小鼠胚胎成纤维细胞nih/3t3电转染的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于转基因技术中细胞转染领域，尤其涉及一种小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3 (以下简称NIH/3T3细胞)电转染的方法。
【背景技术】
[0002]NIH/3T3是从NIH Swiss小鼠胚胎培养物中建立的高度接触抑制的连续细胞株。为了培育在形态学特征上更适合于进行转化分析的亚株，建立的NIH/3T3细胞株又进行了五轮以上亚克隆。这株细胞对DNA转化及转染研宄十分有用。
[0003]NIH/3T3细胞通常采用脂质体转染方法，操作周期为两天，然而，脂质体试剂本身较为昂贵，且带有毒性，也会对细胞的生理活动造成影响。病毒转染方法的准备程序复杂，常常用于难转染的细胞，在一般实验室中很难普及，且价格不菲，改造后病毒仍然可能具有侵染性，需考虑安全因素。DEAE-葡聚糖法是带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞，适应细胞的种类有局限性，操作复杂，对细胞也有一定的毒性。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便快捷、对细胞毒性小且转染效率高的小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3电转染的方法。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3电转染的方法，采用低渗透压的电转染缓冲液，对小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3进行一次放电；电转染缓冲液的渗透压为90?280m0smol/kg，一次放电的电压为710?1100V，持续时间为45?75 μ S。
[0006]电转染缓冲液的渗透压为200?280m0smol/kg。
[0007]一次放电的电压为700?800V或800?900V或900?1000V或1000?1100V，
持续时间为75 μ S。
[0008]电转染缓冲液的渗透压为280m0smol/kg，一次放电的电压为710V或810V或910V或1100V，持续时间为75 μ S。
[0009]电转染缓冲液由等渗透压溶液配制而成；等渗透压溶液组成为KCl 25mM、KH2PO40.3mM、K2HPO40.85mM、肌醇 280m0smol/kg，ρΗ7.I ?7.3，电导率，25 度 3.2 ?3.8mS/cm ο
[0010]电转染是一种方便简捷的细胞转染方法，只需普通缓冲盐溶液即可，周期短，操作只需一天，不会对细胞产生强大的毒副作用。针对脂质体转染、病毒转染和DEAE-葡聚糖法的周期长、成本高、操作繁琐的问题，发明人结合电转染的上述优点，建立了一种小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3电转染的方法，该法主要采用等渗透压的电转染缓冲液，对小鼠成纤维细胞NIH/3T3进行一次放电，通过等渗透压和高压脉冲电场压组合，使得细胞体积增大，高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔导入细胞质中，从而提高电转效率。实际试验表明，应用本发明质粒pmaxGFP(绿色荧光蛋白)转染到小鼠成纤维细胞NIH/3T3，转染效率最高可以达到55%左右。本发明可以缩短试验周期，节约成本，减少繁琐的操作步骤，并且安全无害，为小鼠成纤维细胞NIH/3T3细胞系的后续研宄提供了关键的技术支持。
【附图说明】
[0011]图1是脂质体转染NIH/3T3细胞的荧光显微镜图。
[0012]图2是脂质体转染NIH/3T3细胞不加质粒的阴性对照的荧光显微镜图。
[0013]图3是本发明电转染(710V)NIH/3T3细胞的荧光显微镜图。
[0014]图4是本发明电转染(810V)NIH/3T3细胞的荧光显微镜图。
[0015]图5是本发明电转染(910V)NIH/3T3细胞的荧光显微镜图。
[0016]图6是本发明电转染(1100V)NIH/3T3细胞的荧光显微镜图。
[0017]图7是各种不同条件下转染进绿色荧光蛋白的细胞占总细胞的比例的柱状图。
【具体实施方式】
[0018]采用传统的脂质体转染和本发明电转染方法的转染率进行对比，同时设置不转质粒的组作为阴性对照。
[0019]一、小鼠成纤维细胞NIH/3T3电转染的方法
[0020]试验方法:通过本发明电转染方法将AMAXA公司的货号为VPA1001的pmaxGFP (绿色荧光蛋白)质粒转染到小鼠成纤维细胞NIH/3T3，采用荧光显微镜拍照计算发绿色荧光数目的细胞以分析转染效率。试验中包括了对细胞实施四种不同电压，采取相同渗透压的缓冲液以及相同脉冲时长的放电时间。
[0021]试验设备:型号eppendorf multiporator，货号 4308CG831520。
[0022]电转染方法:采用等渗透压的电转染缓冲液，对小鼠成纤维细胞NIH/3T3进行一次放电；电转染缓冲液的渗透压为280m0smol/kg，一次放电的电压分别为710V、810V、910V、1100V，持续时间为 75 μ S。等渗透压溶液组成为:KCl,25mM ；KH2P04,0.3mM ；K2HPO40.85mM ;肌醇 280m0smol/kg，ρΗ7.I ?7.3，电导率，25 度 3.2 ?3.8mS/cm。
[0023]具体试验步骤如下:
[0024]在指数时期收集细胞，用280m0smol/kg渗透压的等渗缓冲液稀释细胞，并加入pmaxGFP质粒，使其终密度约为2x 16ce 11 s/ml，质粒终浓度为20 μ g/ml ;分装到四个400 μ 1，直径为2mm的电转杯后，按以下要求施加电压；
[0025]第一次条件为:电压710V，渗透压280m0smol/kg，持续时间75 μ s ;
[0026]第二次条件为:电压810V，渗透压280m0smol/kg，持续时间75 μ s ;
[0027]第三次条件为:电压910V，渗透压280m0smol/kg，持续时间75 μ s ;
[0028]第四次条件为:电压1100V，渗透压280m0smol/kg，持续时间75 μ S。
[0029]二、小鼠成纤维细胞ΝΙΗ/3Τ3脂质体转染方法
[0030]在孔板中先培养细胞，待其密度约为2X106cellS/ml时，开始进行脂质体转染，将I μ g的质粒和I μ I的脂质体分别加入50 μ I的optin-DMEM培养基中，静置5min ;混合均匀后室温静置20min，然后加入到孔板中；用optin-DMEM培养基补足剩余的培养基，6h后换液。第二天观察结果。
[0031]三、实验数据及结果
[0032]如图1至7所示，传统脂质体转染效率在40%左右，而采用本发明方法随着电压不断地增高，NIH/3T3细胞的转染效率呈梯度增高趋势，当电压为710V时，转染效率达到10%左右，当电压为81V时，转染效率达到20%左右，当电压91V时，转染效率达到50%左右，当电压为1100V时，转染效率达到55%左右，超过脂质体转染效率。
[0033]通过对比数据可知，本发明通过高压脉冲电场和等渗透压组合的方式，在对细胞施加不同电压后，外源DNA分子进入细胞质的数量呈递增趋势，在电压1100V的条件下，NIH/3T3细胞转染pmax(绿色荧光蛋白)细胞学实验结果的转染效率超过脂质体转染效率，达到55%左右。试验周期短，成本节约，操作简捷，安全无害，为NIH/3T3下一步试验研宄提供便捷条件。
【主权项】
1.一种小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3电转染的方法，其特征在于采用等渗透压的电转染缓冲液，对小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3进行一次放电；所述电转染缓冲液的渗透压为280m0smol/kg，一次放电的电压为710?1100V，持续时间为45?75 μ S。2.根据权利要求1所述的小鼠胚胎成纤维细胞ΝΙΗ/3Τ3电转染的方法，其特征在于:所述电转染缓冲液的渗透压为280m0smol/kg。3.根据权利要求2所述的小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3电转染的方法，其特征在于:所述一次放电的电压为700?800V或800?900V或900?1000V或1000?1100V，持续时间为75 μ S。4.根据权利要求3所述的小鼠胚胎成纤维细胞ΝΙΗ/3Τ3电转染的方法，其特征在于:所述电转染缓冲液的渗透压为280m0smol/kg，一次放电的电压为710V或810V或910V或1100￥，持续时间为75 4 8。5.根据权利要求4所述的小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3电转染的方法，其特征在于:所述电转染缓冲液由等渗透压溶液配制而成；所述等渗透压溶液组成为KCl 25mM、KH2PO40.3mM、K2HPO40.85mM、肌醇 280m0smol/kg，ρΗ7.I ?7.3，电导率，25 度 3.2 ?3.8mS/cm ο
【专利摘要】本发明公开了一种小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3电转染的方法，该法主要采用等渗透压的电转染缓冲液，对小鼠成纤维细胞NIH/3T3进行一次放电，通过等渗透压和高压脉冲电场压组合，使得细胞体积增大，高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔导入细胞质中，从而提高电转效率。实际试验表明，应用本发明质粒pmaxGFP(绿色荧光蛋白)转染到小鼠成纤维细胞NIH/3T3，转染效率最高可以达到55％左右。本发明可以缩短试验周期，节约成本，减少繁琐的操作步骤，并且安全无害，为小鼠成纤维细胞NIH/3T3细胞系的后续研究提供了关键的技术支持。
【IPC分类】C12N15/87
【公开号】CN104975045
【申请号】CN201510280081
【发明人】周磊, 邹知明, 崔涵, 李一星
【申请人】广西大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年5月27日