非常小的胚胎样(vsel)干细胞及分离和利用其的方法
【专利摘要】本发明涉及非常小的胚胎样(VSEL)干细胞及分离和利用其的方法。当前披露的主题提供了从骨髓、外周血、和／或其它来源纯化的干细胞群。还提供了将所述干细胞用于治疗受试者中的组织和／或器官损伤的方法。
【专利说明】非常小的胚胎样(VSEL)干细胞及分离和利用其的方法
[0001] 本申请是国际申请日为2006年11月2日的国际申请PCT / US2006 / 042780进入中国、申请号为200680052508.X的题为“非常小的胚胎样(VSE L)干细胞及分离和利用其的方法”的发明专利申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003]这个申请要求于2005年12月8日提交的美国临时专利申请系列N0.60 / 748, 685的权益；其披露的全部内容以引用方式结合于此。
【技术领域】
[0004]当前披露的主题总体上涉及从骨髓、脐带血、和/或其它来源分离的干细胞群并且在本文中被称为非常小的胚胎样(very small embryonic-like) (VSEL)干细胞的鉴定、分离及应用。更具体地，当前披露的主题涉及分离所述VSEL干细胞并且(可选地在体外处理后)将其用于治疗需要其的受试者中的组织和/或器官损伤。
【背景技术】
[0005]干细胞和干细胞衍生物的应用已经在医药研究中，尤其在提供用于治疗由于遗传缺陷、创伤、和/或疾病过程的任何一个造成的组织损伤的试剂领域中获得提高的兴趣。理想地，能够分化为受影响的细胞类型的细胞可以被移植入需要其的受试者中，其中它们将与器官微环境相互作用并供应必须的细胞类型以修复损伤。
[0006]已经付出了相当多的努力以从大量不同的组织中分离干细胞用在再生医药中。例如，给予Tsukamoto et al.的美国专利N0.5, 750, 397披露了据报道能够分化为淋巴系、红(erythroid)系、和粒单(myelomonocytic)系的人类造血干细胞的分离和生长。给予Bruder et al.的美国专利N0.5，736，396披露了用于在合适的生长和/或分化因子的影响下分离的人类间充质干细胞的谱系(lineage)-引导的分化的方法。随后可以将所述得到的细胞引入宿主用于间充质组织再生或修复。
[0007]强烈感兴趣的一个领域涉及胚胎干(ES)细胞的应用，其已经在小鼠中显示具有分化为动物的所有不同的细胞类型的潜能。小鼠ES细胞源自胚泡期的早期小鼠胚胎的内细胞群的细胞，并且其它多能和/或全能细胞已经从胚(germinal)组织(如原始生殖细胞；PGC)分离。这些多能和/或全能干细胞以未分化状态在体外增殖、保持正常核型、以及保持分化为全部的三个胚层(内胚层、中胚层及外胚层)的衍生物的潜能的能力使得这些细胞作为细胞的潜在来源用在出生后受试者的再生治疗中是有吸引力的。
[0008]人类ES(hES)细胞的开发还不及对小鼠ES细胞进行的进展成功。Thomson etal.报道了来自低等灵长类(美国专利 N0.5，843，780 !Thomson et al.(1995)92Proc NatlAcad Sci USA7844-7848)、以及来自人类(Thomson et al.(1998) 282Sciencell45_1147)的多能干细胞。Gearhart et al.产生了来自胎儿性腺组织的人类胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott et al.(1998)95Proc Natl Acad Sci USA13726-13731 ;及美国专利N0.6，090, 622)。hES和hEG细胞均具有多能干细胞的理想特征，在于它们能够在体外增殖而不分化，它们通常维持正常的核型，并且它们仍然能够分化为多种不同的细胞类型。无性(clonally)来源的人类胚胎干细胞系在培养中长期维持多能性和增殖潜能(Amit etal.(2000)227Dev Biol271_278)。
[0009]ES细胞或其它多能细胞用于受试者中再生治疗的一个重大挑战是控制细胞生长和分化为受试者治疗所需的特定细胞类型。已有许多生长因子对ES细胞分化的影响的报道。例如，Schuldiner et al.报道了八种生长因子对细胞从hES细胞分化为不同细胞类型的影响(参见 Schuldiner et al.(2000)97Proc Natl Acad Sci U SA11307-11312)。如其中所披露的，在开始通过胚状体样(embryoid body-like)形成的分化后,在bFGF、TGFβ 1、Activin-A、BMP-4、HGF、EGF、β NGF、或视黄酸的存在下培养细胞。每种生长因子对分化途径具有独特的影响，但是没有生长因子排他地指导分化为一种细胞类型。
[0010]理想地，能够从受试者分离和纯化干细胞和/或前体细胞是有益的，所述细胞能够在被再引入受试者用于治疗目的之前被纯化和/或体外处理。受试者的自身细胞的应用将消除采用辅助免疫抑制治疗的需要，由此维持受试者免疫系统的能力。然而，用于分离ES细胞系，尤其是hES细胞系的目前的策略排除了从受试者分离细胞并将它们再引入相同的受试者。
[0011]因此，对于来自成年动物的其它干细胞类型的研究继续。例如，间充质干细胞(MSC)是一种这样的细胞类型。已经显示MSC具有分化为包括骨(Haynesworthet al.(1992) 13Bone81_88)、软骨(Mackay et al.(1998) 4TissueEng415_28 ;Yoo etal.(1998) 80JBone Joint Surg Aml745_57)、脂肪组织(Pittenger etal.(2000) 25ICurrTop MicrobioIImmuno13-11) (Young et al.(1998) 16J Orthop Res406_13)、肌肉及间质(Cap I an et al.(2001) 7Trends Mol Med259_64)的多个谱系的潜能。 [0012]另一细胞群，多能成年祖细胞(MAPC)也已经从骨髓纯化(BM ；Reyes etal.(2001)98Blood2615-2625 ；Reyes&Verfaillie(2001)938Ann NY Acad Sci231_235)。这些细胞已经显示能够在体外扩展为超过100群倍增(lOOpopulation doubling)而没有端粒缩短或核型异常的发展。已经显示MAPC在限定的培养条件下能够分化为各种间充质细胞类型(如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞及骨骼成肌细胞)、内皮、神经外胚层细胞、以及更最近的，分化为肝细胞(Schwartz et al.(2000) 109J Clin Investl291_1302)。
[0013]此外，已报道造血干细胞(HSC)能够分化为多种细胞类型。已报道BM造血干细胞能够“转分化(transdifferentiate) ”为表达早期心(Orlic etal.(2003)7Pediatr Transplant86-88 ；Makino et al.(1999)103J Clin Invest697_705)、骨骼肌(Labarge&Blau(2002)lllCell589-601 ;Corti et al.(2002)277Exp CellRes74_85)、神经(Sanchez-Ramos(2002)69Neurosci Res880_893)、肝(Petersenet al.(1999)284Sciencell68-1170)、或胰腺细胞(lanus et al.(2003)IllJClinInvest843-850 ；Lee&Stoffel (2003) IllJ Clin Invest799_801)标记物的细胞。在人类体内实验中还表明CD34+外周血(PB)干细胞的移植导致供体-来源的肝细胞(Korblinget al.(2002) 346N Engl J Med738_746)、上皮细胞(Korbling et al.(2002) 346N EnglJ Med738-746)、和神经元(Hao et al.(2003) 12J Hematother Stem Cell Res23_32)的出现。此外，已显示人类BM-来源的细胞有助于梗塞的心肌的再生(Stamm etal.(2003)361Lancet45_46)。[0014]这些报道已经被解释为成年干细胞的转分化或可塑性现象存在的证据。然而，成年组织特异性干细胞的转分化的概念目前在科学和医药界内是广泛争议的主题(参见，如，Lemischka (2002)30Exp Hematol848-852 ；Holden&Vogel(2002)296Science2126-2129)。试图再生的研究结果表明借助神经干细胞的转分化是不成功的(Castroet al.(2002)297Sciencel299) ?还显示肌肉组织中发现的造血干/祖细胞(HSPC)起源于 BM(Mckinney-Freeman et al.(2002)99Proc Natl Acad Sci USA1341-1346 ;Geigeret al.100Blood721-723 ;Kawada&0gawa(2001)98Blood2008-2013)。此外，借助涉及单独的HPC移植入致命照射的小鼠的嵌合动物的研究表明循环HPSC和/或它们的子代的转分化和/或可塑性，如果它完全存在，是极稀有的事件(Wagers etal.(2002)297Science2256-2259)。
[0015] 因此，持续存在产生适于多种应用(包括但不限于治疗多个器官和/或组织的损伤和/或疾病)的可移植细胞群的新方法的需要。
【发明内容】
[0016]这个总结列出了当前披露的主题的几个实施方式，并且在许多情况下列出了这些实施方式的变体和改变。这个总结仅是许多和改变的实施方式的示例。提及的给定实施方式的一个或更多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施方式通常可以伴随或不伴随提及的特征而存在；同样地，那些特征可以应用到当前披露的主题的其它实施方式，不管在这个，总结中是否列出。为了避免过多重复，这个总结没有列出或建议这样的特征的所有可能组合。
[0017]当前披露的主题提供了用于从非常小的胚胎样(VSEL)干细胞或其衍生物的群体形成胚状体样球体(embryoid body-like sphere)的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干细胞或其衍生物的⑶45_细胞群；以及(b)在包含诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个因子的培养基中培养VSEL干细胞或其衍生物达足以使胚状体样球体形成的时间。在一些实施方式中，VSEL干细胞或其衍生物包含CD34+ / IirT / CD45-或Sca-1* / IirT / CD45—非常小的胚胎样(VSEL)干细胞。在一些实施方式中，VSEL干细胞的直径约为3-4 μ m，表达SSEA-1、Oct-4, Rev_l、和Nanog的至少一种，具有由细胞质的窄缘围绕的大细胞核，并且具有开放型染色质(常染色质)。在一些实施方式中，包含VSEL干细胞或其衍生物的⑶45_细胞群从人或从小鼠分离。在一些实施方式中，包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45-细胞群从人或小鼠中选自由骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合的组的来源分离。在一些实施方式中，诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个生长因子包括表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子-2及其组合。在一些实施方式中，通过将VSEL干细胞或其衍生物与C2C12细胞共培养将一个或更多个因子提供给VSEL干细胞或其衍生物。
[0018]在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括通过下述方法分离包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45_细胞群，所述方法包括下述步骤:(a)提供怀疑包含CD45_干细胞的初始细胞群；(b)在足以允许每个抗体与在初始细胞群的每个细胞上的它的靶标(如果存在)结合的条件下将所述细胞群与对于CD45特异的第一抗体和对于CD34或Sca-1特异的第二抗体接触；(c)选择为⑶34+或Sca-1*、并且⑶45_的细胞的第一亚群；⑷在足以允许每个抗体与在细胞群的每个细胞上的它的靶标(如果存在)结合的条件下将所述细胞的第一亚群与对于一个或更多个细胞表面标记物特异的一个或更多个抗体接触，所述标记物选自由 CD45R / B220、Gr-UTCRa β , TCR y δ、CDllb 及 Ter-119 组成的组；(e)从所述细胞的第一亚群去除结合到步骤(d)的抗体的至少一个的那些细胞；以及(f)收集为CD34+ /IirT / CD45—或Sca-y / IirT / CD45_的细胞的第二亚群，由此分离⑶45_干细胞的亚群。在一些实施方式中，每个抗体包括可检测的标记。在一些实施方式中，所述可检测的标记包括荧光标记或者可以通过包含荧光标记的试剂被检测的部分。在一些实施方式中，所述分离包括FACS分类。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分离为c-met+、c-kit+、和/或LIF-R+的那些细胞。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分离表达选自由SSEA-1、Oct-4、Rex-1及Nanog组成的组的一个或更多个基因的那些细胞。在一些实施方式中，细胞群包括骨髓样品、脐带血样品、或外周血样品。
[0019]在当前披露的主题的一些实施方式中，在用足以将包含VSEL干细胞的⑶45_干细胞从骨髓移动到受试者的外周血的量的移动剂处理受试者后，所述细胞群从受试者的外周血分离。在一些实施方式中，所述移动剂包括粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4拮抗剂的至少一种。在一些实施方式中，CXCR4拮抗剂是T140肽。在一些实施方式中，所述受试者是小鼠。
[0020]在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括将干细胞的亚群与结合到CXCR4的抗体接触以及从干细胞的亚群分离为CXCR4+的那些细胞。
[0021]在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分离为CXCR4+和/或AC133+的那些细胞。
[0022]在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括选择为HLA_DR_、MHCI类_、⑶90_、⑶29'⑶105-、或其组合 的那些细胞。
[0023]当前披露的主题还提供了包含多个非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的胚状体样球体。
[0024]当前披露的主题还提供了包含本文披露的胚状体样球体的细胞培养物。在一些实施方式中，本文披露的胚状体样球体在包含诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个因子的培养基中提供。
[0025]当前披露的主题还提供了用于将非常小的胚胎样(VSEL)干细胞分化为感兴趣的细胞类型的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体；以及(b)在包含分化诱导量的一个或更多个因子的培养基中培养胚状体样球体直到培养基中出现感兴趣的细胞类型，所述因子诱导VSEL干细胞或其衍生物分化为感兴趣的细胞类型。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型是神经元细胞或其衍生物。在一些实施方式中，神经元细胞或其衍生物选自由少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经胶质细胞及神经元组成的组。在一些实施方式中，所述神经元细胞或其衍生物表达选自由GFAP、巢蛋白、β III微管蛋白、01 igl及01 ig2组成的组的标记物。在一些实施方式中，所述培养持续至少约10天。在一些实施方式中，所述培养基包括约IOng / ml rhEGF、约20ng /ml FGF-2及约20ng / ml NGF。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为内胚层细胞或其衍生物。在一些实施方式中，所述培养包括在包含Activin A的第一培养基中培养胚状体样球体；以及其后在包含N2补充物-A (N2supplement-A)、B27补充物(B27supplement)及约IOmM烟酰胺(nicotinamide)的第二培养基中培养胚状体样球体。在一些实施方式中，在第一培养基中的培养持续约48小时。在一些实施方式中，在第二培养基中的培养持续至少约12天。在一些实施方式中，内胚层细胞或其衍生物表达选自由Nkx6.1、Pdxl及C-肽组成的组的标记物。在一些实施方式中，感兴趣的细胞类型为心肌细胞或其衍生物。在一些实施方式中，所述培养持续至少约15天。在一些实施方式中，所述培养基包括碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子及转化生长因子β I的组合，数量足以造成胚状体样球体细胞的亚组分化为心肌细胞。在一些实施方式中，所述心肌细胞或其衍生物表达选自由Nsx2.5 / Csx和GATA-4组成的组的标记物。
[0026]在当前披露的方法的一些实施方式中，所述胚状体样球体通过下述制备:(a)提供包含VSEL干细胞的⑶45_细胞群；以及(b)在包含一个或更多个诱导VSEL细胞的胚状体样球体形成的因子的培养基中培养VSEL干细胞达到足以使胚状体样球体出现的时间。
[0027]当前披露的主题还提供了包含在药学上可接受的载体或赋形剂中的本文披露的分化的非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的制剂。在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体或赋形剂用于人类中是可接受的。
[0028]当前披露的主题还提供了用于治疗受试者中组织损伤的方法。在一些实施方式中，所述方法包括给予受试者包括在药学上可接受的载体中包含VSEL干细胞的多个分离的⑶45_干细胞的组合物，数量和经由的途径足以允许⑶45_干细胞群的至少一部分结合(engraft)所述组织并且在其中分化，由此治疗损伤。在一些实施方式中，所述损伤选自由缺血性损伤、心肌梗塞及中风组成的组。在一些实施方式中，受试者为哺乳动物。在一些实施方式中，所述哺乳动物选自由人类和小鼠组成的组。在一些实施方式中，包含VSEL干细胞的分离的CD45_干细胞从选自由骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合组成的组的来源分离。
[0029]在一些实施方式 中，当前披露的方法进一步包括分化分离的⑶45-干细胞以在给予受试者所述组合物之前产生预定的细胞类型。在一些实施方式中，所述预定细胞类型选自由神经细胞、内胚层细胞、心肌细胞及其衍生物组成的组。
[0030]当前披露的主题还提供了用于产生嵌合动物的方法。在一些实施方式中，所述方法包括将一个或更多个包含VSEL干细胞的CD45_干细胞群添加到胚胎，以便一个或更多个CD45—干细胞发育为胚胎的一个或更多个细胞类型。在一些实施方式中，所述添加包括将一个或更多个CD45—干细胞注射入胚泡期胚胎的囊胚腔。在一些实施方式中，所述添加包括聚集包含VSEL干细胞的一个或更多个⑶45_干细胞与桑葚胚期胚胎。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括在加入一个或更多个包含VSEL干细胞的CD45_干细胞后孕育胚胎至少直到出生，以提供嵌合动物。
[0031]当前披露的主题还提供了用于从⑶45_干细胞群纯化非常小的胚胎样(VSEL)干细胞用于感兴趣的细胞类型的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干细胞的CD45_干细胞群；(b)鉴定表达VSEL干细胞的标记物的0045_干细胞的亚群；以及(c)纯化所述亚群。在一些实施方式中，所述群和所述亚群除了为⑶45_，均为⑶34+ /CXCR4+ / IirT或Sca-1 / lin—。在一些实施方式中，包含VSEL干细胞的⑶45—干细胞群从选自由骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合组成的组的来源分离。在一些实施方式中，感兴趣的细胞类型选自由骨骼肌细胞、肠上皮细胞、胰腺细胞、内皮细胞、表皮细胞、黑色素细胞、神经元细胞、心肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、胰腺细胞、内皮细胞、上皮细胞、视网膜色素细胞及内胚层细胞组成的组。在一些实施方式中，所述标记物选自由GFAP、巢蛋白、β III 微管蛋白、Oligl、01ig2、Myf5、MyoD、成肌蛋白(myogenin)、Nsx2.5 / Csx> GATA-4>甲胎蛋白(a-fetoprotein)、CK19、Nkx2_3、Tcf4、Nkx6.1、Pdxl、VE-钙粘蛋白、Krt2_5、Krt2-6a、BNC, DCT、TYR及TRP组成的组。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为心肌细胞，所述标记物选自由Nkx2.5 / Csx, GATA-4、MEF2C组成的组。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为内皮细胞，所述标记物选自由VEGFR2、VE-钙粘蛋白、血管性血友病因子(yon Willebrand factor)及TIE2组成的组。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为骨骼肌细胞，所述标记物选自由Myf5、MyoD及成肌蛋白组成的组。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为肝细胞，所述标记物选自由甲胎蛋白和CK19组成的组。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为神经细胞，所述标记物选自由β III微管蛋白、01igl、01ig2、GFAP及巢蛋白组成的组。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为胰腺细胞，所述标记物选自由Nkx6.1和Pdxl组成的组。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为黑色素细胞，所述标记物选自由DCT、TYR及TRP组成的组。
[0032]当前披露的主题还提供了用于鉴定胚状体样球体形成的诱导剂的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)从已知包含诱导剂的细胞制备包含多个cDNA克隆的cDNA文库；(b)用cDNA文库转化不包含诱导剂的多个细胞；(c)在足以造成VSEL干细胞或其衍生物形成胚状体样球体的条件下，在转化的多个细胞存在下，培养多个VSEL干细胞或其衍生物；(d)分离包含诱导剂的转化 的细胞；(e)从转化的细胞回收cDNA克隆；以及(f)鉴定由回收的cDNA克隆编码的多肽，由此鉴定胚状体样球体形成的诱导剂。在一些实施方式中，已知包括诱导剂的细胞为C2C12细胞。在一些实施方式中，多个cDNA克隆包括位于克隆载体(cDNA克隆被插入其中)中cDNA克隆位点的至少一侧的侧翼的至少一个引物结合位点。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括利用杂交到位于cDNA克隆位点的两侧的侧翼的引物位点的引物扩增转化的细胞中存在的cDNA克隆。在一些实施方式中，所述鉴定是通过对cDNA克隆测序。
[0033]当前披露的主题还提供了用于从脐带血或其部分分离包含VSEL干细胞的〇045_干细胞的亚群的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)在足以允许每个抗体与细胞群的每个细胞上的它的靶标(如果存在)结合的条件下，将脐带血或其部分与对于⑶45特异的第一抗体和对于⑶34或Sca-1特异的第二抗体接触；(b)选择为⑶34+或Sca-I~、并且为CD45_的细胞的第一亚群；(c)在足以允许每个抗体与细胞群的每个细胞上的它的靶标(如果存在)结合的条件下，将细胞的第一亚群与对于选自由CD45R/B220、Gr-1、TCRa β、TCR Y δ、⑶IIb及Ter-119组成的组的一个或更多个细胞表面标记物特异的一个或更多个抗体接触；(d)从细胞的第一亚群去除结合到步骤(d)的抗体的至少一个的那些细胞；以及(e)收集为CD34+ / lin_ / CD45_或Sca- / lin_/CD45_的细胞的第二亚群，由此分离包含VSEL干细胞的⑶45_干细胞的亚群。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括在低张溶液中孵育脐带血或其部分或任何亚群达到足以基本上裂解可能存在的所有红细胞(erythocyte)的时间。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分离对于CXCR4、c-met、c_kit、或LIF-R的至少一个为阳性的那些细胞。
[0034]因此，当前披露的主题的一个目的是提供新的干细胞群，以及制备和应用其的方法。这个目的和其它目的全部或部分通过当前披露的主题实现。[0035]当前披露的主题的一个目的已经在上面陈述，其他目的将随着结合下述实施例和附图的说明的继续而变得显而易见。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1A 和 IB 描绘了 Sca-1+ / IirT / CD45-和 Sca-1+ / IirT / CD45+细胞的透射电子显微镜(TEM)图像。
[0037]图1A显示Sca-1‘ / lin_ / CD45_细胞较小并且测量的直径为3_4 μ m。它们具有由细胞质的窄缘围绕的较大细胞核。在超微水平上，细胞质的窄缘具有一些线粒体、分散的核糖体、内质网的小轮廓、以及一些囊泡。细胞核被包含在具有核孔的核膜内。染色质松散的包装(packed)并由常染色质构成。图1B显示与之相反，Sca-1’ / IirT /⑶45+细胞表现为异源形态并且较大。它们的平均测量直径为8-10 μ m,并具有分散的染色质和突出的核仁。
[0038]图2描绘了荧光显微图像，描绘了对Sca-1’ / IirT /⑶45_细胞的表达研究的结果并表明Sca-1‘ / IirT / CD45_细胞是SSEA-1‘并表达0ct_4和Nanog。如左侧所示，通过FACS分离的Sca-1’ / lin_ / 0)45_细胞被评估SSEA-1、0ct_4及Nanog的表达。所有的图像在Plan Apo60XA / 1.40油性物镜(Nikon，Japan)下采集。右侧示出了在 ADOBE?PHOTOSHOP?1 CS 软件(Adobe System Incorporated, San Jose,California, United States of America)中进行的代表性细胞(箭头)的IOx放大的图像。阴性染色对照未示出。对从四个独立类别分离的细胞进行染色。示出了代表性数据。
[0039]图3A-3C 描绘了对 Sca-1+ / lin_ / CD45-的 CXCR4、c_met 和 LIF-R 的表达研究的结果。
[0040]图3A描绘了RT-PCR产物在其上分离并用溴化乙锭染色的凝胶的图像，并描绘了Sca-1+ / lin_ / CD45-中对于 CXCR4 (泳道(lane) I)、c_Met (泳道 3)和 LIF-R (泳道 5)的mRNA的表达结果。RT-PCR进行30个循环。阴性RT-PCR反应(DNA代替cDNA:泳道2、4和6)。示出了来自三个独立的类别的代表性结果。图3B描绘了通过FACS分离并通过免疫组织化学染色评估CXCR4、c-Met和LIF-R的表达的Sca-1’ / IirT / CD45—细胞的荧光显微图像(在Plan Apo60XA / 1.40油性物镜(Nikon，Japan)下采集图像)。未示出阴性染色对照。示出了来自四个独立的实验的代表性结果。图3C是描绘了通过包含SDF-1或不包含SDF-1 (阴性对照)的MATRIGEL?滴状物的Sca-r/lin— / CD45—细胞的化学引诱研究结果。示出了每IOOym的MATRIGEL?滴状物周长的化学引诱的Sca-1‘ / lin_ /⑶45_细胞的数量。从三个独立的实验收集数据。*与对照MATRIGEL?相比ρ〈0.00001。
[0041]图4Α和4Β描绘了 FACS分类从不同年龄的动物分离的Sca-1’ / IirT / CD45—细胞的结果。
[0042]图4Α是从源自3周大(上侧)和I岁大的小鼠(下侧)的BMMNC分类的细胞的FACS点图。左侧描绘了鼠BMMNC的点图。作为Sca-1‘ / I in_ (中侧)的来自淋巴门(lymphoid gate)的细胞通过对于⑶45表达的FACS进行分类(右侧)。进行三个独立的分类实验(对于每类8只小鼠的BM被收集)。示出了代表性类别。图4B是条形图，描绘了在通过FACS分离来自3周大和I岁大的小鼠的Sca-1‘ / lin_ / CD45_细胞中PSC和VSEL干细胞标记物的mRNA的表达，并通过相同数量的分类细胞之间的RQ-PCR进行比较。进行四个独立的分类实验(对于每类收集8只小鼠的BM)。数据是平均数土SD。*p〈0.01vS.来自年老动物的细胞。
[0043]图5是条形图，描绘了来自具有相对长的生命期的小鼠品系(C57BL / 6)的细胞数量与具有相对短的生命期的小鼠品系(DBA / 2J)的细胞数量的比较结果。所述图示出了与C57BL / 6小鼠相比，DBA/2J小鼠中Sca-1+ / IirT / CD45_细胞的数量减少。通过相同数量的分类细胞之间的RQ-PCR比较通过FACS从三周大DBA/2J和C57BL / 6小鼠分离的Sca-1+ / IirT /⑶45-细胞中PSC和VSEL干细胞标记物的mRNA的表达。进行三个独立的分类实验(对于每类6只小鼠的BM被收集)。数据是平均数土SD。*p〈0.01vS.来自年老DBA / 2J小鼠的细胞。
[0044]图6A和6B描绘了骨髓单核细胞(BMMNC)的侧群(SP)的分类。
[0045]图6A是描绘BMMNC的SP的FACS分类的点图。图6B是条形图，描绘了通过FACS从 3 周大的小鼠分离的 BMMNC、SP、SP Sca-1+ / IirT / CD45'SP Sca-1+ / IirT / CD45+、Sca-1+ / IirT / CD45-和 Sca-1+ / IirT / CD45+细胞中的 PSC 和 VSEL 干细胞标记物的mRNA的表达，并通过相同数量的分类细胞之间的RQ-PCR进行比较。进行三个独立的分类实验(对于每类，8只小鼠的BM被收集)。数据以平均数土SD表示。*p〈0.01vS.来自年老动物的细胞。[0046]图7是四个点图，描绘了细胞的多个亚群的移植结果和这些细胞对长期血细胞生成的贡献。Sca-1+ / IirT /⑶45_细胞不会有助于长期血细胞生成。Ly5.2小鼠被移植以来自 Ly5.1 小鼠的 IO4 个 Sca-1+ / lin_ / CD45+或 2 X IO4 个 Sca-1+ / lin_ / CD45-细胞，并且与IO6个BMMNC Ly5.2细胞一起移植入Ly5.2受体小鼠，在移植后8个月通过FACS评估Ly5.1细胞的存在。上侧描绘了来自外周血的MNC的分析。下侧描绘了来自骨髓的MNC的分析。示出了代表性结果。
[0047]图8A和8B描绘了荧光显微图像，描绘了具有对于SSEA-1 (图8A;4个图板)或0ct-4(图8B)特异的抗体的Sca-1+ / lin_ / CD45_BM细胞的ES样球体的染色。
[0048]图9A和9B描绘了在C2C12细胞上的GFP+Sca-1+ / IirT / αΜδ?Μ细胞的胚状体样球体的形成。
[0049]图9Α描绘了在实施例20所述的条件下，共培养Sca-1+ / IirT /⑶45—ΒΜ细胞与C2C12细胞后胚状体(EB)-样球体的显微图像。图9Β是描绘Sca-1+ / IirT /⑶45—细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达的荧光显微图像，表明这些胚状体源自从绿色免疫荧光阳性(GFP+)小鼠(购自 The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, United States ofAmeric 的 C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP) IOsb / J 小鼠)分离的纯化 Sca-1+ / IirT / CD45—BM细胞，并且不是C2C12细胞。
[0050]图10是从鼠淋巴结分离的碘化丙唳(propidium iodide)染色的细胞、HSC(造血干细胞；Sca-l+/lin7CD45+)或 VSEL 干细胞(Sca-l./lirT / CD450 的一系列点图。
[0051]图1IA-1IG是鼠骨髓细胞的FACS分析的系列点图。
[0052]图1lA是低张裂解后鼠骨髓MNC的点图。图1lB是示出了来自Rl门(Rlgate)用于谱系标记物表达和CD45抗原的细胞的染色的点图。在这个图中，R2示出了谱系-和CD45阴性BM MNC。分析来自Rl和R2的细胞的Sca-1的表达和HLA_DR(参见图11C)、MHC I类(参见图11D)、CD29(参见图11E)、CD90(参见图11F)及⑶105 (参见图11G)抗原的共表达。
[0053]图12是来自VSEL干细胞衍生的球体(VSEL-DS)的碘化丙啶染色的细胞的系列点图。示出了三个独立的代表性实施例。
[0054]图13描绘了对从D3胚胎干细胞(ED-D3 ;顶侧)形成的胚状体和从VSEL干细胞(底侧)形成的胚状体样球体进行碱性(alpkaline)磷酸酶(AP)染色的图。
[0055]图14描绘了荧光显微图像，表明VSEL干细胞衍生的胚状体样球体表达早期胚胎发育标记物如 SSEA-1、GATA-6、GATA-4、FOXDl 及 Nanog。
[0056]图15描绘了在VSEL干细胞衍生的胚状体样球体中存在的细胞的透射电子显微镜图，表明这些细胞在尺寸上大于它们来源的初始VSEL干细胞(图15，上侧)，但仍具有非常原始的包含常染色质的细胞核。图15的中侧描绘了在用SDF-1、HGF / SF及LIF刺激从VSEL干细胞-衍生的胚状体样球体分离的细胞后MAPKp42 / 44的磷酸化研究结果，表明相应的受体(分别为SDF-1、HGF / SF及LIF)在这些细胞的表面表达。并且最后，图15的下侧描绘了从来自VSEL干细胞衍生的胚状体样球体的细胞的连续传代分离的细胞的RT-PCR分析结果，其揭示了调节胚状体的原肠胚形成的基因(如GATA-6、Cdx2、Sox2、HNF3及AFP)的mRNA的表达增加。
[0057]图16A-16C和图17A-17D描绘了荧光显微镜图像，描绘了 ES样球体分化为少突胶质细胞(图16A-16C)或神经元(图17A-17D)。细胞用针对巢蛋白的抗体染色，其利用Alexa Fluor594_标记的山羊抗-小鼠IgG第二抗体检测,其给予红色突光。用抗-绿色突光蛋白Alexa Fluor488结合物检测细胞中存在的GFP (绿色荧光)，并且细胞核用DAPI染色(蓝色荧光)。
[0058]图18A-18C描绘了荧光显微镜图像，描绘了 ES样球体分化为表达胰腺细胞的标记物(C-肽)的内胚层细胞。
[0059]图19A-19C和20A-20D描绘了荧光显微图像，描绘了 ES样球体分化为心肌细胞。这些细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)，表明心肌细胞源于由GFP+Sca-1+ / IirT /⑶45—BM细胞形成的胚状体。细胞用针对肌钙蛋白I或α横纹肌辅肌动蛋白的抗体染色(分别为图19和20)，其利用Alexa Fluor594-结合的第二抗体检测，其给予红色荧光。用抗-绿色荧光蛋白Alexa Fluor488结合物检测细胞中存在的GFP (绿色荧光)，细胞核用DAPI染色(蓝色荧光)。
[0060]图21A-21C描绘了对来自单VSEL干细胞衍生的球体的细胞进行RT-PCR的结果，其表明这些细胞可以分化为心肌细胞(中胚层；参见图21A)、神经细胞和少突胶质细胞(外胚层；参见图21B)及胰腺或肝细胞(内胚层；参见图21C)。
[0061]图22A-22I描绘了表明培养的细胞中心脏-特异性抗原的表达的免疫荧光和透射共聚焦显微镜照片。
[0062]图22A-22C 和 22D-22F 描绘了其中 Sca-1+ / IirT / CD45-BMMNC 被培养的培养板的图像。具有Sca-1+ / IirT /⑶45_细胞的板中的许多细胞对于心脏-特异的肌球蛋白重链是阳性的(图22B、22C、22E及22F;绿色荧光)。这些心脏-特异性肌球蛋白重链-阳性的细胞中的许多对于心脏肌钙蛋白I也是阳性的(图22D和22F[箭头];红色荧光)。图22G-22I是其中Sca-1+ / IirT /⑶45+细胞被培养的培养板的图像。这些细胞对于前述心脏-特异性抗原的表达基本上是阴性的(参见图22H)。通过DAPI染色鉴定图22A-22I中的每个的细胞核(蓝色荧光)。比例尺(Scale bar) =20 μ m。
[0063]图23描绘了 Sca- / lin_ /⑶45_细胞的FACS分类结果，表明能够被分类的这些细胞的产量随着供体动物的年龄而降低。
[0064]图24是描绘作为年龄的函数的小鼠骨髓中存在的VSEL干细胞(左侧)和HSC (右侦D的百分数的两幅图。
[0065]图25是两幅图，描绘了从较老的小鼠分离的VSEL干细胞形成胚状体样球体的能力下降(左侧)以及根据小鼠(细胞从其分离)的年龄的VSEL干细胞的培养物中CD45+细胞的百分数增加(右侧)。
[0066]图26为从5周大的小鼠(左侧)与2.5岁大的小鼠(右侧)分离的VSEL干细胞的不同表达模式。在左侧中，示出了免疫荧光和透射共聚焦显微镜图像，表明来自5周大的小鼠的培养的细胞中不同造血抗原的表达。在右侧中，示出了在从2.5岁大的小鼠分离的VSEL干细胞中，CD45被表达并且所述细胞能够在甲基纤维素培养基中的第二培养基中生长造血集落。
[0067]图27A-27B描绘了 人类脐带血的FACS分类结果。
[0068]图27A 示出了人类 CB 包含表达 CXCR4 (0.037+0.02%, n=9)、CD34 (0.118+0.028%,n=5)及 CD133(0.018+0.008%，n=5)的 IirT / CD45TMNC 群。图 27B 表明这些 CXCR4+ /CD133./ CD34./ IirT / CD45_细胞非常小(约3-5 μ m ;图27B，上侧)，而CB-来源的IirT / CD45+造血细胞较大(>6口111;图278，下侧)。
[0069]图28A-28C描绘了对来自人类脐带血的分类的细胞的基因表达研究结果。
[0070]图28A和28B是条形图，显示通过FACS分类的CB-来源的CXCR4+ / CD133+ /CD34./ IirT / CD45-细胞、以及 CXCR4+/lirT / CD45'CD34+ / IirT / CD45'以及 CD133+/lin_ /⑶45_ /细胞高度富集由多能胚胎细胞表达的转录因子如Oct-4和Nanog的mRNA。图28C示出了确认FACS分析的RT-PCR结果。
[0071]图29描绘了 CB-VSEL干细胞的免疫荧光染色结果，表明高度纯化的CB-来源的CXCR47lirT / CD45-细胞在它们的表面上表达SSEA-4并且在细胞核内表达Oct-4和Nanog转录因子。
[0072]图30描绘了三种不同的CB-VSEL干细胞的光学显微(photomicroscopic)图片，表明这些细胞非常小~3-5 μ m，并包含相对大的细胞核和具有许多线粒体的细胞质的窄缘。这些细胞的细胞核中的DNA包含作为多能胚胎干细胞的特征的开放型常染色质。
[0073]图31A-31C描绘了光学显微图片，表明来源于GFP+小鼠的VSEL干细胞-DS如果被平铺在补充有IL-3+GM-CSF的甲基纤维素培养基中可以形成小的第二球体(图31A和31B)。通过从初始甲基纤维素培养基的甲基纤维素溶解回收的这些第二球体制备的单细胞悬浮液，如果再次平铺在甲基纤维素培养基(图31B)或血浆凝块(图31C)中并由IL-3和GM-CSF刺激，形成造血集落。这些为造血集落的证据通过FACS分析来自甲基纤维素中生长的溶解集落的细胞的CD45表达或通过免疫荧光染色来自血浆凝块培养基中生长的集落的细胞的⑶45而获得。
[0074]图32是用于从人类脐带血分离VSEL干细胞的基于FACS的策略的略图。
[0075]序列表的简单描沭
[0076]SEQ ID Nos:1_64是可以用于扩增多个鼠核酸序列的32个引物对的核苷酸序列，总结于表1中。
【权利要求】
1.一种用于从非常小的胚胎样(VSEL)干细胞或其衍生物的群体形成胚状体样球体的方法，所述方法包括: (a)提供包含VSEL干细胞或其衍生物的⑶45_细胞群；以及 (b)在包含诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个因子的培养基中培养VSEL干细胞或其衍生物达足以使胚状体样球体形成的时间。
2.权利要求1所述的方法，其中所述VSEL干细胞或其衍生物包含⑶34+/ IirT /CD45—或Sca-I^ / IirT / CD45—非常小的胚胎样(VSEL)干细胞。
3.权利要求1所述的方法，其中所述VSEL干细胞的直径约为3-4μ m，表达SSEA-1、Oct-4、Rev-1、和Nanog的至少一种，具有由细胞质的窄缘围绕的大细胞核，并且具有开放型染色质(常染色质)。
4.权利要求1所述的方法，其中所述包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45_细胞群从人或从小鼠分离。
5.权利要求4所述的方法，其中所述包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45_细胞群从人或小鼠中选自由骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合的组的来源分离。
6.权利要求1所述的方法，其中所述诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个生长因子包括表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子-2及其组合。
7.权利要求1所述的方法，其中通过将所述VSEL干细胞或其衍生物与C2C12细胞共培养将所述一个或更多个因子提供给所述VSEL干细胞或其衍生物。
8.权利要求1所述的方法，进一步包括通过包含下列步骤的方法分离包含VSEL干细胞或其衍生物的⑶45_细胞群: (a)提供怀疑包含CD45_干细胞的初始细胞群； (b)在足以允许每个抗体与，如果存在时，在初始细胞群的每个细胞上的它的靶标结合的条件下将所述初始细胞群与对于CD45特异的第一抗体和对于CD34或Sca-1特异的第二抗体接触； (c)选择为⑶34+或Sca-I^、并且还是⑶45_的细胞的第一亚群； (d)在足以允许每个抗体与，如果存在时，在所述细胞群的每个细胞上的它的靶标结合的条件下将所述细胞的第一亚群与对于一个或更多个细胞表面标记物特异的一个或更多个抗体接触，所述标记物选自由CD45R / B220、Gr-UTCRa β、TCR Y δ、CDllb及Ter-119组成的组； (e)从所述细胞的第一亚群去除结合到步骤(d)的所述抗体的至少一个的那些细胞；以及 (f)收集为CD34+/ lin_ / CD45_或Sca-I^ / lin_ / CD45_的细胞的第二亚群，由此分离⑶45_干细胞的亚群。
9.权利要求8所述的方法，其中每个抗体包括可检测的标记。
10.权利要求9所述的方法，其中所述可检测的标记包括荧光标记或者可以通过包含突光标记的试剂被检测的部分。
11.权利要求8所述的方法，其中所述分离包括FACS分类。
12.权利要求8所述的方法，进一步包括分离为c-met+、c_kit+、和/或LIF-R+的那些细胞。
13.权利要求8所述的方法，进一步包括分离表达选自由SSEA-1、Oct-4、Rex-1及Nanog组成的组的一个或更多个基因的那些细胞。
14.权利要求8所述的方法，其中所述细胞群包括骨髓样品、脐带血样品、或外周血样品。
15.权利要求14所述的方法，其中在用足以将包含VSEL干细胞的CD45_干细胞从骨髓移动到受试者的外周血的量的移动剂处理所述受试者后，所述细胞群从所述受试者的外周血分离。
16.权利要求15所述的方法，其中所述移动剂包括粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4拮抗剂的至少一种。
17.权利要求16所述的方法，其中所述CXCR4拮抗剂是T140肽。
18.权利要求15所述的方法，其中所述受试者是小鼠。
19.权利要求8所述的方法，进一步包括将所述干细胞的亚群与结合到CXCR4的抗体接触以及从所述干细胞的亚群分离为CXCR4+的那些细胞。
20.权利要求8所述的方法，进一步包括分离为CXCR4+和/或AC133+的那些细胞。
21.权利要求8所述的方法，进一步包括选择为HLA-DR'MHCI类-、⑶90'⑶29'⑶105'或其组合的那些细胞。
22.一种包含多个非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的胚状体样球体。
23.—种包含权利要求22所述的胚状体样球体的细胞培养物，所述胚状体样球体在包含诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个因子的培养基中。
24.一种将非常小的胚胎样(VSEL)干细胞分化为感兴趣的细胞类型的方法，所述方法包括: (a)提供包含VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体；以及 (b)在包含分化诱导量的一个或更多个因子的培养基中培养所述胚状体样球体直到所述培养物中出现所述感兴趣的细胞类型，所述因子诱导所述VSEL干细胞或其衍生物分化为所述感兴趣的细胞类型。
25.权利要求24所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型选自由神经元细胞、内胚层细胞及心肌细胞及其衍生物组成的组。
26.权利要求25所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型是神经元细胞或其衍生物。
27.权利要求26所述的方法，其中所述神经元细胞或其衍生物选自由少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经胶质细胞及神经元组成的组。
28.权利要求26所述的方法，其中所述神经元细胞或其衍生物表达选自由GFAP、巢蛋白、β III微管蛋白、Oligl及01ig2组成的组的标记物。
29.权利要求26所述的方法，其中所述培养持续至少约10天。
30.权利要求26所述的方法，其中所述培养基包括约IOng/ mlrhEGF、约20ng / mlFGF-2 及约 20ng / ml NGF。
31.权利要求25所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为内胚层细胞或其衍生物。
32.权利要求31所述的方法，其中所述培养包括在包含ActivinA的第一培养基中培养所述胚状体样球体；以及其后在包含N2补充物-A、B27补充物及约IOmM烟酰胺的第二培养基中培养所述胚状体样球体。
33.权利要求32所述的方法，其中在所述第一培养基中的培养持续约48小时。
34.权利要求32所述的方法，其中在所述第二培养基中的培养持续至少约12天。
35.权利要求32所述的方法，其中所述内胚层细胞或其衍生物表达选自由Nkx6.1、Pdxl及C-肽组成的组的标记物。
36.权利要求25所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为心肌细胞或其衍生物。
37.权利要求36所述的方法，其中所述培养持续至少约15天。
38.权利要求36所述的方法，其中所述培养基包括碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子及转化生长因子βI的组合，数量足以造成所述胚状体样球体细胞的亚组分化为心肌细胞。
39.权利要求36所述的方法，其中所述心肌细胞或其衍生物表达选自由Nsx2.5 / Csx和GATA-4组成的组的标记物。
40.权利要求24所述的方法，其中所述胚状体样球体通过下述制备: (a)提供包含VSEL干细胞的⑶45_细胞群；以及 (b)在包含一个或更多个诱导所述VSEL细胞 的胚状体样球体形成的因子的培养基中培养所述VSEL干细胞达到足以使胚状体样球体出现的时间。
41.一种包含在药学上可接受的载体或赋形剂中的权利要求24所述的分化的非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的制剂。
42.权利要求41所述的制剂，其中所述药学上可接受的载体或赋形剂用于人类中是可接受的。
43.一种用于治疗受试者中组织损伤的方法，所述方法包括给予所述受试者包括在药学上可接受的载体中的包含VSEL干细胞的多个分离的0045_干细胞的组合物，数量和经由的途径足以允许CD45_干细胞群的至少一部分结合所述组织并且在其中分化，由此治疗所述损伤。
44.权利要求43所述的方法，其中所述损伤选自由缺血性损伤、心肌梗塞及中风组成的组。
45.权利要求43所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
46.权利要求45所述的方法，其中所述哺乳动物选自由人类和小鼠组成的组。
47.权利要求43所述的方法，其中所述包含VSEL干细胞的分离的CD45_干细胞从选自由骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合组成的组的来源分离。
48.权利要求43所述的方法，进一步包括分化所述分离的CD45_干细胞以在给予所述受试者所述组合物之前产生预定的细胞类型。
49.权利要求48所述的方法，其中所述预定细胞类型选自由神经细胞、内胚层细胞、心肌细胞及其衍生物组成的组。
50.一种产生嵌合动物的方法，所述方法包括将一个或更多个包含VSEL干细胞的CD45_干细胞群添加到胚胎，以便所述一个或更多个CD45_干细胞发育为所述胚胎的一个或更多个细胞类型。
51.权利要求50所述的方法，其中所述添加包括将所述一个或更多个CD45_干细胞注射入胚泡期胚胎的所述囊胚腔。
52.权利要求50所述的方法,其中所述添加包括聚集包含所述VSEL干细胞的所述一个或更多个CD45—干细胞与桑葚胚期胚胎。
53.权利要求50所述的方法，进一步包括在加入一个或更多个包含所述VSEL干细胞的所述CD45_干细胞后孕育所述胚胎至少直到出生，以提供嵌合动物。
54.一种从0045_干细胞群纯化非常小的胚胎样(VSEL)干细胞用于感兴趣的细胞类型的方法，所述方法包括 (a)提供包含VSEL干细胞的⑶45_干细胞群； (b)鉴定表达VSEL干细胞的标记物的所述CD45_干细胞的亚群；以及 (c)纯化所述亚群。
55.权利要求55所述的方法，其中所述群和所述亚群除了为⑶45_，均为⑶34+/CXCR4+ / Iirf 或 Sca-1+ / lirf。
56.权利要求55所述的方法，其中包含VSEL干细胞的所述CD45_干细胞群从选自由骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合组成的组的来源分离。
57.权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型选自由骨骼肌细胞、肠上皮细胞、胰腺细胞、内皮细胞、表皮细胞、黑色素细胞、神经元细胞、心肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、胰腺细胞、内皮细胞、上皮细胞、视网膜色素细胞及内胚层细胞组成的组。
58.权利要求58所述的方法，其中所述标记物选自由GFAP、巢蛋白、βIII微管蛋白、01igl、01ig2、Myf5、MyoD、成肌蛋白、Nsx2.5 / Csx、GATA_4、甲胎蛋白、CK19、Nkx2_3、Tcf4、Nkx6.1、Pdxl、VE-钙粘蛋白、Krt2_5、Krt2_6a、BNC, DCT, TYR 及 TRP 组成的组。
59.权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为心肌细胞，所述标记物选自由 Nkx2.5 / Csx、GATA-4、MEF2C 组成的组。
60.权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为内皮细胞，所述标记物选自由VEGFR2、VE-钙粘蛋白、血管性血友病因子及TIE2组成的组。
61.权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为骨骼肌细胞，所述标记物选自由Myf5、MyoD及成肌蛋白组成的组。
62.权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为肝细胞，所述标记物选自由甲胎蛋白和CK19组成的组。
63.权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为神经细胞，所述标记物选自由β III微管蛋白、01igl、01ig2、GFAP及巢蛋白组成的组。
64.权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为胰腺细胞，所述标记物选自由Nkx6.1和Pdxl组成的组。
65.权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为黑色素细胞，所述标记物选自由DCT、TYR及TRP组成的组。
66.一种鉴定胚状体样球体形成的诱导剂的方法，所述方法包括: (a)从已知包含所述诱导剂的细胞制备包含多个cDNA克隆的cDNA文库； (b)用所述cDNA文库转化不包含所述诱导剂的多个细胞； (c)在所述转化的多个细胞存在下，培养多个VSEL干细胞或其衍生物，其培养条件足以造成所述VSEL干细胞或其衍生物形成胚状体样球体； (d)分离包含所述诱导剂的所述转化的细胞； (e)从所述转化的细胞回收cDNA克隆；以及(f)鉴定由回收的所述cDNA克隆编码的多肽，由此鉴定胚状体样球体形成的诱导剂。
67.权利要求66所述的方法，其中已知包括所述诱导剂的所述细胞为C2C12细胞。
68.权利要求66所述的方法，其中所述多个cDNA克隆包括位于所述cDNA克隆被插入其中的克隆载体中cDNA克隆位点的至少一侧的侧翼的至少一个引物结合位点。
69.权利要求68所述的方法，进一步包括利用杂交到位于所述cDNA克隆位点的两侧的侧翼的引物位点的引物扩增所述转化的细胞中存在的所述cDNA克隆。
70.权利要求66所述的方法，其中所述鉴定是通过对所述cDNA克隆测序进行的。
71.一种从脐带血或其部分分离包含VSEL干细胞的⑶45_干细胞的亚群的方法，所述方法包括: (a)在足以允许每个抗体与，如果存在时，在所述细胞群的每个细胞上的它的靶标结合的条件下，将所述脐带血或其部分与对于CD45特异的第一抗体和对于CD34或Sca-1特异的第二抗体接触； (b)选择为⑶34+或Sca-、并且为⑶45_的细胞的第一亚群； (c)在足以允许每个抗体与，如果存在时，在所述细胞群的每个细胞上的它的靶标结合的条件下，将所述细胞的第 一亚群与对于选自由⑶45R / B220、Gr-1、TCRa β、TCR Y δ、⑶Ilb及Ter-119组成的组的一个或更多个细胞表面标记物特异的一个或更多个抗体接触； (d)从所述细胞的第一亚群去除结合到步骤(d)的所述抗体的至少一个的那些细胞；以及 (e)收集为CD34+/ IirT / CD45—或Sca- / IirT / CD45_的细胞的第二亚群，由此分离包含VSEL干细胞的⑶45_干细胞的亚群。
72.权利要求71所述的方法，进一步包括在低张溶液中孵育所述脐带血或其部分或所述亚群的任何一个达到足以基本上裂解可能存在的所有红细胞的时间。
73.权利要求71所述的方法，进一步包括分离对于CXCR4、c-met、c-kit、或LIF-R的至少一个为阳性的那些细胞。
【文档编号】A61K35/14GK103952373SQ201310618525
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2006年11月2日 优先权日:2005年12月8日
【发明者】M·拉塔查克, M·库恰, J·拉塔查克 申请人:路易斯维尔大学研究基金会有限公司