组分的存在相关的优点。此类融合蛋白的产生可以帮助确保目的蛋白质的有效生产和分泌。此外，这些融合蛋白通常显示出具有显著治疗优点的新性质，例如增加的循环半衰期。在成年哺乳动物中，Fcfoi也称为新生儿Fc受体，通过充当结合且援救IgG同种型的抗体不受降解的保护性受体，在维持血清抗体水平中起关键作用。IgG分子被内皮细胞内吞，如果它们与Fcfoi结合，那么再循环进入循环内。相比之下，不与Fcfoi结合的IgG分子进入细胞，靶向溶酶体途径，在其中降解。His435突变成丙氨酸的变体IgGl导致Fcfoi结合的选择性丧失和显著减少的血清半衰期(Firan等人2001，International Immunology 13 993)。IgG分子的Fc部分包括2条相同的多肽链，其中每条多肽链通过其Fcfoi结合位点结合单个Fcfoi分子(Martin等人，1999, Biochemistry 38 :12639) 较早的研究指出， 每个Fc部分需要2个Fcfoi结合位点用于血清维持。与同二聚野生型Fc片段比较，包含野生型Fcfoi结合多肽链和突变型非Fcfoi结合多肽链的异二聚Fc片段具有显著减少的血清半衰期(Kim等人，1994，Scand. T. Immunol. 40 :457-465)。包含仅一个Fcfoi结合位点的此类异二聚Fc片段，比同二聚野生型Fc片段，再循环效力低，并且优先运输至溶酶体进行降解CTesar等人，2006, Traffic 7:1127)。这些观察与涉及Fcfoi结合配偶体(包括IgG抗体或其Fc部分)的治疗剂的有效应用具有直接关联性。例如，美国专利号7，348，004描述了融合蛋白，其特别需要完整的Fcfoi结合、或甚至增强的Fcfoi结合用于其改善的生物学性质，例如增加的血清半衰期和增强的生物利用度。更近期的研究已鉴定了 Fcfoi在吞噬细胞中表达，并且暗示Fcfoi在IgG介导的吞噬作用中的新作用(Vidarsson等人2006,Blood 108:3573)。IgG调理的病原体通过Fcfoi 内化到吞噬体内，从而提供了一种有效地标记病原体以便由吞噬细胞摄入和破坏的手段。 具有H435A突变的IgGl变体展示出显著减少的调理活性。发明概述本发明部分基于令人惊讶的发现在组分免疫球蛋白恒定区多肽链之一中具有能够减少或消除Fcfoi结合的突变的抗体融合蛋白展示出，与不含突变的相应融合蛋白相当的生物学性质，例如延长的循环半衰期。此外，考虑到Fcfoi在IgG介导的吞噬中的作用，可以想到，具有减少Fcfoi结合的突变的抗体融合蛋白可以具有低调理活性，导致减少的免疫原性。本发明提供用于表达在Fcfoi结合位点中具有减少Fcfoi结合的突变的可溶性、生物学活性抗体融合蛋白的方法和组合物。融合蛋白包括2条多肽链。第一条多肽链包括与至少部分免疫球蛋白恒定区连接的生物学活性分子，并且第二条多肽链包括至少部分免疫球蛋白恒定区。其中一条多肽链的该部分免疫球蛋白恒定区的氨基酸序列，因包含在Fcfoi 结合位点中的突变，而不同于另一条多肽链的该部分免疫球蛋白恒定区的氨基酸序列。该差异可以是氨基酸缺失、插入、置换或修饰。在一个实施方案中，差异是在免疫球蛋白恒定区内的特定位置，例如386、388、400、415、433、435、436和439位置，上的氨基酸置换。在一个优选实施方案中，氨基酸置换在位置H435上，优选地H435A。本发明涉及将生物学活性部分与至少部分免疫球蛋白恒定区连接的融合蛋白。生物学活性分子可以与免疫球蛋白恒定区的氨基末端连接。可替代地，生物学活性分子可以与免疫球蛋白恒定区的羧基末端连接。在一个进一步的实施方案中，融合蛋白可以包括与具有至少部分免疫球蛋白恒定区的2条多肽链连接的2个生物学活性分子。本发明涉及包括至少部分免疫球蛋白恒定区的融合蛋白。考虑该部分免疫球蛋白恒定区可以是Fc片段。在各种实施方案中，Fc片段是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的Fc片段。在另一个实施方案中，融合蛋白在至少一条多肽链中包括免疫球蛋白可变区。根据本发明优选的Fc-融合蛋白是这样的分子，其中Fc部分经由其一条或两条CH2-CH3链的C或 N末端与治疗上有效的分子融合，所述治疗上有效的分子优选蛋白质或多肽例如细胞因子、 生长因子或生长激素、其它治疗上有效的多肽、小化学分子或核酸，其中仅一条CH2-CH3链突变以消除或减少相应免疫球蛋白链和优选地整个融合蛋白的Fcfoi结合。取决于融合蛋白的性质，可能更有利的是突变与生物学活性分子融合的免疫球蛋白链，或可能有利的是突变裸免疫球蛋白链。本发明的这些Fc融合蛋白可以是同二聚体(在2个生物学活性分子与抗体Fc部分融合的情况下，抗体部分的每条重链各与一个分子融合)，或当仅一个生物学活性分子与抗体或Fc部分的2条重链之一融合时，它们可以是异二聚体。本发明考虑，任何生物学活性分子作为本发明的治疗分子的应用。例如，生物学活性分子可以是人干扰素，例如干扰素-β (IFNi3)。为了改善折叠和减少聚集，干扰素-β序列可以相应于天然、成熟干扰素-β包括在位置17、50、57、130、131、136和140中的至少一个上的氨基酸改变。该改变可以是氨基酸置换。在一个实施方案中，氨基酸置换选自C17S、 C17A、C17V、C17M、F50H、L57A、L130A、H131A、K136A、H140A 和 H140T。在另一个实施方案中， 生物学活性分子是其它细胞因子或生长因子，例如人促红细胞生成素。在一个优选实施方案中，IFNii分子与Fcfoi突变的免疫球蛋白的Fc部分的N或C末端融合。一个特别优选的实施方案是(二聚)Fc-IFNβ融合蛋白，其中一个任选修饰的IFNi3分子与第一条免疫球蛋白CH2-CH3链恒定区的C末端或任选地N末端，优选地C末端融合，而第二条CH2-CH3 免疫球蛋白链缺乏IFNii，并且阻止或减少Fcfoi结合的突变位于第一条或第二条CH2-CH3 链，优选裸露的那条链中，并且突变发生在位置435上，且特别是H435A。此类优选的Fc融合分子是异二聚体。此外，进一步优选的Fc-IFNii融合蛋白，除这些结构特征外，还具有与 IgG2或IgG4的CH2-CH3区偶联的IgGl铰链区。本发明还提供用于编码和表达本发明的融合蛋白的方法。例如，本发明的一个方面涉及编码多肽链的核酸，所述多肽链包括生物学活性分子和包含减少Fcfoi结合的突变的至少部分免疫球蛋白恒定区。在另一个方面，本发明涉及编码第一多肽链的第一核酸和编码第二多肽链的第二核酸的组合物，其中第一多肽链包括生物学活性分子和至少部分免疫球蛋白恒定区，并且所述第二多肽链包括至少部分免疫球蛋白恒定区。这些核酸序列之一包含在Fcfoi结合位点中的突变。在一个实施方案中，突变是在恒定区中的一个或多个位置(例如位置386、388、400、415、433、435、436和439)上的氨基酸置换，其中残基的编号为根据Kabat的EU hdex的编号。在一个进一步优选的实施方案中，氨基酸置换在位置435 上，且特别是H435A。在另一个方面，本发明的核酸分子或核酸组合物可以掺入可复制的表达载体内，随后可以引入宿主细胞内，并且可以与宿主细胞基因组重组且整合到其内。可复制的表达载体可以包括上述核酸或核酸组合物。在另一个实施方案中，本发明涵盖包含上述核酸或核酸组合物的宿主细胞。本发明在本文中提供包括上述融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。取决于预期用途或施用方式，可以在药物组合物中采用固体或液体药学上可接受的载体。本发明的再一方面涉及通过施用任何上述融合蛋白减轻疾病或病症而治疗哺乳动物的方法。在一个实施方案中，疾病或病症是病毒感染。在另一个实施方案中，疾病或病症是贫血，而在另外一个实施方案中，疾病或病症是多发性硬化。总之，本发明涉及下述主题·包括2条多肽链的蛋白质，其中第一条多肽链包括生物学活性分子和至少部分免疫球蛋白恒定区，第二条多肽链包括至少部分免疫球蛋白恒定区，并且多肽链之一包括在Fcfoi结合位点中的突变。·包括第一和第二重链结构域的抗体融合蛋白，其中每个结构域各包括至少部分免疫球蛋白恒定区，其中所述第一或第二重链结构域中的至少一个与生物学活性分子融合，并且所述第一或第二重链结构域中的仅一个包括在恒定区内的氨基酸序列突变，其中所述突变导致Fcfoi结合的部分或完全丧失，并且不引起融合蛋白的血清半衰期的减少或实质性减少。抗体融合蛋白的血清半衰期的实质性减少根据本发明是指，该减少达到在一个或多个位置上，优选在位置386、388、400、415、433、435、436、439和447上，且最优选在位置435上不含Fcfoi结合位点突变的融合蛋白的血清半衰期的10%以上，优选5%以上，且最优选3%以上。·相应的蛋白质或抗体融合蛋白，其中生物学活性分子与免疫球蛋白恒定区的氨基末端或与免疫球蛋白恒定区的羧基末端连接。·相应的蛋白质或抗体融合蛋白，其中第一和第二重链结构域包括生物学活性分子。·相应的蛋白质或抗体融合蛋白，其为抗体Fc片段，其中第一和第二重链结构域是包括铰链区的CH2和CH3结构域，且因此构成所述Fc片段。·可替代地，抗体融合蛋白，其中第一和/或第二重链结构域包括抗体可变结构域，从而形成允许结合抗原靶的完整全抗体。 相应的蛋白质或抗体融合蛋白，其中免疫球蛋白是IgG，优选IgGl、IgG2或IgG4。·优选的抗体融合蛋白，其为抗体Fc片段或部分，其中(i)第一和第二重链结构域是包括铰链区的IgG的CH2和CH3结构域，构成Fc片段；(ii)第一重链结构域经由其C末端与生物学活性分子融合；和(iii)第二重链结构域不与生物学活性分子融合，从而形成！^异源二聚体融合蛋白。在这个实施方案中，导致Fcfoi结合的丧失或减少的突变可以位于未与生物学活性分子融合的重链结构域中，或它可以位于与生物学活性分子融合的重链结构域中。·相应的蛋白质或抗体融合蛋白，其中生物学活性和治疗上有效的分子是人干扰素，或细胞因子，例如干扰素或白细胞介素，生长因子例如促红细胞生成素或生长激素例如人生长激素。根据本发明最优选的是相应的Fc融合蛋白，其包含仅与Fc分子的一条重链融合的，优选与Fc分子的C末端融合的干扰素-β (IFNi3)分子。·相应的抗体融合蛋白，优选Fc融合蛋白，其中人IFNii的氨基酸序列相应于天然成熟人IFN β在一个或多个位置上，优选在位置17、50、57、130、131、136和140上是改变的，优选是置换的。优选地，该Fc-IFNii在IFNii序列内的如下一个或多个位置上是置换的C17S、C17A、C17V、C17M、F50H、L57A、L130A、H131A、K136A、H140A 和 H140T。·相应的Fc片段，其在未与天然或修饰的IFNii融合的重链中包括Fcfoi突变，或反之亦然，i^cfoi突变发生在与天然或修饰的IFNii融合的重链中，其中在此2种可选方案中，Fc融合蛋白的铰链区源自与该IgG重链不同的IgG，例如相应的Fc融合分子，其中铰链区源自IgGl，并且CH2-CH3重链源自IgG2或IgG4。·适于制备如上文和下文所述的抗体融合蛋白的核酸组合物，其包括(i)编码第一重链结构域的核酸，所述第一重链结构域包括与至少部分IgG恒定区融合的生物学活性分子，和(ii)编码第二重链结构域的核酸，所述第二重链结构域包括不与生物学活性分子融合的至少部分IgG恒定区，其中所述IgG恒定区或其部分中仅一个包括导致Fcfoi结合的部分或完全丧失的突变。·包括相应的蛋白质或抗体融合蛋白，优选地相应的Fc融合蛋白，最优选地如所述的Fc-IFNii融合蛋白，和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。·相应的蛋白质或抗体融合蛋白，优选地相应的Fc融合蛋白，最优选地如所述的 Fc-IFN^融合蛋白或所述的药物组合物，用于在疾病例如病毒感染、贫血、癌症或多发性硬化治疗中的用途。附图简述
图1A-1D示意性举例说明一个生物学活性分子(圆圈)可以与抗体的Fc亚基如何连接，此处抗体的Fc亚基显示为铰链(小矩形)、CH2结构域和CH3结构域(大矩形)。 Fc亚基之一包括Fcfoi结合位点中的突变(菱形)。生物学活性分子可以与Fc亚基的N末端(图IA和1B)或C末端(图IC和1D)连接。图2A-2F举例说明2个生物学活性分子可以与抗体的Fc亚基连接的一些方式。Fc 亚基之一包括在Fcfoi结合位点中的突变。2个生物学活性分子可以是相同或不同的(黑色或白色圆圈)。图3A-3H显示一个生物学活性分子可以与包括重链的恒定区(矩形)和可变区 (有点的矩形)的抗体如何连接。抗体融合蛋白可以包括单个可变区(图3A-3D)，或抗体融合蛋白可以包括2个可变区(图3E-3H)。重链之一包括在Fcfoi结合位点中的突变。图4A-4F显示2个生物学活性分子可以与包括重链的恒定区(矩形)和可变区 (有点的矩形)的抗体如何连接。2个生物学活性分子可以是相同或不同的(黑色或白色圆圈)。重链之一包括Fcfoi结合位点中的突变。图5A-5D显示一个生物学活性分子可以与完整免疫球蛋白例如IgG连接的一些方式。重和轻链的恒定区显示为矩形，可变区显示为有点的矩形。重链之一包括Fcfoi结合位点中的突变。生物学活性分子可以与重链(图5A和5B)或轻链(图5C和5D)连接。图6A-6F举例说明2个生物学活性分子可以与完整免疫球蛋白例如IgG如何连接。重链之一包括Fcfoi结合位点中的突变。生物学活性分子可以与重链(图6A和6B)或轻链(图6C和6D)连接。可替代地，生物学活性分子之一可以与重链连接，而另一个生物学活性分子与轻链连接(图6E和6F)。图7A-7F举例说明2个不同的生物学活性分子可以与完整免疫球蛋白例如IgG如何连接。重链之一包括Fcfoi结合位点中的突变。图8显示在还原(左图)和非还原条件(中图)下对细胞中瞬时共表达人 Fc y 4h 链和人 Fc y 4h-接头-DI-IFN β 链而产生的 huFc y 4h-单-L-DI-IFN β 的 SDS-PAGE 分析。在左图中，泳道2显示Fcy 4h链和Fcy 4h-接头-DI-IFN β链均被表达，而泳道1是显示单独Fc y 4h表达的对照。在中图中，在非还原条件下分析人Fc y 4h链和Fc y 4h_接头-DI-IFN β链的瞬时共表达。分析了 Fc γ 4h链(标记为Ia和Ib的2个泳道)或Fc γ 4h 链和Fc y 4h-接头-DI-IFN β链的共表达(标记为加和2b的2个泳道)的一式两份样品。 右图显示，自2个稳定转染克隆(标记为3和4的2个泳道)的Fc和Fc-IL-2链共表达给出了裸Fc同源二聚体Fc/Fc-IL2异源二聚体Fc_IL2同源二聚体的正常和预期比。图9显示在非还原条件下对来自共表达Fc γ 4h链和Fc y 4h_接头-DI-IFN β链的多个稳定NSO克隆的条件培养基的SDS-PAGE分析。所有克隆都产生了 Fc y 4h同源二聚体和Fc y 4h/Fc y 4h-IFNi3异源二聚体，但几乎没有或没有Fc y 4h_IFNi3同源二聚体。图10显示在致细胞病变效应(CPE)抑制测定试验中纯化的 Fc y 4h-单-L-DI-IFN^ (方块)和包含 H435A 置换的 Fc y 4h-单-L-DI-IFN^ 变体(三角)的生物学活性。人上皮肺癌细胞系A549用作脑心肌炎病毒(EMCV)的宿主。Rebif (圆圈)用作阳性对照。图11比较静脉内施用的huFc γ 4h-单-L_DI_IFNi3 (菱形)和包含H435A置换的 huFc y 4h-单-L-DI-IFN β 变体(方块)(以 huFc y 4h (H435A) /huFc y 4h-L_DI_IFN β 异源二聚体的形式)的药代动力学曲线。小鼠(η = 3)用25yg总蛋白质/小鼠静脉内注射。 在不同时间点的注射蛋白质的血清浓度通过抗hu Fc ELISA测定。图12比较静脉内施用的huFc y 4h-单-L_DI_IFNi3 (菱形)和包含H435A置换的 huFc4h-单-L-DI-IFN β 变体(方块)(以 huFc y 4h (H435A) /huFc y 4h-L_DI_IFN β 异源二聚体的形式)的药代动力学曲线。小鼠(η = 3)用25 μ g总蛋白质/小鼠静脉内注射。在不同时间点的注射蛋白质的血清浓度通过ELISA测定，所述ELISA由抗hu(H&L)捕获和抗 hu IFN^检测组成。图13比较皮下施用的huFc y 4h-单-L-DI-IFN^ (菱形)和包含H435A置换的 huFc y 4h-单-L-DI-IFN β 变体(方块)(以 huFc y 4h (H435A) /huFc y 4h-L_DI_IFN β 异源二聚体的形式)的药代动力学曲线。小鼠(η = 3)用50 μ g总蛋白质/小鼠皮下注射。在不同时间点的注射蛋白质的血清浓度通过抗hu Fc ELISA测定。图14比较皮下施用的huFc y 4h-单-L-DI-IFN^ (菱形)和的包含H435A置换的huFc y 4h-单-L-DI-IFN β 变体(方块)(以 huFc y 4h (H435A) /huFc y 4h-L_DI_IFN β 异源二聚体的形式)的药代动力学曲线。小鼠(11 = 3)用5048总蛋白质/小鼠皮下注射。 在不同时间点的注射蛋白质的血清浓度通过由抗hu(H&L)捕获和抗hu IFN^检测组成的 ELISA测定。图15比较在加强注射后用huFc y 4h-单-L-DI-IFN β (圆圈)或包含Η435Α置换的11砂(^411-单-1^-01-0^^变体(菱形)免疫接种的小鼠的抗体滴度。小鼠抗体滴度通过ELISA测定。图16是在还原条件下对来自静脉内药代动力学研究的小鼠血清样品的蛋白质印迹分析。左上用抗hu Fc探测的huFc γ 4h-单-L-DI-IFNii ；左下用抗hu Fc 探测的包含H4!35A置换的huFc y 4h-单-L-DI-IFN β变体；右上用抗hu IFN β探测的huFc y 4h-单-L-DI-IFN^ ；右下用抗hu IFN0探测的包含H4!35A置换的 huFcγ4h-单-L-DI-IFNβ 变体。图17是在还原条件下对来自皮下药代动力学研究的小鼠血清样品的蛋白质印迹分析。左上用抗hu Fc探测的huFc γ 4h-单-L-DI-IFNii ；左下用抗hu Fc 探测的包含H4!35A置换的huFc y 4h-单-L-DI-IFN β变体；右上用抗hu IFN β探测的huFc y 4h-单-L-DI-IFN^ ；右下用抗hu IFN0探测的包含H4!35A置换的 huFcγ4h-单-L-DI-IFNβ 变体。发明详述定义本文考虑的治疗剂或组合物的“有效量”或“药学有效量”是足以产生所需效应， 例如减少疾病症状的严重性的量。药学有效量将取决于待治疗的受试者和疾病病症、受试者的重量和年龄、疾病病症的严重性、施用方式等而改变。例如，本发明的特定组合物可以以足够的量施用，以产生适用于该治疗的合理利益/风险比。如本文使用的，术语“核酸”指单链或双链形式的包含至少2个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。DNA可以为例如质粒DNA、预凝聚的 DNA(pre-condensed DNA)、PCR产物、载体(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、染色体 DNA或这些的衍生物和组合。RNA可以是mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、vRNA及其组合。核酸包括包含已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，其可以是合成、天然存在和非天然存在的，并且可以具有与参考核酸相似的结合性质。此类类似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2' -0-甲基核糖核苷酸和肽核酸 (PNAs)。“核苷酸”包含脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)、糖、含氮碱基和磷酸基团或其类似物。 核苷酸通过磷酸基团连接在一起。“碱基”包括嘌呤和嘧啶，这进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物， 这包括但不限于放置新反应基团例如但不限于胺、醇、硫醇、羧酸酯和烷基卤化物的修饰。术语“小分子”指具有小于IkDa分子量的分子。小分子可以是天然存在或合成的各种分子。生物学活性分子可以是小有机分子、小无机分子、糖分子、脂质分子等。小分子可以是药物。术语“药学上可接受的赋形剂”指在配制药物产品中使用的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如脂质或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂。每种赋形剂必须是就与主题组合物及其组分相容以及对于患者无害方面而言是“可接受的”。可以充当药学上可接受的赋形剂的一些材料实例包括(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；( 淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；C3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；⑷黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)；明胶；(7)滑石；⑶赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡； (9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10) 二醇例如丙二醇；(11)多元醇，例如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和十二烷酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水； (17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)在药学制剂中采用的其他无毒相容性物质。抗体融合蛋白将目的蛋白质与免疫球蛋白恒定区例如免疫球蛋白Fc区连接的抗体融合蛋白具有所连接的蛋白质的生物学活性以及与免疫球蛋白结构组分的存在相关的优点。与单独的生物学活性分子比较，此类融合蛋白显示出增强的稳定性和增加的生物利用度。另外，Fc片段的存在可以显著改善蛋白质的产生。据认为，其可以部分地因融合蛋白的Fc部分被设计用于融合蛋白的有效分泌以及部分地因融合蛋白可以在天然表达免疫球蛋白的宿主细胞中产生和分泌从而使得融合蛋白可以容易地从宿主细胞中分泌而发生。最后，Fc片段可以进一步用于帮助纯化融合多肽。在成年哺乳动物中，Fcfoi充当结合IgG和援救IgG不受降解的保护性受体。众多研究支持抗体的Fcfoi结合亲和力和血清半衰期之间的关系。令人惊讶的是，本发明提供了具有减少Fcfoi结合的突变的抗体融合蛋白显示出与不含该突变的相应融合蛋白相当的生物学性质，例如延长的循环半衰期。此外，考虑到Fcfoi在IgG介导的调理中的作用，考虑具有减少Fcfoi亲和力的突变的抗体融合蛋白可以展示出减少的免疫原性。因此，本发明提供包括2条多肽链的抗体融合蛋白。第一条多肽链包括与至少部分免疫球蛋白恒定区连接的生物学活性分子，并且第二条多肽链包括至少部分免疫球蛋白恒定区。多肽链之一的免疫球蛋白恒定区的部分的氨基酸序列，因为包含Fcfoi结合位点中的突变，而不同于第二条多肽链的免疫球蛋白恒定区的部分的氨基酸序列。本发明还提供用于表达在Fcfoi结合位点中具有减少Fcfoi结合的突变的可溶性、 生物学活性的抗体融合蛋白的方法和组合物。特别地，本发明提供了编码多肽链的核酸分子，所述多肽链包括生物学活性分子和包括减少Fcfoi结合的突变的至少部分免疫球蛋白恒定区。在另一个方面，本发明涉及编码第一多肽链的第一核酸和编码第二多肽链的第二核酸的组合物，所述第一多肽链包括生物学活性分子和至少部分免疫球蛋白恒定区，并且所述第二多肽链包括至少部分免疫球蛋白恒定区。核酸序列之一包含Fcfoi结合位点中的突变。本发明还提供通过给哺乳动物施用有效量的本发明抗体融合蛋白，由抗体融合蛋白的施用而减轻疾病或病症的治疗方法。抗体融合蛋白结构变体本发明公开包括2条多肽链的抗体融合蛋白。第一条多肽链包括与至少部分免疫球蛋白恒定区连接的生物学活性分子，并且第二条多肽链包括至少部分免疫球蛋白恒定区。多肽链之一包括Fcfoi结合中的突变。
图1举例说明生物学活性分子可以与抗体的免疫球蛋白恒定区例如Fc亚基连接的一些方式。生物学活性分子可以与免疫球蛋白恒定区的N末端(图IA和1B)或免疫球蛋白恒定区的C末端(图IC和1D)连接。生物学活性分子可以与具有Fcfoi结合突变的免疫球蛋白恒定区连接或与不含该突变的免疫球蛋白恒定区连接。抗体融合蛋白可以包括至少2个生物学活性分子。如图2中举例说明的，生物学活性分子可以与免疫球蛋白恒定区的N末端(图2A)或免疫球蛋白恒定区的C末端(图2B) 连接，或生物学活性分子之一可以与免疫球蛋白恒定区的N末端连接，并且第二生物学活性分子与免疫球蛋白恒定区的C末端连接(图2C)。2个生物学活性分子可以是相同或不同的。图2D-2F举例说明2个不同的生物学活性分子可以与免疫球蛋白恒定区如何连接。本发明还涉及包括2条多肽链的抗体融合蛋白，其中多肽链中的至少一条包括抗体可变结构域。图3举例说明生物学活性分子可以与包括抗体可变结构域的免疫球蛋白区域如何连接的一些方式。生物学活性分子可以与包括抗体可变结构域的多肽链之一的 N末端或C末端连接(图3A-3D)。可替代地，2条多肽链均可以包括抗体可变结构域(图 3E-3H)。图4显示2个生物学活性分子可以与包括重链的恒定区和可变区的抗体如何连接。生物学活性分子可以与免疫球蛋白区域的N末端、C末端、或N末端和C末端连接(图 4A-4C)。不同的生物学活性分子可以与免疫球蛋白区域连接(图4D-4F)。本发明的融合蛋白可以包括与完整抗体例如IgG连接的生物学活性分子。图5描述生物学活性分子可以与抗体连接的一些方式。生物学活性分子可以与免疫球蛋白重链的 N末端或C末端连接(图5A和5B)。可替代地，生物学活性分子可以与免疫球蛋白轻链的 N末端或C末端连接(图5C和5D)。图6举例说明2个生物学活性分子可以与完整抗体如何连接。生物学活性分子可以与免疫球蛋白重链的N末端或C末端连接(图6A和6B)。可替代地，生物学活性分子可以与免疫球蛋白轻链的N末端或C末端连接(图6C和6D)。生物学活性分子之一可以与免疫球蛋白重链连接，而第二个生物学活性分子可以与免疫球蛋白轻链连接(图6E和6F)。 图7显示不同的生物学活性分子可以与完整抗体如何连接(图7A-7F)。抗体融合蛋白的生物学性质如前所述，本发明的抗体融合蛋白可以表现出与不含突变的相应融合蛋白可比的生物学性质，例如延长的循环半衰期。例如，图11-15证实含H435A突变的人Fc y 4_IFNi3 在体内展示出与不含该突变的人FcY4_IFNi3相似的血清稳定性。静脉内注射到小鼠体内的含H435A突变的Fc y 4_IFNi3显示出了与不含该突变的抗体融合蛋白相似的循环半衰期 (图11和12)。相似地，皮下注射到小鼠体内的含H435A突变的FcY4-IFNi3显示出了与不含该突变的抗体融合蛋白相似的循环半衰期(图13和14)。考虑本发明的抗体融合蛋白的衍生物，其可以通过置换、添加和/或缺失/截短来改变其氨基酸序列或通过引入导致功能上等价分子的化学修饰而制备。本领域技术人员理解，任何蛋白质的序列中都有一些氨基酸可以置换成其他氨基酸而不会不利地影响蛋白质的活性。由此改变而产生的衍生物、类似物或突变体、及此衍生物的用途在本发明的范围内。FcRn结合位点突变
本发明提供了在包括Fc的一条多肽链的Fcfoi结合位点中具有突变的抗体融合蛋白。虽然包括Fc的另一条多肽链保留固有的Fcfoi结合亲和性，但突变导致抗体融合蛋白对Fcfoi受体减少的结合亲合力。减少的结合可以表征为具有低于IO6M-1的亲和常数&的低亲和力。需要时，Fcfoi结合可以通过改变结合条件而降低。结合条件，例如分子浓度、溶液的离子强度、温度、允许用于结合的时间，可以由本领域技术人员确定。与Fcfoi受体结合的IgG Fc部分的区域已基于X射线晶体学得到描述 (Burmeister等人，1994, Nature 372:379)。涉及与Fcfoi结合的IgG残基位于Fc区的 CH2-CH3结构域界面上。主要接触位点包括CH2结构域的氨基酸残基对8、250_257、272、 285、288、290、291、308-311 和 314，以及 CH3 结构域的氨基酸残基 385-387,428 和 433-436。使用这个知识，抗体融合蛋白的Fc片段可以根据公认的程序例如定点诱变进行修饰，以生成对于Fcfoi具有减少的亲和力的经修饰的抗体融合蛋白。修饰可以是置换、添加和/或缺失/截短。例如，抗体融合蛋白的免疫球蛋白恒定区可以包含在位置435 (在天然IgGlFc片段中对应于组氨酸)上的改变。氨基酸改变可以通过本领域已知的方法用丙氨酸替换组氨酸(H435A)。除在位置435上的改变外，本发明还考虑具有其他改变的残基的抗体融合蛋白。例如，抗体融合蛋白可以在位置233、234、235、236、252、253、254、255、沘8、309、386、 388、400、415、433、4；35、436、439和447中的一个或多个上改变，其中，IgG Fc区中的残基的编号是 Kabat 等人(Seq uences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版， Public Health Service,National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))中描述的 EU hdex的编号。可以减少或消除与Fcfoi的结合的修饰例子包括但不限于下述E233A、 L234A、L235A、G236A、I253A、S254A、R255A、K288A、S415A、H433A、H435A、Y436A。考虑，还可以突变上文未列出的另外氨基酸残基，以减少Fcfoi结合。此外，除丙氨酸外，其他氨基酸残基也可以置换在上述位置上的野生型氨基酸。突变可以单个引入，或可以将这些突变中的 2、3个或更多个组合一起引入。此外，抗体融合蛋白的多肽链之一可以突变以减少Fcfoi结合，或2条多肽链均可以是突变的。无论生物学活性分子如何，均可以使用本文描述的任何突变。免疫球蛋白区域本发明的抗体融合蛋白包括至少部分免疫球蛋白恒定区。完整免疫球蛋白包括共价结合的4条多肽链-2条重链和2条轻链。每条链进一步包括一个可变区和一个恒定区。 取决于免疫球蛋白同种型，重链恒定区包含3或4个恒定区结构域(例如CHl、CH2、CH3、 CH4)和铰链区。这些结构域如下顺次命名CH1-铰链-CH2-CH3(-CH4)。部分免疫球蛋白恒定区可以包括IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的部分。在一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG。在另一个实施方案中，免疫球蛋白是IgGl。在另一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG2。在另一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG3，而在另外一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG4。合适免疫球蛋白重链恒定区的选择在美国专利号5，541, 087和 5，726，044中详细讨论。自某些免疫球蛋白类别和亚类选择特定免疫球蛋白重链恒定区序列以达到特定结果，被视为在本领域技术人员的水平内。部分免疫球蛋白恒定区可以包括整个重链恒定区、或其片段或类似物。在一个实施方案中，部分免疫球蛋白恒定区是Fc片段。例如，免疫球蛋白Fc片段可以包括1)CH2结构域；2)CH3结构域；3)CH4结构域；4)CH2结构域和CH3结构域；5)CH2结构域和CH4结构域；6) CH3结构域和CH4结构域；或7)免疫球蛋白铰链区和/或CH2结构域和/或CH3结构域和/或CH4结构域的组合。在一个实施方案中，免疫球蛋白Fc区包括至少免疫球蛋白铰链区，而在另一个实施方案中，免疫球蛋白Fc区包括至少一个免疫球蛋白恒定重链区，例如CH2结构域或CH3结构域，并且取决于用于生成Fc区的免疫球蛋白类型，任选地CH4结构域。在另一个实施方案中，Fc区包括铰链区、CH2结构域和CH3结构域，且优选缺乏CHl 结构域，而在另一个实施方案中，Fc区包括铰链区和CH2结构域。在另外一个实施方案中， Fc区包括铰链区和CH3结构域。 免疫球蛋白Fc片段可以来自任何免疫球蛋白类型。例如，免疫球蛋白类型可以是 IgG(IgG Yl) (Y亚类1、2、3或4)。还可以使用其他类型的免疫球蛋白，例如IgAdga )、 IgD(IgS), IgE(Ige)和IgM(Igy)。合适免疫球蛋白重链恒定区的选择在美国专利号 5，541, 087和5，726，044中详细讨论。应当理解，本领域技术人员将了解如何从某些免疫球蛋白类型和亚类中选择特定免疫球蛋白重链恒定区以实现特定结果。考虑，可以使用于生成融合蛋白的Fc片段适应于特定应用。例如，Fc片段可以源自免疫球蛋白Yl同种型或其变体。人Yl作为Fc片段序列的使用具有几个优点。例如， 当希望使融合蛋白靶向肝脏时，可以使用衍生自免疫球蛋白Yl同种型的Fc片段。另外， 如果抗体融合蛋白待用作生物药，那么FcyI结构域可以对融合蛋白赋予效应子功能活性。该效应子功能活性包括生物学活性，例如胎盘转移和增加的血清半衰期。该免疫球蛋白 Fc片段还使得可以通过抗Fc ELISA进行检测和通过与金黄色葡萄球菌(Maphylococcus aureus)蛋白A( “蛋白A”)结合进行纯化。可替代地，抗体融合蛋白的Fc片段可以源自免疫球蛋白Y4同种型。因为免疫球蛋白Y 4同种型在介导效应子功能中是无效的，并且展示出与Fc γ受体极大减少的结合， 所以考虑当施用于哺乳动物时，具有免疫球蛋白Y 4作为Fc区的抗体融合蛋白可以显示出减少的免疫效应子功能和增强的循环半衰期。免疫球蛋白Fc片段可以组合多个免疫球蛋白类型或亚类。例如，片段可以组合 IgGl铰链区以及IgG2CH2和CH3结构域(参见例如美国专利号7，148，326)。在某些实施方案中，可以组合来自不同同种型的部分结构域，以产生具有改变的二聚化性质的链交换工程化结构域(〃 SEED")，如美国专利申请公开号2007/(^87170中描述的。在一个实施方案中，抗体融合蛋白包括至少一个抗体可变结构域。抗体可变结构域可以是重链可变结构域或轻链可变结构域。应当理解，用于本发明的部分免疫球蛋白恒定区可以包括其突变体或类似物，或可以包括化学修饰的免疫球蛋白恒定区(例如，聚乙二醇化)或其片段。本领域技术人员可以使用公知的分子生物学技术制备此类变体。生物学活性分子本发明涉及包括2条多肽链的抗体融合蛋白。第一条多肽链包括与至少部分免疫球蛋白恒定区连接的生物学活性分子，并且第二条多肽链包括至少部分免疫球蛋白恒定区。生物学活性分子可以与免疫球蛋白恒定区的氨基末端连接。可替代地，生物学活性分子可以与免疫球蛋白恒定区的羧基末端连接。在一个实施方案中，第二条多肽链也可以包括生物学活性分子。
本发明考虑使用当施用于哺乳动物时能够发挥生物学作用的任何生物学活性分子。生物学活性分子可以包括但不限于多肽、核酸、小分子。生物学活性分子的其他例子包括但不限于激素、抗病毒剂、止血剂、肽、蛋白质、化疗剂、维生素、辅因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶核酸、反义核酸、三链体形成寡核苷酸和适体。细胞因子在一个实施方案中，生物学活性分子是细胞因子。细胞因子是支持细胞，包括淋巴细胞，生长和成熟的因子。细胞因子的例子包括但不限于白细胞介素-I(IL-I)、IL-2、IL-3、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、 IL-17、IL-18、淋巴因子抑制因子、巨噬细胞集落刺激因子、血小板衍生的生长因子、干细胞因子、肿瘤坏死因子、粒细胞集落刺激因子和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。在一个特定实施方案中，生物学活性分子可以包括人干扰素，例如干扰素-β。干扰素-β结构部分(moiety)可以是野生型成熟人干扰素_β蛋白质，或与野生型成熟人干扰素-β至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%等同的序列。例如，生物学活性分子可以掺入具有一个或多个突变的人干扰素-β部分，例如以改善融合蛋白的蛋白质折叠性质、减少聚集、或改善蛋白质表达。例如，抗体融合蛋白的干扰素部分可以包含在对应于天然成熟干扰素-β的位置17、50、57、130、131、136和140中的1、2、3、4个或更多个位置上的改变。在这些位置上的氨基酸改变可以通过本领域已知的方法经由氨基酸置换、氨基酸缺失或氨基酸修饰而实现。在这些残基上引入的改变被认为减轻非共价聚集。在一个例子中，在位置17上的半胱氨酸由丝氨酸(C17S)、丙氨酸(C17A)、缬氨酸(C17V)或甲硫氨酸(C17M)置换。在某些实施方案中，在位置50上的苯丙氨酸由组氨酸(F50H)替换。 在某些实施方案中，在位置57上的亮氨酸由丙氨酸(L57A)替换，而在其他实施方案中，在位置130上的亮氨酸由丙氨酸(L130A)替换。在某些实施方案中，在位置131上的组氨酸由丙氨酸(Η131Α)替换，而在其他实施方案中，在位置136上的赖氨酸由丙氨酸(Κ136Α)替换。在某些实施方案中，在位置140上的组氨酸由丙氨酸(Η140Α)或苏氨酸(Η140Τ)替换。 虽然已列举了某些氨基酸置换，但本发明并不限于这些改变。在天然成熟干扰素的位置17、50、57、130、131、136和140上的原始氨基酸残基，可以用能够对融合蛋白赋予合适性质的任何合适氨基酸置换。本发明还考虑抗体融合蛋白的干扰素部分具有如本文所公开的位置17、50、57、130、131、136和140上的改变中的1、2、3、4、5、6或7个的组合。生长因子在一个实施方案中，生物学活性分子是生长因子。生物学活性分子可以是能够诱导细胞生长和增殖的任何试剂。生长因子的例子包括但不限于肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、角质形成细胞生长因子、神经生长因子、肿瘤生长因子-α、表皮生长因子、 VEGF、胰岛素生长因子和胰岛素样生长因子I和II。在一个特定实施方案中，生物学活性分子是能够诱导红细胞增殖的任何试剂。因此，本发明考虑的生物学活性分子的一个例子是人促红细胞生成素。MM在一个实施方案中，生物学活性分子是激素。激素改变细胞生长、功能和代谢。激素的例子包括但不限于垂体激素，例如绒毛膜促性腺激素、二十四肽促皮质素、促滤泡激素、促生长素、iorticotropin、普罗瑞林、促甲状腺素、加压素、赖氨酸加压素；肾上腺激素例如倍氯美松双丙酸酯、倍他米松、地塞米松、氟羟泼尼松龙(triamcinolone)；胰腺激素例如胰高血糖素、胰岛素；甲状旁腺激素例如dihydrochysterol ；甲状腺激素例如降钙素、 甲状腺球蛋白、醋酸特立帕肽；类固醇激素例如糖皮质激素、雌激素、孕酮、雄激素、四氢去氧皮质酮；胃肠激素缩胆囊肽、肠高血糖素(enteroglycan)、甘丙肽、胃泌素、五肽胃泌素、四肽胃泌素、促胃动素、肽YY和胰泌素。在一个特定实施方案中，生物学活性分子是人生长激素。核酶在一个实施方案中，生物学活性分子是核酸例如DNA或RNA。例如，生物学活性分子可以是在RNA干扰中使用的核酸分子，例如反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、双链 RNA (dsRNA)、微小RNA (miRNA)和小发夹RNA (shRNA)。核酸分子应是长度约6-约60个核苷酸。例如，在某些实施方案中，核酸分子是长度约15-约50、约25-约45、或约30-约40个
核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA或其混合物或衍生物或修饰形式。寡核苷酸可以是在碱基部分、糖部分或磷酸主链上修饰的，例如以改善分子的稳定性、杂交等。寡核苷酸可以包括其他附着基团，例如多肽(例如用于在体内靶向宿主细胞受体)、 或促进跨细胞膜(参见例如 Letsinger 等人(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :6553 ； Lemaitre 等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :648 ；和 WO 88/09810)或血脑屏障(参见例如WO 89/10134)的转运的试剂、杂交触发的切割试剂(参见例如Krol等人(1988) BioTechniques 6 :958)或嵌入剂(参见例如 (1988) Pharrn. Res. 5 :539)。为此，寡核苷酸可以与另一分子缀合，例如多肽、杂交触发的交联剂、转运试剂、或杂交触发的切割试剂。小分子本发明还考虑任何治疗性小分子或药物作为生物学活性分子的用途。生物学活性分子可以是例如脂质分子。生物学活性分子可以是糖分子。生物学活性分子可以是小有机分子或小无机分子。经修饰的抗体融合蛋白的产生应当理解本发明可以采用常规重组DNA方法，以生成在本发明实践中有用的抗体融合蛋白。抗体融合构建体优选在DNA水平生成，将所得到的DNAs整合到表达载体内并表达以产生本发明的融合蛋白。本发明提供编码与至少部分免疫球蛋白恒定区连接的生物学活性分子的核酸，其中所述部分免疫球蛋白恒定区包括Fcfoi结合位点中的突变。在一个实施方案中，突变是用丙氨酸替换在免疫球蛋白恒定区的位置435上的组氨酸(H435A)的密码子置换。本发明还提供核酸组合物第一核酸编码生物学活性分子和至少部分免疫球蛋白恒定区；第二核酸编码至少部分免疫球蛋白恒定区。核酸之一编码具有影响Fcfoi结合的突变的免疫球蛋白恒定区。在一个实施方案中，突变是用丙氨酸替换在免疫球蛋白恒定区的位置435上的组氨酸(H435A)的密码子置换。核酸还可以包括本领域已知的其它序列或元件(例如启动子、 增强子、多聚A序列或亲和标签)。根据本发明的核酸和核酸组合物可以使用本领域公知的重组技术容易地合成。例如，核酸可以通过标准方法合成，例如通过使用自动化DNA合成仪。对于重组蛋白质生产，将核酸或核酸组合物插入合适的表达运载体内，S卩，包含对插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件的载体。如本文使用的，术语“载体”应理解为意指任何有能力掺入宿主细胞内并与宿主细胞基因组重组且整合到其内或作为附加体自主复制的核酸，包括核苷酸序列。此类载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒、RNA载体、病毒载体等。病毒载体的非限制性例子包括逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒。有用的表汰载体是DdCs (Lo 等人(1988)Protein Engineering 11:495)，其转录利用人巨细胞病毒的增强子/启动子和SV40多腺苷酸化信号。所使用的人巨细胞病毒的增强子和启动子序列源自Boshart等人(19^)^^1141 :521中提供的序列的核苷酸-601至 +7。该载体还包含突变的二氢叶酸还原酶基因作为选择标记(Simonsen和Levinson (1983) Proc. Nat. Acad. Scl USA 80 :2495)。适宜的分离的宿主细胞可以用本发明的DNA序列转化或转染，且用于靶蛋白的表达和/或分泌。用于本发明的示例性分离的宿主细胞包括永生化杂交瘤细胞、NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞和COS细胞。使用抗体融合蛋白的方法本发明还提供包括在Fcfoi结合位点中具有突变的抗体融合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。术语“药学上可接受的赋形剂”是本领域公知的，指在配制药物产品中使用的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如脂质或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂。在与主题组合物及其组分相容以及对于患者无害的意义上，每种赋形剂必须是“可接受的”。适宜药学载体的实例由E. W. Martin在Remington ‘ s Pharmaceutical kiences中描述。赋形剂的实例可以包括(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；( 淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；C3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)；明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡； (9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10) 二醇例如丙二醇；(11)多元醇，例如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和十二烷酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水； (17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)在药学制剂中采用的其他无毒相容性物质。本发明的组合物可以通过与具体分子相容的任何途径施用。考虑本发明的组合物可以通过任何合适方式提供给哺乳动物，直接地(例如局部地，如通过注射、植入或局部施用于组织部位)或全身性地(例如肠胃外或经口)。当组合物待肠胃外提供时，例如通过静脉内、皮下、眼、腹膜内、肌内、经颊、直肠、阴道、眶内、脑内、颅内、脊柱内、心室内、鞘内、池内、囊内、鼻内或通过气雾剂施用时，组合物优选包括部分水性或生理学相容液体的悬浮液或溶液。因此，载体或媒介物是生理学上可接受的，从而使得，除将所需组合物递送给患者外，它不会不利地影响患者的电解质和/或容积平衡。因此用于药剂的液体介质可以包括正常生理盐水。本发明提供治疗各种癌症、病毒疾病、其他疾病、相关病症及其原因的方法，所述方法通过给具有此类状况的哺乳动物施用本发明的DNA、RNA或蛋白质而进行。相关病症可以包括但不限于炎症病症或自身免疫疾病，例如多发性硬化、关节炎、银屑病、红斑狼疮；各种恶性肿瘤，例如急性髓样白血病、多发性骨髓瘤、何杰金氏病、基底细胞癌、宫颈发育不良和骨肉瘤；各种病毒感染，包括病毒性肝炎、带状疱疹和生殖器疱疹、乳头瘤病毒、病毒性脑炎和巨细胞病毒肺炎；贫血；和出血性病症。本发明的融合蛋白的最佳剂量将取决于待治疗的疾病和副作用的存在。最佳剂量可以使用例行实验进行测定。剂量/施用的范围可以为0. lmg/m2-100mg/m2Umg/m2-20mg/ m2和2mg/m2-6mg/m2。融合蛋白的施用可以为定期大剂量注射，或自外部储库(例如自静脉袋)或内部储库(例如自生物可蚀性植入物)的连续静脉内或腹膜内施用。此外，考虑本发明的融合蛋白还可以与多种不同的生物学活性分子联合施用于预期的接受者。可以想到，融合蛋白和其他分子的最佳组合、施用方式，剂量可以通过完全在本领域技术水平内的例行实验进行确定。考虑本发明的抗体融合蛋白还可以与至少一种其他药剂组合用于治疗具有疾病或病症的哺乳动物，其中所述其它药剂为已知治疗所述疾病或病症的药剂。实施例实施例1 用于表汰huFcV4h-单-L-DI-IFN β的DNA序列的构建huFCγ4h-单-L-DI-IFNβ (huFc γ 4铰链突变体-接头单体去免疫的干扰素-β ) 抗体融合蛋白是由人FcY4h链和人Fc-Y4h-接头-DI-IFNii链组成的异源二聚体。通过共表达人Fc y 4h链和人Fc- y 4h-接头-DI-IFN β链(其转录单位包含在1个单一质粒或 2个分开质粒中)，在哺乳动物细胞中产生了该蛋白质。编码huFc γ 4h (huFc γ 4铰链突变体)的DNA源自人IgG4基因组序列，并且随后工程改造为包含经修饰的Yl铰链区，以便使半分子形成降到最低。关于不在铰链区形成共价二硫键的IgG4半分子的形成，先前已有报道(Angal等人(1993)M01. Immunol. 30 :105)。编码人免疫球蛋白-Y 4的Fc片段(Fe γ 4)的DNA序列的构建编码人IgG4的基因组序列得自从HeLa细胞中分离的细胞DNA。该序列与GenBank 中公开的IgG4序列-LO⑶S HUMIG⑶2(登记号K01316)是高度保守的，除了在CH3区中有3 个氨基酸残基差异外。所公开的序列包含R409、E419、V422，而我们的序列包含K409、Q419、 1422。有趣的是，K409和Q419也在人IgGl、IgG2和IgG3中发现；1422在人IgG3中发现。 由来自其他IgG亚类的氨基酸置换组成的此类同种异型决定簇被称为isoallotypes，并且人 IgG4 基因的 isoallotypes 先前已有报道(Brusco 等人(1998)Eur. J. ImmunoRenetics 25:349-355)。Fc γ 4片段的氨基酸序列显示于SEQ ID Ν0:1中。SEQ ID NO 1 :huFc γ 4的肽序列(Y 4铰链区有下划线，并且Κ409、Q419、1422为粗体)ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNffYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS κ LTVDKSRWQ Q GN χ FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKFc Y 4铰链区的修饰具有氨基酸序列〃 ESKYGPPCPSCP" (SEQ ID NO 7)的Y 4铰链区由具有氨基酸序列〃 EH(SSDKTHTCPPCP〃 (SEQ ID NO:8)的经修饰的 Y 1 铰链区(Lo 等人(1998)Protein EnRineerinR 11 =495-500)替换，以使半分子的形成降到最低(美国专利号7，148，321)。为了修饰Fc γ 4的铰链区，包含天然Y 4铰链外显子(粗体)的Aflll-MuI 片段 5 ‘ CTTAAGC AGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAG (SEQ ID N0:9)由包含具有Cys至Ser置换(下戈丨」 线)的经修饰Yl铰链外显子(粗体)的相应Aflll-StuI片段 5 ‘ -CTTAAGC AGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCA CCGTGCCCAG (SEQ ID NO :10)替换，所述Cys至Ser置换消除正常与轻链配对的 Cys残基。因为在Yl和Y 4外显子中的MuI位点是C甲基化的，并且MuI限制性核酸内切酶是甲基化敏感的，所以在可以用MuI酶消化前，2种质粒均必须从DNA胞嘧啶甲基化酶(DCM)阴性细菌菌株中分离。具有经修饰的Yl铰链区的所得到的Fc γ 4被命名为 Fc y 4h ( y 4h γ -4铰链突变体)。IFN-β β的克隆和去免疫成熟IFN- β的编码序列由人胎盘DNA PCR扩增(Sigma, Poole, UK)。克隆的PCR 产物进行测序，以鉴定IFN-β克隆，其氨基酸序列与GenBank中所公开的野生型IFN-β序列-LOCUS ΧΜ_005410 完全匹配。去免疫的IFN-β (DI-IFNP)包含去除潜在T辅助细胞表位的3个氨基酸置换仏57々、!113认、!1140幻、和使共价聚集最小化的1个氨基酸置换(C17S)。将编码DI-IFNβ的 DNA克隆到已修饰过的哺乳动物表达载体DdCs-huFc (Lo等人(1998) Protein Engineering 11 :495-500)内，使IFN-β序列经由具有氨基酸序列(^4SG4SG3SG的15个氨基酸柔性接头与人Fcy 4h的C末端融合。接头-DI-IFN^命名为L-DI-IFN^，其序列显示于SEQ ID NO: 2 (接头有下划线，C17S、L57A、H131A和H140A为粗体)。SEQ ID NO 2 =L-DI-IFNg 的肽序列GGGGSGGGGSGGGSGMSYNLLGFLQRSSNFQ s QKLLffQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKE DAA A TIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRI L χ YLKAKEYS A CAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN基因组前导区适应性改变为信号肽用于分泌来自小鼠免疫球蛋白轻链基因的基因组信号肽序列038-bp)用于huFcY4h和 huFcy4h-L-DI-IFN^链的分泌。编码信号肽的_2氨基酸残基(_1氨基酸是信号肽的C 末端残基)的基因序列经诱变，由丝氨酸残基变成亮氨酸残基(AGC至TTA)，从而使得编码信号肽末尾的DNA是CTTAAGC，其中CTTAAG是生成的AflII位点(Lo等人(1998) Protein Engineeringl 1 :495-500)。此外，引入Kozak共有序列CCACC ATG G用于最佳的核糖体结合以便在ATG的翻译起始(Kozak等人(1986)Cell44 =283-292)。这通过将起始密码子后的第一个氨基酸残基从AAG突变成GAG以给出序列TCTAGACCACC ATG GAG (SEQ ID NO 11) 来达到，其中Kozak共有序列有下划线，TCTAGA是)(baI位点。由此，信号肽包含在起始密码子后的第一个氨基酸残基上的置换、和在-2位置上的氨基酸残基上的另一个置换。因为信号肽在细胞内被信号肽酶切割而不出现在分泌的蛋白质中，所以这些突变不影响FcY4h 和Fc y 4h-L-DI-IFN^产物的氨基酸组成。huFc γ 4h 禾口 huFc y 4h-L_DI_IFN β 链的月太和 DNA 序列对完整huFc Y4h和huFc Y4h-L-DI_IFN0链的编码区进行了完全测序。huFc γ 4h 和 huFc Y4h-L-DI-IFN0 链的肽和 DNA 序列显示在 SEQ ID NO :3 至 SEQ ID NO :6。为了促进编码huFc y 4h和L-DI-IFN^的DNA片段的连接，通过使用在人IgG4(GenP印t中LOCUS CAC20457)中以及在 IgGl 和 IgG2 中存在的 PGK 序列(Lo 等人(1998) Protein EnRineering
1811 :495-500)，产生SmaI位点；此外，在CH3的C末端残基上引入赖氨酸至丙氨酸置换，以使在连接处的潜在切割降到最低。重要的是，在CH3-L-DI-IFNi3连接处所得到的序列不产生任何潜在的T细胞表位。SEQ ID NO 3 :huFc y 4h的肽序列(信号肽有下划线)MELPVRLLVLMFffIPASLSEPKSSDKTHTCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NIFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO 4 从翻译起始密码子到翻译终止密码子的huFc y 4h链的DNA序列 (编码序列为大写字母，非编码序列为小写字母)ATGGAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGgtgaggagagagggaagtgaggg aggagaatggacagggagcaggagcactgaatcccattgctcattccatgtattctggcatgggtgagaagatgggt cttatcctccagcatggggcctctggggtgaatacttgttagagggaggttccagatgggaacatgtgctataatga agattatgaaatggatgcctgggatggtctaagtaatgcctagaagtgactagacacttgcaattcactttttttgg taagaagagatttttaggctataaaaaaatgttatgtaaaaataaacatcacagttgaaataaaaaaaaatataagg atgttcatgaattttgtgtataactatgtatttctctctcattgtttcagCTTCCTTAAGCGAGCCCAAATCTTCTG ACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGgtaagccagcccaggcctcgccctccagctcaaggcgggacaggtgc cctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacgcatccacctccatctcttcctGagCACCTG AGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG GTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGT GCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC ACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACC ATCTCCAAAGCCAAAGgtgggacccacggggtgcgagggccacatggacagaggtcagctcggcccaccctctgccc tgggagtgaccgctgtgccaacctctgtccctacagGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC CAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGA GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCC TCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGASEQ ID NO 5 :huFc y 4h_L-DI_IFN β的肽序列(信号肽和CH3末端的K至A置换有下划线；L-DI-IFN β为粗体)MELPVRLLVLMFffIPASLSEPKSSDKTHTCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNIFSCSVMHEALHNHYTgKSLSLSPGAeGGGSC^GSGSGSGMSBSIitGFLtlSEQ ID NO 6 从翻译起始密码子到翻译终止密码子的huFcy4h-L-DI-IFN^链的DNA序列(编码序列大写字母，非编码序列小写字母)ATGGAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGgtgaggagagagggaagtgagggaggagaatggacagggagcaggagcactgaatcccattgctcattccatgtattctggcatgggtgagaagatgggt cttatcctccagcatggggcctctggggtgaatacttgttagagggaggttccagatgggaacatgtgctataatga agattatgaaatggatgcctgggatggtctaagtaatgcctagaagtgactagacacttgcaattcactttttttgg taagaagagatttttaggctataaaaaaatgttatgtaaaaataaacatcacagttgaaataaaaaaaaatataagg atgttcatgaattttgtgtataactatgtatttctctctcattgtttcagCTTCCTTAAGCGAGCCCAAATCTTCTG ACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGgtaagccagcccaggcctcgccctccagctcaaggcgggacaggtgc cctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacgcatccacctccatctcttcctcagCACCTG AGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG GTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGT GCATAATGC CAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG CACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAAC CATCTCCAAAGCCAAAGgtgggacccacggggtgcgagggccacatggacagaggtcagctcggcccaccctctgcc ctgggagtgaccgctgtgccaacctctgtccctacagGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATC CCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGC TCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTGCAGGGGGCGGGGGCAGCGGGGGCGGAGGAT CCGGCGGGGGCTCGGGTATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAGCAATTTTCAGAGTCAGAAGCTC CTGTGGCAATTGAATGGGAGGCTTGAATATTGCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCA GCTGCAGCAGTTCCAGAAGGAGGACGCCGCAGCCACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAGAC AAGATTCATCTAGCACTGGCTGGAATGAGACTATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCTATCATCAGATAAACCAT CTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGATTTCACCAGGGGAAAACTCATGAGCAGTCTGCACCTGAA AAGATATTATGGGAGGATTCTGGCCTACCTGAAGGCCAAGGAGTACAGTGCCTGTGCCTGGACCATAGTCAGAGTGG AAATCCTAAGGAACTTTTACTTCATTAACAGACTTACAGGTTACCTCCGAAACTGA实施例2 构建用于表达在Y 4中包含H435A置换的huFcv4h_单-L-DI-IFNg变体的DNA序列构建了用于表达在Y4中包含Η435Α置换(Kabat编号)的 huFcv4h-单-L-DI-IFN^变体的DNA序列。这包括编码异源二聚体huFc γ 4h(H435A)/ huFc y 4h-L-DI-IFN β、huFc γ 4h/huFc γ 4h (Η435Α) -L-DI-IFN β 禾口 huFc γ 4h (Η435Α) / huFc γ 4h (Η435Α) -L-DI-IFN β的DNA序列。通过用诱变引物进行重叠PCR(Daugherty等人 (1991)Nucleic Acids Res. 19 :2471-2476)，在裸 huFc γ 4h 链或 huFc γ 4h-L_DI_IFNβ 融合蛋白链中引入编码Η435Α置换的从CAC密码子到GCG的突变，其中使用正向引物5' -G GCTCTGCACAACGCGTACACGCAGAAGAG (SEQ ID NO 12)，其中 _ 编码丙氨酸置换,和反向引物 5 ‘ -CTCTTCTGCGTGTACGCGTTGTGCAGAGCC (SEQ ID NO 13)，其中是丙氨酸置换的反密码子。实施例3 融合蛋白的表达通过共表达人Fcy 4h链和人Fc-Y 4h_接头-DI-IFN^链，在哺乳动物细胞中产生了 11砂(^411-单-1^-01-0^^异源二聚体，其中所述链的转录单位包含在1个单一质粒或2个分开质粒中。对于蛋白质表达的快速分析，使用lipofectamineanvitrogen，Carlsbad, CA)通过瞬时转染，将质粒 pdCs_Fc γ 4h 和 pdCs_Fc Fc γ 4h_ 接头-DI-IFN β 或变体引入人肾细胞内(GenHunter Corporation，Nashville，TN)。小鼠骨髓瘤NS/0和中国仓鼠卵巢细胞用于获得稳定转染的克隆，其表达 huFCγ4h-单-L-DI-IFNβ异源二聚体。为高水平表达，通过电穿孔将包含人Fc γ 4h链和人Fcy 4h-接头-DI-IFN β链转录单位的质粒pdCs引入小鼠骨髓瘤NS/0细胞内。NS/0 细胞在补充有10%热灭活胎牛血清、2mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素的达尔贝科改良伊格尔培养基中生长。约切106细胞用PBS洗涤1次，并且重悬浮于0.5ml PBS中。随后使 10 μ g线性化质粒DNA与细胞在Gene Pulser Cuvette (0. 4cm电极间距，BioRad)中在冰上孵育 10 分钟。使用设为 0. 25V 和 500 μ F 的 Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA)执行电穿孔。允许细胞在冰上恢复10分钟，这之后重悬浮于生长培养基中，并且在2块96孔板上铺平板。通过在IOOnM氨甲蝶呤(MTX)的存在(在转染后2天加入生长培养基中)下的生长，选择了稳定转染的克隆。细胞每3天饲喂，进行再2-3次饲喂，MTX抗性克隆在2-3周内出现。通过抗Fc ELISA测定来自克隆的上清液，以鉴定高生产者。分离高生产克隆，并且在包含IOOnM MTX的生长培养基中增殖。典型使用的生长培养基是H-SFM或⑶培养基 (Invitrogen, Carlsbad, CA)。对于通过凝胶电泳的常规表征，在ftOtein A Sepharose珠(R印ligen， Cambridge, ΜΑ)上捕获分泌到培养基内的huFc_IFNi3融合蛋白，并且随后通过在加有或未加有还原剂例如巯基乙醇的蛋白质样品缓冲液中煮沸样品而进行洗脱。通过 SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析样品，并且通过考马斯染色显现蛋白质条带。图8显示通过人Fcy 4h链和人Fcy 4h-接头-DI-IFN β在四31~细胞中的瞬时共表达而产生的huFc y 4h-单-L-DI-IFN β。在还原条件下SDS-PAGE分析的泳道2 (左泳道)显示，Fcy 4h链和Fcy 4h-接头-DI-IFNii链均表达，并且裸Fc以比融合蛋白更高的水平表达。当这2条链以这些水平共表达时，预期非还原性凝胶应根据二项式a2+2ab+b2显示裸Fc同源二聚体Fc/Fc-IFNi3异源二聚体Fc_IFNi3同源二聚体的比，其中a和b分别是还原性凝胶上可见的裸Fc链和融合蛋白链的相对表达水平。令人惊讶的是，在非还原条件下的SDS-PAGE分析(中泳道)显示产生了极少的Fc-IFNii同源二聚体(〃 (Fc-X)2")， 与由Fc和Fc-IL-2的共表达(也在非还原条件下分析)获得的更正常模式(右泳道)(根据a2+2ab+b2的比率)形成鲜明对比。共表达Fc y 4h链和Fc y 4h_接头-DI-IFN β链的稳定克隆类似地缺乏!^c-IFNii同源二聚体(图9)，提示Fc-IFNii同源二聚体在细胞中的产生是不利的，这可能的原因是蛋白质折叠，因为IFNii自身趋于聚集。实施例4 :huFc γ 4h~ 单-L-DI-IFNg g 的纯化基于Fc蛋白质部分对于蛋白A的亲和力，执行含Fc融合蛋白的纯化。简言之， 将包含融合蛋白的细胞上清液装载到预平衡的I^rotein Akpharose柱上，并且在相同缓冲液(在中性PH下150mM磷酸钠、IOOmMNaCl)中彻底洗涤柱。结合的蛋白质在低pH(pH 2.5-3)在相同缓冲液中洗脱，并且立即中和洗脱物级分。基于IFNii蛋白质对于Cikicron Blue3GA(Blue Sepharose Fast Flow 柱；Pharmacia)的亲禾口力，huFc γ 4h_ 单一L—DI—IFN β 异源二聚体可以与FcY4h同源二聚体容易地分离。包含所表达的融合蛋白的培养上清液调整至IM NaCl，并且装载到用缓冲液A (缓冲液A :20mM磷酸钠(pH 7. 2) IM NaCl)预平衡的Blue Sepharose FastFlow柱上。用10柱体积的缓冲液A，随后用15柱体积的缓冲液
21A:缓冲液B(缓冲液B:20mM磷酸钠(pH 7. 2),50% (ν/ν)乙二醇)的1 1混合物，洗涤柱。异源二聚体在100%缓冲液B中洗脱，将Iml级分收集到包含0. 5ml缓冲液A的管内。 通过尺寸排阻色谱(SEC)分析纯化的huFc γ 4h-单-L-DI-IFN β，并且通过用抗IFN β抗体探测蛋白质印迹，进一步证实。^MM 5 句,含消除FcRn结合的单置换的免,疮球蛋白_和huFc-单-配体夺体的表汰衍生自Fc-SEED (参见 W02007/110205)的 huFc-单-L-DI-IFN^ 变体以 huFc-AG2(H435A)/huFc-GA2-L-DI-IFN0的形式产生。产生的另外变体包括IgG亚类和配体变体，例如 huFc y 1 (H435A) /huFc y 1-IL2 和去免疫的 KS- y 1 (Η435Α) /KS- y 1-IL2，称为免疫细胞因子的一种全IgG融合蛋白(Davis等人Q003) Cancer Immunol. Immunother. 52 297-308)。除 H435 夕卜，H310 也被报道参与 FcRn 结合(Kim 等人(1999)Eur. T. Immunol. 29 2819-2825)。因此，包含H310A置换的另一个huFc y 4h-单-L-DI-IFN β变体以 huFc y 4h (H310A) /huFc y 4h-L_DI_IFN β 异源二聚体的形式产生。t施例6.在某干细朐的牛物测I^H式骀中huFc-IFNg蛋白质的活件在抗病毒测定试验中测定Fc-IFNii融合蛋白的活性。病毒复制对于细胞通常是毒性的，导致细胞裂解，一种称为致细胞病变效应(CPE)的效应。干扰素作用于抑制病毒增殖的途径，保护细胞不发生CPE。IFN^的抗病毒活性可以通过测量CPE被减少的程度 (CPER)来测定，参见如 M. J. Clemens, A. G. Morris 和 A. J. H. Gearin, I. R. L. Press, Oxford, 1987 IS车t的"Lymphokines and Interferons :APractical Approach “中的ffii$。贞_入上皮肺癌细胞系A549(ATCC#CCL-185)作为脑心肌炎病毒(EMCV ;ATCC#VR 129B)的宿主， 比较纯化的Fc y 4h-单-L-DI-IFN β和包含Η435Α置换的Fc y 4h-单-L-DI-IFN β变体与 Rebif的抗病毒活性。有效剂量(ED50)设为导致50% CPER(即50%细胞受保护)的蛋白质的量，相对于未感染的对照细胞来测定。在摩尔基础上，发现Fcy 4h-单-L-DI-IFN β和 Fc y 4h-单-L-DI-IFN^变体在此CPE测定试验中均与Rebif至少一样有力(图10)。实施例7. huFc-IFNg蛋白质的药代动力学在Balb/c小鼠(n = 3)中测定huFc_IFNi3异源二聚体融合蛋白和变体的药代动力学(PK)。对于静脉内施用，将25yg异源二聚体融合蛋白注射到每只小鼠的尾静脉内。通过眶后采血，在注射后立即(t = 0分钟)以及在注射后30分钟、1小时、2小时、4 小时、8小时、24小时、48小时、72小时和96小时，将血液收集到肝素包被的管内。对于皮下施用，每只小鼠注射50yg异源二聚体融合蛋白。。通过眶后采血，在注射后1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时和96小时，将血液收集到肝素包被的管内。通过离心(以12，500g，4分钟)去除细胞，并且通过抗huFc ELISA和抗huFc-IFN β ELISA， 测定血浆中的融合蛋白浓度，其中，抗huFc ELISA包括抗-(H&L) (AffiniPure山羊抗人 IgG (H+L) ,Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA)捕获禾口抗 Fc (HRP-缀合的(Fab' )2 二聚体山羊抗人 IgG Fe, Jackson Immuno ResearchLaboratories, West Grove,PA)检测，抗huFc-IFNβ ELISA包括抗(H&L)捕获和抗huIFN0 (生物素化的山羊抗 A IFN^ ,R&D Systems,Minneapolis,MN)检测。此外，通过用抗 huFc 抗体或抗 huIFNβ 抗体探测Hi血清样品的免疫印迹，证实了循环融合蛋白的完整性。
图11和12比较了静脉内施用的huFc γ 4h-单-L-DI-IFN β和包含Η435Α置换的 huFc y 4h-单-L-DI-IFN β 变体(以 huFc4h (H435A) /huFc y 4h-L_DI_IFN β 异源二聚体的形式)的药代动力学曲线(分别通过抗huFc ELISA和抗huFc-IFNi3 ELISA测定)。 huFc y 4h-单-L-DI-IFNii具有48小时的循环半衰期，比以分钟计的IFNi^的循环半衰期长很多倍。令人惊讶的是，包含H435A置换的huFc y 4h_单-L_DI_IFNi3变体具有46小时的循环半衰期，这基本上等同于在实验误差内的huFc γ 4h-单-L-DI-IFNii的循环半衰期。此外，H435A变体的AUC(曲线下面积)为野生型的AUC的约三分之二，这是IFNβ的几百倍。抗huFc-IFN β ELISA特异性检测融合蛋白，而不检查不含N末端Fc或C末端IFN β 部分的任何断裂片段。此外，使用抗huFc抗体或抗huIFNii抗体作为探针在还原条件下对静脉内Hi样品的蛋白质印迹分析证实，融合蛋白在体内保持完整(图17)。在图17的左上部分中，上箭头指示huFcY4h-L-DI-IFNi3多肽链，并且下箭头指示huFc γ 4h链。类似地，在图17的左下部分中，上箭头指示huFCY4h-L-DI-IFNi3多肽链，并且下箭头指示 huFc y 4h (H435A)链。图16和13比较皮下施用的相同2种分子的药代动力学曲线。 huFc y 4h-单-L-DI-IFN^ 和包含 H4!35A 置换的 huFc y 4h-单-L_DI_IFN0 变体具有相似的循环半衰期，这比IFNi3的长很多倍。令人惊讶的是，包含H435A置换的 huFc y 4h-单-L-DI-IFN β变体具有46小时的循环半衰期，这基本上等同于在实验误差内的huFcγ4h-单-L-DI-IFNβ的。Η435Α变体还具有野生型的AUC (曲线下面积)之约三分之二的AUC，这是IFN0的几百倍。抗hu Fc ELISA和抗hu IFN0 ELISA检测融合蛋白分子的2个末端。此外，使用抗huFc抗体或抗hu IFNii抗体作为探针在还原条件下蛋白质印迹分析皮下I3K样品，证实了融合蛋白在体内保持完整(图15)。在图15的左上小图中，上箭头指示huFc y 4h-L-DI-IFNi3多肽链，并且下箭头指示huFc y 4h链。类似地，在图15的左下小图中，上箭头指示huFc y 4h-L-DI-IFN β多肽链，并且下箭头指示huFc y 4h (H435A) 链。实施例8.包含消除FcRn结合的单置换的免疫球蛋白_和huFc-单-配体变体的减少免疫原性为了证实仅一条多肽链包含消除Fcfoi结合的单置换的免疫球蛋白-或 huFc-单-配体变体具有减少的免疫原性，用huFc y 4h-单-L-DI-IFN^或包含H435A突变的huFCγ4h-单-L-DI-IFNβ变体免疫接种小鼠。在免疫接种后的合适时间比较抗体滴度。用33 μ g/ 小鼠的 huFc γ 4h-单-L-DI-IFN^ 或包含 H4!35A 突变的 huFc y 4h-单-L-DI-IFNii变体，分别皮下注射2组雌性、8周龄Balb/C小鼠(5只小鼠 /组)。在第15天时，小鼠接受33 μ g/小鼠的huFc γ 4h-单-L-DI-IFN β或包含Η435Α 突变的11砂(^411-单-1^-01-0^^变体的皮下加强注射。通过ELISA在第沈天时测定小鼠抗体滴度。这包括通过在PBS中在4°C孵育过夜，用Iyg山羊抗小鼠IgG(H+L) (JacksonImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA,目录 #115-005-062)包被 96 孑L 板的孔，随后用PBS 0. 05% Tween洗涤4次。接下来，用乳封闭山羊抗小鼠IgG(H+L) 包被的板，用PBS 0. 05% Tween洗涤4次，干燥且贮存于_20°C。对于捕获小鼠抗体，血清在PBS 0.05% Tween中最初稀释1 1000，随后1 2系列稀释，在37°C加入山羊抗小鼠IgG(H+L)包被的孔中1小时。随后用PBS 0.05% Tween洗涤孔4次。通过加入免疫原， 0. 5 μ g/ml 的 huFc y 4h_ 单-L-DI-IFN^ 或包含 H435A 突变的 huFc y 4h_ 单-L-DI-IFN^ 变体，禾口 F(ab)2 山羊抗 hu-IgG-Fc-HRP(JacksonImmunoResearch Laboratories,目录 #109-036-098)在PBS 0. 05% Tween中的1 20，000稀释物，检测捕获的抗体。板在室温孵育1小时，随后用PBS 0.05% Tween洗涤4次。使用100 μ 113' ,3' ,5' ,5'-四甲基联苯胺(TMB)，检测信号，在15分钟后用100μ 12Ν H2SO4终止反应。图15比较用huFcY4h-单-L_DI_IFN3或包含H435A突变的 huFc y 4h-单-L-DI-IFN β变体免疫接种的小鼠的抗体滴度。接受包含Η435Α突变的 huFc y 4h-单-L-DI-IFN β变体(菱形)的小鼠具有比huFc y 4h-单-L-DI-IFN β (圆圈)免疫接种的小鼠更低的滴度，说明变体具有减少的免疫原性。使用配对t检验，通过 Sigma-Plot分析该组间比较。在2个组之间的差异是统计学显著的(正态性检验p = 0. 288，t = 5. 422，自由度为 7 (ρ = < 0. 001))。^MM 9.诵i寸体外T细胞JlIiH式骀来测丨定免,疮原十牛为了显示包含H435A突变的huFc-单-配体变体比野生型对应物具有更少免疫原性，使用人T细胞增殖测定试验，包括单核细胞衍生的树突状细胞(DC)的培养和成熟，抗原在DC上的装载和呈递，和在CD4+T细胞中抗原诱导的应答的测定。来自健康供体的人外周血单核细胞(PBMC)充当DC和自体T细胞的来源。典型地，通过 Ficoll-Hypaque梯度从Ieukopack样品中分离PBMC，并且使用MACS CD14分离试剂盒 (Miltenyi Biotec he. Auburn，CA)纯化单核细胞，用GM-CSF和IL-4培养5天。用不同抗原，例如 huFc y 4h-单-L-DI-IFN β、包含 Η4!35Α 突变的 huFc y 4h-单-L-DI-IFN β 变体、以及破伤风类毒素，装载未成熟的DC。因为IFNi3具有非常有力的免疫抑制作用，所以 huFc y 4h-单-L-DI-IFN β和huFc y 4h_单-L-DI-IFN β变体必须在适度高温进行热处理， 以便较为热敏感的IFNii部分被灭活，同时较为热稳定的Fc以其天然形式保留。用于此选择性灭活的有用温度范围是56°C-65°C。可替代地，包含失活IFNi3部分的融合蛋白可以通过氨基酸置换而重组生产。在DC与抗原孵育M小时后，用TNF-α、IL-1 β、IL-6和PGE2刺激DC 24小时，以诱导DC成熟。使用MACS CD4分离试剂盒(Miltenyi Biotec Inc. Auburn,CA)由相同人PBMC 制备的自体CD4+T细胞，使用CellTrace CFSE增殖试剂盒Gnvitrogen)，用羧基荧光素二乙酸酯和琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记。DC和T细胞随后共培养6-7天，这之后在FACS上测定分裂T细胞的百分率。与相应野生型Fc融合蛋白相比，被来自11砂(^411-单-1^-01-0^3 变体的DC呈递肽刺激的自体T细胞增殖预期将较低。
权利要求
1.包括第一和第二重链结构域的抗体融合蛋白，其中每个结构域均包括至少部分免疫球蛋白恒定区，其中所述第一或第二重链结构域中至少一个与生物学活性分子融合，并且所述第一或第二重链结构域中仅一个包括在恒定区内的氨基酸序列突变，其中所述突变导致Fcfoi结合的部分或完全丧失。
2.权利要求1的抗体融合蛋白，其中所述突变是在位置386、388、400、415、433、435、 436,439和447中的一个或多个上的氨基酸残基的置换。
3.权利要求2的抗体融合蛋白，其中所述突变是至少H435的置换。
4.权利要求2的抗体融合蛋白，其中所述突变是H435A。
5.根据权利要求1-4中任一项的抗体融合蛋白，其中生物学活性分子与免疫球蛋白恒定区的氨基末端连接。
6.根据权利要求1-4中任一项的抗体融合蛋白，其中生物学活性分子与免疫球蛋白恒定区的羧基末端连接。
7.根据权利要求1-6中任一项的抗体融合蛋白，其中第一和第二重链结构域均包括生物学活性分子。
8.根据权利要求1-7中任一项的抗体融合蛋白，其中第一和第二重链结构域是包括铰链区的CH2和CH3结构域，且构成Fc片段。
9.根据权利要求1-8中任一项的抗体融合蛋白，其中第一和/或第二重链结构域包括抗体可变结构域，从而形成完全抗体。
10.根据权利要求1-9中任一项的抗体融合蛋白，其中所述免疫球蛋白是IgG。
11.根据权利要求10的抗体融合蛋白，其中所述IgG是IgGl、IgG2或IgG4。
12.根据权利要求1-4中任一项的异源二聚体抗体融合蛋白，其中(i)第一和第二重链结构域是包括铰链区的CH2和CH3结构域，构成Fc片段；( )第一重链结构域经由其C末端与生物学活性分子融合；和(iii)第二重链结构域不与生物学活性分子融合。
13.权利要求12的抗体融合蛋白，其中导致Fcfoi结合的丧失或减少的所述突变位于不与生物学活性分子融合的重链结构域中。
14.权利要求12的抗体融合蛋白，其中导致Fcfoi结合的丧失或减少的所述突变位于与生物学活性分子融合的重链结构域中。
15.根据权利要求1-14中任一项的抗体融合蛋白，其中生物学活性分子选自细胞因子、生长因子、生长激素和治疗上有效的多肽。
16.权利要求15的抗体融合蛋白，其中生物学活性分子是人干扰素或人促红细胞生成ο
17.权利要求16的抗体融合蛋白，其中人干扰素是干扰素-β(IFN^)0
18.权利要求15的抗体融合蛋白，其中人IFNi3的氨基酸序列是改变的。
19.权利要求18的抗体融合蛋白，其中所述IFNii序列包括在相应于于天然成熟人 IFNβ的位置17、50、57、130、131、136和140中的一个或多个上的氨基酸置换。
20.权利要求19的抗体融合蛋白，其中所述氨基酸置换选自C17S、C17A、C17V、C17M、 F50H、L57A、L130A、Η131Α、Κ136Α、Η140Α 和 Η140Τ。
21.一种核酸分子，其编码权利要求1-20中任一项的抗体融合物。
22.一种适用于制备权利要求1-20中任一项的抗体融合蛋白的核酸组合物，其包括 (i)编码第一重链结构域的核酸，所述第一重链结构域包括与至少部分IgG恒定区融合的生物学活性分子，和( )编码第二重链结构域的核酸，所述第二重链结构域包括不与生物学活性分子融合的至少部分IgG恒定区，其中所述IgG恒定区或其部分中仅一个包括导致Fcfoi结合的部分或完全丧失的突变。
23.一种可复制的表达载体，其包括权利要求21的核酸。
24.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求23的表达载体，或包括权利要求22(i)的核酸的第一表达载体和包括权利要求22 (ii)的核酸的第二表达载体。
25.一种药物组合物，其包括权利要求1-20中任一项的抗体融合蛋白和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
26.权利要求1-20中任一项的抗体融合蛋白或权利要求25的药物组合物用于治疗癌症、病毒感染、贫血或多发性硬化。
全文摘要
本发明公开具有经修饰的FcRn结合位点的抗体融合蛋白和编码其的核酸分子。抗体融合蛋白包括2条多肽链，其中第一条多肽链包括与至少部分免疫球蛋白恒定区连接的生物学、优选治疗上活性的分子。第二条多肽链包括至少部分免疫球蛋白恒定区。多肽链之一包括在恒定区中的突变，所述突变导致FcRn结合的减少或丧失，但不引起所述抗体融合蛋白的血清半衰期的实质上减少。在一个优选实施方案中，本发明涉及相应地构建的Fc-IFNβ分子。本发明还公开产生融合蛋白的方法和通过施用融合蛋白减轻疾病和病症以使用融合蛋白用于治疗的方法。
文档编号C07K16/00GK102405230SQ201080017392
公开日2012年4月4日 申请日期2010年4月19日 优先权日2009年4月22日
发明者K-M·劳, P·A·斯泰因 申请人:默克专利有限公司