基于纳米多孔金片电极的电化学免疫传感器对巯基乙酸的检测的制作方法
【专利摘要】本发明利用电化学生物传感器的高灵敏度和生物放大技术构建了一种基于纳米多孔金片电极以及HRP标记CRP抗体修饰的纳米金粒子复合物的高灵敏电化学免疫传感器对微量有害物质进行检测。首先制备纳米多孔金片电极，然后在电极表面层层依次修饰目标检测物（巯基乙酸）、抗体、抗原-金纳米粒子复合物，最后进行电化学检测。金纳米粒子作为支撑材料大大增加了固定的标记抗体的数量，提高了分析检测的灵敏度。
【专利说明】基于纳米多孔金片电极的电化学免疫传感器对巯基乙酸的检测
【技术领域】
[0001]电化学生物传感器对于物质的检测具有较高的灵敏度，利用电化学检测技术与生物检测放大技术相结合制备高灵敏度传感器，实现对目标检测的高灵敏度检测。
【背景技术】
[0002]电极是电化学生物传感器的核心部件之一，其发展对各种电化学生物传感器的发展起到了关键的作用。自1975年化学修饰电极问世以来，已成为整个化学界瞩目的非常活跃的电化学研究新领域，推动了电化学及电分析化学研究的发展，是近代电分析化学领域中一个重要的研究方向。电极材料是电化学研究的极为重要的因素，电极的性能，尤其是电极的表面性能关系到电化学的效率。1973年Lane和Hubbard开辟了改变电极表面结构以控制电化学反应过程的新概念，指示了化学修饰电极的萌芽。1975年,Miller和Murray分别报道了电极表面进行化学修饰的研究，标志着化学修饰电极正式问世。化学修饰电极是利用化学和物理的方法，通过吸附、共价键合、聚合等手段有目的的将具有特定功能性(如催化、配合、电色、光电)分子、离子、聚合物固定在电极表面，从而改变或改善了电极原有的性质。化学修饰电极实现了电极的功能设计，在电极上可进行某些预定的、有选择性的反应，并加快了电子转移速度。
[0003]纳米多孔材料是兼具功能和结构双重属性的一类特殊工程材料。它保留了金属的可焊性、导电性、延展性以及结构强度高、耐高温等特性，而且具备稳定的孔隙结构和由此带来的流体渗透率高、比表面积大等独特性能。金属纳米多孔材料由于其表面和结构特性，可广泛用于离子交换、催化、分离、生物分子的隔离和净化、传感器等领域。多孔金这种纳米材料不仅具有其它多孔金属所具有的特性:如导电性、大的比表面积，除此外它还保留了金特有的性质，应用极其广泛。
[0004]生物传感器是一种将酶、抗体等对生物体功能有响应的最小单体引入电极，以此来对目标检测物进行分析检测的检测器，具有专一、快速、灵敏、准确等优点，已广泛应用于临床检测、环境检测和生化分析等领域。其中电流型酶传感器研究最多的一种类型。Arnold等将谷氨酸氧化酶固载于Nafion修饰的钼电极上，制成了对谷氨酸敏感的生物传感器，检测限为0.3 μ mol/L,线性范围高达800 μ mol/L。选择性明显提高，有效消除了来自抗坏血酸、尿酸和乙酰氨基酚等杂质的干扰。
【发明内容】
[0005]本发明在结合了前人工作的基础上提出了一种新颖的电化学检测特定有机污染物的方法，构建了一种全新的依据夹心式免疫反应结合纳米多孔金片修饰的电极。利用目标检测物的连接作用和辣根过氧化物酶(HRP)催化H2O2氧化邻苯二胺伏安酶联免疫体系，来实现对目标检测物的定性定量监测分析。此种检测方法对于目标检测物(巯基乙酸)的检测范围在0.0lngmL-1到0.SngmI/1,检测限更是低至0.00685ng/mL。这相对于陈小军等人的工作(Anal.Chem.，2008, 80(6):2133-2140)来讲，其检测灵敏度至少提高了十倍以上。
[0006]本发明所提供的方法包括以下步骤:
[0007]( I)制备还原性金纳米粒子。
[0008]所述的方法，其所述的还原剂为柠檬酸三纳。
[0009](2)将所制备的金纳米粒子溶液调节至碱性；直接将经HRP标记CRP抗体溶液加入至金纳米粒子溶液中，反应结束后将产品离心分离并用PBS缓冲溶液清洗。
[0010]所述的方法，其所述的将纳米粒子调节为碱性的调节剂为NaOH溶液，最终溶液pH=9.00
[0011](3)将白金片在硝酸溶液中浸泡，然后用三次水除去可能会影响检测结果的杂质离子，再用抛光粉抛光玻碳电极后将其用蒸馏水洗净，最后通过物理吸附作用且经红外灯照射后，纳米多孔金片就被修饰到玻碳电极上。
[0012]所述的方法，其所述的白金片为金银质量比为1:1的合金，厚度IOOnm左右。
[0013](4)将制备的电极浸入至巯基乙酸溶液当中，通过化学反应巯基乙酸会固载至电极表面，反应结束后清洗电极；在电极上滴加CRP抗体溶液，反应结束后清洗电极；用BSA溶液封闭电极，反应结束清洗电极；将电极浸入至CRP溶液中，反应结束后清洗电极；将步骤(a)中产物滴加在电极表面，反应结束后在电极表面得到双抗体夹心免疫复合物。
[0014]所述的方法，其所述的接在电极表面的目标检测物具有同时具有巯基的羧酸或者具有巯基的酯类化合物，本方法采用巯基乙酸为例。
[0015]所述的方法，其所述的巯基乙酸中的活性基团巯基的作用与电极表面作用形成化学键，巯基乙酸固载至电极表面之后会影响电流值，据此实现对目标检测物的检测。
[0016]所述的方法，其所述的CRP抗体、CRP、HRP标记CRP抗体修饰纳米金粒子对电极层层修饰，形成的复合结构会影响电流值，据此实现对目标检测物的检测。
[0017]所述的方法，其所述的结合在CRP抗体的HRP催化H2O2氧化0PD，其氧化产物在BR缓冲溶液中还原的方式得到电化学峰电流与CRP的浓度成线性关系，而目标检测物与CRP成等量关系，据此实现对目标检测物的检测。
[0018](5)将经修饰之后的电极浸入至OPD和H2O2的混合溶液当中，反应结束后在BR缓冲溶液用电化学工作站测定DPV曲线。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]附图1为发明设计过程原理图。1、制备纳米多孔金电极；2、巯基乙酸固定在电极表面；3、抗体与巯基乙酸结合固定在电极表面；4、利用封板剂封闭金电极表面未参加反应的活性基团；5、抗原与抗体结合固定在电极表面；6、标记的过的结合在金纳米粒子上的抗体与抗原结合固定在电极表面；7、电化学检测。
[0020]附图2为电极不同修饰阶段峰电流的变化。a、空白电极；b、电极-巯基乙酸；C、电极-巯基乙酸-抗体；d、电极-巯基乙酸-抗体-抗原；e、电极-巯基乙酸-抗体-抗原-抗体。
[0021]附图3为不同浓度检测物最终的检测结果。
[0022]附图4为依据检测结果得到的线性工作曲线。线性回归方程为Δ ip=0.04064+5.37562CT (ng/mL) (R=0.99976)，使用 3 σ 法得到的检测限为 0.00685ng/mL
【具体实施方式】
[0023]以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
[0024]实施例1
[0025]纳米多孔金片电极电化学免疫传感器检测巯基乙酸(见图1)
[0026]一、金纳米粒子-抗体(标记)复合物的制备。
[0027](I)金纳米粒子的制备
[0028]纳米金粒子的合成是通过柠檬酸三钠还原四氯金酸制备而成。具体制备方法如下:首先配制0.01%的三水合氯化金溶液和1%的柠檬酸三钠溶液，并用0.22 μ m的多孔滤膜分别过滤除去杂质。取过滤后的5mL0.2%撤11(:14至2501^容量瓶，加二次水稀释至IOOmL,搅拌加热至沸，然后快速加入2.5mLl%柠檬酸三钠。反应十五分钟后停止加热，继续搅拌溶液冷却至室温。将制备好的金胶溶液保存于4°C备用。
[0029](2)金纳米粒子-抗体(标记)复合物的制备。
[0030]首先，用0.1MNaOH溶液将金胶溶液的pH调节至9.0左右，然后向500 μ LpH9.0的金胶溶液中直接加入20 μ LHRP标记CRP抗体，室温搅拌反应15分钟。反应完毕后，将溶液在10000转每分的转速下离 心20分钟并使用PBS缓冲溶液(ρΗ7.4)离心清洗两次。清洗后得到的纳米金粒子CRP抗体结合物分散到100 μ LPBS缓冲溶液中(ρΗ7.4)，储存在4°C备用。
[0031]二、纳米多孔金片电极的制备
[0032]首先，将9-carat 白金片(Au/Ag, 5050:, wt%,厚 IOOnm)在 I:1 的硝酸中浸泡 Ih,在三次水中浸泡掉可能干扰电化学分析的N03_和Ag+。玻碳电极依次使用1.0 μ m、0.3 μ m和0.05 μ m的a -Al2O3抛光粉抛光，依次用乙醇和二次蒸馏水超声清洗，再用蒸馏水冲洗。最后通过物理吸附作用将纳米多孔金片结合到玻碳电极表面，红外灯照射Ih后，纳米多孔金片就被修饰到玻碳电极上。
[0033]三、电极的层层修饰
[0034]首先，使用二次水和PBS仔细清洗纳米多孔金片电极后，将电极浸入到4mM巯基乙酸溶液中反应2小时，反应完毕用丙酮完全冲洗掉物理吸附的巯基乙酸。第二步，再在电极表面滴加10 μ L50 μ g/mL的CRP抗体，室温反应过夜，反应完毕用PBS缓冲溶液仔细洗掉未结合的抗体。第三步，将上步电极浸泡在500 μ L3%BSA溶液中反应3小时封闭电极，反应结束后用PBS缓冲溶液清洗电极。第四步，将上步电极浸泡在500 μ L不同浓度的CRP溶液中37 °C恒温孵育60分钟，反应结束后用PBS缓冲溶液清洗电极。最后，在电极表面滴加HRP标记的CRP抗体反应60分钟(对照)或者HRP标记CRP抗体修饰的纳米金粒子反应90分钟，双抗体夹心式免疫复合物形成。
[0035]四、电化学检测
[0036]在IOmL的比色管中依次加入lmL5.0 X KT2MOPD溶液，2mL4.0 X KT3MH2O2溶液，2mL0.1MHAc-NaAc缓冲溶液(pH4.8 )，4mL甲醇，用二次水稀释至刻度混匀。将修饰了双抗体夹心式免疫复合物的电极浸入到300 μ L上述底液，在37°C恒温催化OPD和H2O2反应。反应I小时后，在反应池中加入ImL0.2MBR缓冲溶液(pH7.0)。通氮除氧后，在-1.2到0.2V的电位范围内测定DPV曲线，振幅为25mV，电位增量为12mV，脉冲频率为5Hz。
【权利要求】
1.基于纳米多孔金片电极的电化学免疫传感器对巯基乙酸的检测的方法。步骤包括: (a)HRP标记CRP抗体修饰纳米金粒子的制备:首先制备还原性金纳米粒子，然后将所制备的金纳米粒子溶液调节至碱性，直接将经HRP标记CRP抗体溶液加入至金纳米粒子溶液中，反应结束后将产品离心分离并用PBS缓冲溶液清洗； (b)制备纳米多孔金片电极:将白金片在硝酸溶液中浸泡，然后用三次水除去可能会影响检测结果的杂质离子，使用抛光粉抛光玻碳电极后将其用蒸馏水洗净，最后通过物理吸附作用且经红外灯照射后，纳米多孔金片就被修饰到玻碳电极上； (C)将步骤(b)中制备的电极浸入至巯基乙酸溶液当中，通过化学反应巯基乙酸会固载至电极表面，反应结束后清洗电极，在电极上滴加CRP抗体溶液，反应结束后清洗电极，用BSA溶液封闭电极，反应结束清洗电极，将电极浸入至CRP溶液中，反应结束后清洗电极，将步骤(a)中产物滴加在电极表面，反应结束后在电极表面得到双抗体夹心免疫复合物； Cd)将步骤(c)中电极浸入至OPD和H2O2的混合溶液当中，反应结束后在BR缓冲溶液用电化学工作站测定DPV曲线。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(a)中还原性金纳米粒子的制备还原剂可采用柠檬酸三钠等。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(a)中金纳米粒子溶液为碱性，pH=9.0，调节剂可采用NaOH溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(b)中所采用的白金片为金银质量比为1:1的合金，厚度IOOnm左右。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(c)中所接在电极表面的目标检测物具有同时具有巯基的羧酸或者具有巯基的酯类化合物，本方法采用巯基乙酸为例。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:利用步骤(c)中巯基乙酸中的活性基团巯基的作用与电极表面作用形成化学键，巯基乙酸固载至电极表面之后会影响电流值，据此实现对目标检测物的检测。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:利用步骤(c)中利用CRP抗体、CRP、HRP标记CRP抗体修饰纳米金粒子对电极层层修饰,形成的复合结构会影响电流值,据此实现对目标检测物的检测。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:利用步骤(c)中利用结合在CRP抗体的HRP催化H2O2氧化0PD，其氧化产物在BR缓冲溶液中还原的方式得到电化学峰电流与CRP的浓度成线性关系，而目标检测物与CRP成等量关系，据此实现对目标检测物的检测。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:工作电极为纳米多孔金片电极。
【文档编号】G01N33/551GK103698509SQ201410008134
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2014年1月8日 优先权日:2014年1月8日
【发明者】丁彩凤, 张伟, 宋维岭, 张书圣 申请人:青岛科技大学