本发明属于动物繁殖技术领域，涉及一种用于农业-畜牧兽医繁殖的技术，具体涉及一种提高牛体外受精胚胎培养效率的方法，更具体的说，本发明涉及牛体外受精胚胎培养液在牛体外受精胚胎培养中的应用。进一步的，本发明还涉及使用该牛体外受精胚胎培养液进行牛体外受精胚胎培养的方法。特别是，本发明牛体外受精胚胎培养的方法具有优异的成本优势。
背景技术：
体外受精(invitrofertilization)或(externalfertilization)是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为ivf。由于它与胚胎移植技术(et)密不可分，又简称为ivf-et。在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物(test-tubeanimal)。这项技术成功于20世纪50年代，在最近20年发展迅速，现已日趋成熟而成为一项重要而常规的动物繁殖生物技术。
体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医学和濒危动物保护等具有重要意义。如用小鼠、大鼠或家兔等作实验材料，体外受精技术可用于研究哺乳动物配子发生、受精和胚胎早期发育机理。在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值。在人类，ivf-et技术是治疗某些不孕症和克服性连锁病的重要措施之一。体外受精技术还是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分。
随着现代农业科技的发展，为了更充分利用良种母牛的繁殖潜力，加速遗传育种进程，在生产实践中应用高效的繁殖新技术成为必然。活体采卵(ovumpickup，opu)和体外受精技术(invitrofertilization，ivf)是二十世纪八十年代快速发展起来的胚胎工程新技术，二者相结合可获得大量遗传系谱明确的胚胎，从而缩短世代间隔。目前，这两种技术已经成为欧美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种母牛群而采用的重要繁殖技术。然而，采用常规的牛胚胎培养体系(cr1aa和sof液)，牛体外受精的囊胚发育率较低，而且胚胎质量也远不及体内胚胎，导致胚胎移植受体后的妊娠率低，因此如何提高囊胚发育率及胚胎质量成为体外受精胚胎生产的重点和研究的焦点。
早在1878年，德国人scnenk就以家兔和豚鼠为材料，开始探索哺乳动物的体外受精技术。但直到1951年，美籍华人张民觉和austin分别发现精子体外获能现象后，体外受精技术才获得了突破性进展。牛体外受精技术受到卵母细胞的体外成熟、精子的体外获能、受精卵的体外培养环境等多个方面的影响。
胚胎的体外培养是ivf技术的一个关键环节，亦是卵母细胞体外成熟和体外受精技术最终效果的体现和检验。在体外受精后，受精卵在向囊胚发育过程中将需经历一系列重要的变化，包括合子的形成、第一次卵裂、胚胎基因组的激活、致密化以及形成囊胚。这一过程中，外界环境的变化会导致基因表达发生改变，从而影响胚胎的正常发育及质量。目前，哺乳动物早期胚胎的体外培养研究主要集中在改善培养液成分以满足不同发育阶段的胚胎营养需求。基于rosenkrans等(rosenkrans，c.f.，jr.andn.l.first，effectoffreeaminoacidsandvitaminsoncleavageanddevelopmentalrateofbovinezygotesinvitro.janimsci，1994.72(2):p.434-7)开发的charlesrosenkrans1(cr1)培养液和tervit等(tervit，h.r.，d.g.whittingham，andl.e.rowson,successfulcultureinvitroofsheepandcattleova.jreprodfertil,1972.30(3):p.493-7)开发的合成输卵管液(syntheticoviductalfluid，sof)，经多年不断改进逐步形成了两种培养体系。据hakansagirkaya等(sagirkaya,h.,etal.,developmentalpotentialofbovineoocytesculturedindifferentmaturationandcultureconditions.animreprodsci,2007.101(3-4):p.225-40)和somfai等(somfai,t.,etal.,developmentofbovineembryosculturedincr1aaandivd101mediausingdifferentoxygentensionsandculturesystems.actavethung,2010.58(4):p.465-74)研究成果表明，cr1aa培养液用于牛胚胎培养有较好的效果，可以广泛应用于牛的胚胎培养；thompson,j.g.等(thompson,j.g.,etal.,effectofinhibitorsanduncouplersofoxidativephosphorylationduringcompactionandblastulationofbovineembryosculturedinvitro.jreprodfertil,2000.118(1):p.47-55)和jeanm.feugang等(feugang,j.m.,o.camargo-rodriguez,ande.memili,culturesystemsforbovineembryos.livestockscience,2009.121(2-3):p.141-149)的研究结果显示，sof培养液也是一种适合于牛胚胎培养的培养体系。张志平等(张志平,安志兴,张锈,张涌,牛胚胎培养体系的优化.西北农林科技大学学报,2006.34)和桑国俊等(桑国俊,牛卵母细胞及体外胚培养技术研究.2008)研究结果也显示，经过优化的cr1aa和sof培养液均适合于牛的体外胚胎培养，均取得良好的培养效果。哺乳动物早期胚胎发育是一个高度协调且精确调节的过程。在进化过程中，配子细胞逐步形成了一系列的分子级联网络，以保证胚胎发育周期系统地进行。在发育过程中，胚胎的内外活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ros)与抗氧化剂的平衡对早期胚胎发育起着决定性作用。
大多生化反应均产生ros，其在细胞内、外均有着重要的作用，一部分ros起着信号分子的作用，但是大多数ros对机体是有害的。brooker,r.j.等(brooker,r.j.,genetics:analysisandprinciples(4thed.).mcgraw-hillscience,2011)报道，ros可以引起细胞dna损伤、不饱和脂肪酸的氧化、蛋白质中氨基酸的氧化甚至可以导致某些酶的失活。一般来说，ros以四种形式存在，其中h2o2氧化作用较强，是引起氧化伤害的最主要因素。
大量研究表明，谷胱甘肽(gsh)是以非蛋白质形式存在的一种抗氧化剂，能够清除多种自由基：超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢、次氯酸和脂氧自由基，并且能够维持细胞内外氧化还原平衡。细胞内外环境gsh和ros水平是影响受精卵发育过程中的两个重要因素。早在2000年，dematos等(dematos,d.g.andc.c.furnus,theimportanceofhavinghighglutathione(gsh)levelafterbovineinvitromaturationonembryodevelopmenteffectofbeta-mercaptoethanol,cysteineandcystine.theriogenology,2000.53(3):p.761-71)曾通过在体外胚胎培养过程中添加β-巯基乙醇、半胱氨酸和胱氨酸来提高囊胚率。
尽管体外受精技术能成功应用于许多哺乳动物，但由于体外受精的囊胚率低而导致体外受精胚胎的生产成本高、效率低，限制了该技术在牛快速扩繁实践中的广泛应用。因此，如何能够降低成本并提高牛ivf胚胎生产效率和胚胎质量成为亟待解决的问题。
目前，牛体外受精的技术体系中主要以cr1aa和sof液为胚胎体外培养液，并在此基础上进行改进，囊胚发育率均有不同程度的提高，囊胚发育率平均为30％-40％。对于囊胚质量，可以通过囊胚细胞总数、icm细胞数/总细胞数比例、细胞凋亡率来评估。囊胚细胞总数根据囊胚所处阶段的不同而不同，s.iwasaki等(iwasaki,s.andt.nakahara,cellnumberandincidenceofchromosomalanomaliesinbovineblastocystsfertilizedinvitrofollowedbycultureinvitroorinvivoinrabbitoviducts.theriogenology,1990.33(3):p.669-75)获得的牛早期囊胚总细胞数平均为44，icm细胞数/囊胚总细胞数比例为15.8％左右；andrewj.watson等(watson,a.j.,etal.,impactofbovineoocytematurationmediaonoocytetranscriptlevels,blastocystdevelopment,cellnumber,andapoptosis.biolreprod,2000.62(2):p.355-64)统计牛囊胚细胞凋亡率约为7.7％-13％。
cn103898046b(中国专利申请号201410073635.4)公开了一种专用于牛体外受精胚胎的培养液，所述培养液配方为：nacl109.5mm、kcl3.1mm、nahco326.2mm、mgcl2·6h2o0.8mm、kh2po31.19mm、丙酮酸钠0.4mm、葡萄糖1.5mm、半乳糖酸钙5mm、10v/v％胎牛血清、l-谷氨酰胺1mm、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必须氨基酸和谷胱甘肽3mm，以水配制；所述必需氨基酸为以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量为：l-盐酸精氨酸6.32g/l、l-胱氨酸二盐酸盐1.564g/l、l-盐酸组氨酸一水物2.1g/l、l-异亮氨酸2.625g/l、l-亮氨酸2.62g/l、l-赖氨酸盐酸盐3.625g/l、l-蛋氨酸0.755g/l、l-苯丙氨酸1.65g/l、l-苏氨酸2.38g/l、l-色氨酸0.51g/l、l-酪氨酸1.8g/l和l-缬氨酸2.34g/l；所述非必须氨基酸为以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量为：l-丙氨酸0.89g/l、l-天门冬酰胺一水物1.5g/l、l-天冬氨酸1.33g/l、l-谷氨酸1.47g/l、甘氨酸0.75g/l、l-脯氨酸1.15g/l和l-丝氨酸1.05g/l。将牛体外受精胚胎置于上述培养液中进行体外培养，据信结果显示明显优于未添加gsh的对照组，提高了囊胚发育率及胚胎质量，降低体外生产胚胎的成本，为牛ivf技术应用于实践提供实验基础，可大大加速遗传育种进程。
其他参考文献：
陈大元.受精生物学.2003,北京:科学出版社；
方俊顺.牛胚胎体外生产技术研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库.农业科技辑》.2007,(第4期)；
曹海清.卵丘细胞和培养条件对牛体外胚胎生产效率的影响.《中国优秀硕士学位论文全文数据库.农业科技辑》.2008,(第9期)；
i.h.kimetal.effectofexogenousglutathioneontheinvitrofertilizationofbovineoocytes.theriogenology.1999,vol.52(3)。
然而，本领域仍然期待有性能改进的牛体外受精胚胎的培养的方法，例如仍然期待有提高牛体外受精胚胎培养效率的方法，例如有具有优异的成本优势的牛体外受精胚胎培养的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种性能改进的牛体外受精胚胎的培养的方法，特别是期待提高牛ivf胚胎生产效率和胚胎质量。更具体的，本发明为达成上述目的而需要提供一种专用于牛体外受精胚胎的培养液和以及使用该培养进行牛体外受精胚胎培养的方法。本发明人已经出人意料的发现，使用本发明方法呈现优异的技术效果，本发明因此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种牛体外受精胚胎培养液，该培养液包含：
109-110mm的nacl、
2.9-3.1mm的kcl、
26.0-26.5mm的nahco3、
0.5-1.0mm的mgcl2·6h2o、
1.0-1.3mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸钠、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸钙、
2-3v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必须氨基酸、
1-10mm的谷胱甘肽、和
作为配液溶剂的水。
根据本发明第一方面任一实施方案的牛体外受精胚胎培养液，该培养液包含：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.2mm的nahco3、
0.8mm的mgcl2·6h2o、
1.19mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸钠、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸钙、
2.5v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必须氨基酸、
1-10mm的谷胱甘肽、和
作为配液溶剂的水。
根据本发明第一方面任一实施方案的牛体外受精胚胎培养液，其中所述必需氨基酸是由以下氨基酸按比例和浓度配制所得的水溶液：
l-盐酸精氨酸6.32g/l、
l-胱氨酸二盐酸盐1.564g/l、
l-盐酸组氨酸一水物2.1g/l、
l-异亮氨酸2.625g/l、
l-亮氨酸2.62g/l、
l-赖氨酸盐酸盐3.625g/l、
l-蛋氨酸0.755g/l、
l-苯丙氨酸1.65g/l、
l-苏氨酸2.38g/l、
l-色氨酸0.51g/l、
l-酪氨酸1.8g/l、和
l-缬氨酸2.34g/l。
根据本发明第一方面任一实施方案的牛体外受精胚胎培养液，其中所述非必需氨基酸是由以下氨基酸按比例和浓度配制所得的水溶液：
l-丙氨酸0.89g/l、
l-天门冬酰胺一水物1.5g/l、
l-天冬氨酸1.33g/l、
l-谷氨酸1.47g/l、
甘氨酸0.75g/l、
l-脯氨酸1.15g/l、和
l-丝氨酸1.05g/l。
根据本发明第一方面任一实施方案的牛体外受精胚胎培养液，其中所述培养液中谷胱甘肽的浓度为1～7mm。
根据本发明第一方面任一实施方案的牛体外受精胚胎培养液，其中所述培养液中谷胱甘肽的浓度为3～5mm。
根据本发明第一方面任一实施方案的牛体外受精胚胎培养液，其中所述培养液中谷胱甘肽的浓度为1mm、3mm、5mm或7mm。
根据本发明第一方面任一实施方案的牛体外受精胚胎培养液，其中所述培养液中谷胱甘肽的浓度为3mm或5mm。
根据本发明第一方面任一实施方案的牛体外受精胚胎培养液，其中所述培养液中谷胱甘肽的浓度为3mm。
根据本发明第一方面任一实施方案的牛体外受精胚胎培养液，其中还包含枸橼酸钠和麦芽糖。在一个实施方案中，所述牛体外受精胚胎培养液中枸橼酸钠和麦芽糖的浓度分别为0.03～0.05w/v％和0.01～0.03w/v％。在一个实施方案中，所述牛体外受精胚胎培养液中枸橼酸钠和麦芽糖的浓度分别为0.04w/v％和0.02w/v％。已经出人意料的发现，在牛体外受精胚胎培养液中同时添加微量的枸橼酸钠和麦芽糖时，有助于提高囊胚孵化率，并且其它指标不受影响。囊胚孵化率是囊胚质量的重要评价指标，在其它指标不受影响的前提下提高囊胚孵化率，对于牛体外受精胚胎培养工作具有重要意义。另外，还发现，在添加此枸橼酸钠和麦芽糖的情况下，可以大大减小牛体外受精胚胎培养液中胎牛血清的浓度，并且获得基本相同的培养效果；由于牛体外受精胚胎培养液中胎牛血清相对于其中的其它组分(包括枸橼酸钠和麦芽糖)是极为昂贵的，牛体外受精胚胎培养液的主要成本在于胎牛血清，胎牛血清的用量减小对于提高牛体外受精胚胎培养效率、降低生产成本是极为有利的。
进一步的，本发明第二方面提供了一种以提高的效率培养牛体外受精胚胎的方法，该方法包括如下步骤：
将牛体外受精胚胎置于牛体外受精胚胎培养液中，在38.5℃、0.5％co2、100％湿度条件下进行胚胎体外培养。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中胚胎体外培养包括如下步骤：
(1)精卵共孵育8h后，取出卵母细胞，使用1mg/ml的透明质酸酶消化处理3min，然后使用移液枪反复吹打，直至卵丘细胞基本脱落；
(2)使用含10％fbs的tcm199终止透明质酸酶的消化，用口吸管将疑似受精卵在添加有牛血清白蛋白(通常亦缩写为bsa)的胚胎前期培养液中洗3次后，放入胚胎前期培养液滴中进行培养，培养条件为38.5℃、0.5％co2、100％湿度；
(3)48h后，将卵裂至4-8细胞的胚胎移至胚胎后期培养液(其即为本发明的牛体外受精胚胎培养液)滴中进行培养(培养条件为38.5℃、0.5％co2、100％湿度)，48h后半量更换胚胎后期培养液并继续培养(38.5℃，5％co2气体，95％湿度)；
(4)以受精当天为0天开始计时，至第7天时统计囊胚率，至第9天时统计囊胚孵化率(其为孵化囊胚数除以囊胚数所得百分数)。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述牛体外受精胚胎培养液中包含：
109-110mm的nacl、
2.9-3.1mm的kcl、
26.0-26.5mm的nahco3、
0.5-1.0mm的mgcl2·6h2o、
1.0-1.3mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸钠、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸钙、
2-3v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必须氨基酸、
1-10mm的谷胱甘肽、和
作为配液溶剂的水。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述牛体外受精胚胎培养液中包含：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.2mm的nahco3、
0.8mm的mgcl2·6h2o、
1.19mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸钠、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸钙、
2.5v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必须氨基酸、
1-10mm的谷胱甘肽、和
作为配液溶剂的水。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述牛体外受精胚胎培养液中的所述必需氨基酸是由以下氨基酸按比例和浓度配制所得的水溶液：
l-盐酸精氨酸6.32g/l、
l-胱氨酸二盐酸盐1.564g/l、
l-盐酸组氨酸一水物2.1g/l、
l-异亮氨酸2.625g/l、
l-亮氨酸2.62g/l、
l-赖氨酸盐酸盐3.625g/l、
l-蛋氨酸0.755g/l、
l-苯丙氨酸1.65g/l、
l-苏氨酸2.38g/l、
l-色氨酸0.51g/l、
l-酪氨酸1.8g/l、和
l-缬氨酸2.34g/l。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述牛体外受精胚胎培养液中的所述非必需氨基酸是由以下氨基酸按比例和浓度配制所得的水溶液：
l-丙氨酸0.89g/l、
l-天门冬酰胺一水物1.5g/l、
l-天冬氨酸1.33g/l、
l-谷氨酸1.47g/l、
甘氨酸0.75g/l、
l-脯氨酸1.15g/l、和
l-丝氨酸1.05g/l。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述培养液中谷胱甘肽的浓度为1～7mm。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述培养液中谷胱甘肽的浓度为3～5mm。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述培养液中谷胱甘肽的浓度为1mm、3mm、5mm或7mm。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述培养液中谷胱甘肽的浓度为3mm或5mm。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述培养液中谷胱甘肽的浓度为3mm。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述牛体外受精胚胎培养液中还包含枸橼酸钠和麦芽糖。在一个实施方案中，所述牛体外受精胚胎培养液中枸橼酸钠和麦芽糖的浓度分别为0.03～0.05w/v％和0.01～0.03w/v％。在一个实施方案中，所述牛体外受精胚胎培养液中枸橼酸钠和麦芽糖的浓度分别为0.04w/v％和0.02w/v％。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
本发明使用的胎牛血清可以容易的从市场购得其标准化商品形式，例如可以从各种代理商处购得gibco公司的澳洲胎牛血清(货号：10099141)、新西兰胎牛血清(货号：10091148)、北美胎牛血清(货号：16000044)、墨西哥胎牛血清(货号：10437028)等，这些商品化胎牛血清的价格500ml大多在8000元以上，用于本发明牛体外受精胚胎培养液中时胎牛血清是成本主要贡献者。在本发明上下文的试验中，如未特别说明，所用的胎牛血清是gibco公司的澳洲胎牛血清(货号：10099141)。
本发明具有以下优点：本发明通过在培养液中添加一定浓度的谷胱甘肽(glutathione，gsh)，能显著提高体外胚胎的发育能力。同时对囊胚进行差异染色，区分内细胞团(innercellmass，icm)、滋养层细胞和凋亡细胞，比较总细胞数，并计算icm细胞数/总细胞数比例和凋亡率，结果显示添加gsh的试验组优于对照组，提高了囊胚发育率及胚胎质量，降低体外生产胚胎的成本，为牛ivf技术应用于实践提供实验基础，可大大加速遗传育种进程。另外，已经出人意料的发现，使用具有本发明配方的牛体外受精胚胎培养液能够显著提高提高囊胚孵化率，并且其它指标不受影响，囊胚孵化率是囊胚质量的重要评价指标，在其它指标不受影响的前提下提高囊胚孵化率，对于牛体外受精胚胎培养工作具有重要意义。另外，本发明还发现，在添加此枸橼酸钠和麦芽糖的情况下，可以大大减小牛体外受精胚胎培养液中胎牛血清的浓度，并且获得基本相同的培养效果；由于牛体外受精胚胎培养液中胎牛血清相对于其中的其它组分(包括枸橼酸钠和麦芽糖)是极为昂贵的，牛体外受精胚胎培养液的主要成本在于胎牛血清，胎牛血清的用量减小对于提高牛体外受精胚胎培养效率、降低生产成本是极为有利的。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1：牛体外受精胚胎的培养方法
一、试剂
成熟培养液：含0.01iu/ml的fsh、10iu/ml的lh、1μg/ml雌二醇、100ng/ml的igf、50ng/ml的egf、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10％胎牛血清的tcm-199培养液。
洗精液：含112.0mm的nacl、4.02mm的kcl、2.25mm的cacl2·2h2o、0.52mm的mgcl2·6h2o、0.83mm的kh2po3、37.0mm的nahco3、1.25mm的丙酮酸钠、10μg/ml的肝素、4mg/ml的牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)、10mm的咖啡因、100u/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素的水溶液。
受精液：含112.0mm的nacl、4.02mm的kcl、2.25mm的cacl2·2h2o、0.52mm的mgcl2·6h2o、0.83mm的kh2po3、37.0mm的nahco3、1.25mm的丙酮酸钠、10μg/ml的肝素、4mg/ml的bsa、100u/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素的水溶液。
胚胎前期培养液：含109.5mm的nacl、3.1mm的kcl、26.2mm的nahco3、0.8mm的mgcl2·6h2o、1.19mm的kh2po3、0.4mm的丙酮酸钠、1.5mm的葡萄糖、5mm的半乳糖酸钙、6mg/ml的bsa、1mm的l-谷氨酰胺、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必须氨基酸的水溶液。
胚胎后期培养液：含109.5mm的nacl、3.1mm的kcl、26.2mm的nahco3、0.8mm的mgcl2·6h2o、1.19mm的kh2po3、0.4mm的丙酮酸钠、1.5mm的葡萄糖、5mm的半乳糖酸钙、10v/v％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)、1mm的l-谷氨酰胺、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必须氨基酸的水溶液。
所述必需氨基酸为以下氨基酸按比例/浓度配制的水溶液，其中，各氨基酸含量为：l-盐酸精氨酸6.32g/l、l-胱氨酸二盐酸盐1.564g/l、l-盐酸组氨酸一水物2.1g/l、l-异亮氨酸2.625g/l、l-亮氨酸2.62g/l、l-赖氨酸盐酸盐3.625g/l、l-蛋氨酸0.755g/l、l-苯丙氨酸1.65g/l、l-苏氨酸2.38g/l、l-色氨酸0.51g/l、l-酪氨酸1.8g/l和l-缬氨酸2.34g/l。
所述非必须氨基酸为以下氨基酸按比例/浓度配制的水溶液，其中，各氨基酸含量为：l-丙氨酸0.89g/l、l-天门冬酰胺一水物1.5g/l、l-天冬氨酸1.33g/l、l-谷氨酸1.47g/l、甘氨酸0.75g/l、l-脯氨酸1.15g/l和l-丝氨酸1.05g/l。
二、卵母细胞的采集和体外成熟
1.从屠宰场采集牛卵巢，置于37℃生理盐水中，3h内送至实验室。
2.使用含有青霉素和链霉素的温热的生理盐水将卵巢清洗3-5次。
3.使用真空蠕动泵，用18号针头抽取5-8毫米卵泡中的卵泡液。
4.体视显微镜下挑选卵母细胞-卵丘细胞复合体(cocs)，在洗卵液中将cocs洗涤两次，在成熟培养液中洗涤一次。
5.将洗干净的cocs放入含有成熟培养液并覆盖矿物油的四孔板中，每孔培养50枚cocs，培养22-24h。
三、体外受精
1.将cocs从成熟培养液中移入50μl受精滴中，每滴放15枚cocs。
2.38℃水浴解冻精液，使用5ml洗精液在500g条件下离心5min；弃上清，再加入5ml洗精液离心5min，弃上清，使用洗精液调整精子浓度，使精子浓度约为2×107个/ml。
3.取50μl精液，与含有cocs的受精滴混合成为100μl的液滴。
4.38.5℃，5％co2气体，95％湿度条件下精卵共孵育8h。
四、胚胎体外培养
1.精卵共孵育8h后，取出卵母细胞，使用1mg/ml的透明质酸酶消化处理3min，然后使用移液枪反复吹打，直至卵丘细胞基本脱落。
2.使用含10％fbs的tcm199终止透明质酸酶的消化，用口吸管将疑似受精卵在添加有牛血清白蛋白的胚胎前期培养液中洗3次后，放入胚胎前期培养液滴中进行培养(38.5℃，5％co2气体，95％湿度)。
3.48h后，将卵裂至4-8细胞的胚胎移至胚胎后期培养液滴中进行培养(38.5℃，5％co2气体，95％湿度)，48h后半量更换胚胎后期培养液并继续培养(38.5℃，5％co2气体，95％湿度)。
4.以受精当天为0天开始计时，至第7天时统计囊胚率，至第9天时统计囊胚孵化率(其为孵化囊胚数除以囊胚数所得百分数)。
五、胚胎后期培养液中gsh(谷胱甘肽)最适添加浓度筛选
1.配制0.5m的gsh作为储液。
2.使用gsh储液，按照终浓度为1mm、3mm、5mm、7mm梯度向胚胎后期培养液中添加配制为胚胎后期培养液的试验组，以非添加组为对照。
3.分别于培养的第48h、第5天、第7天，统计各个组的卵裂卵与8细胞率、桑椹胚率和囊胚率。
六、胚胎差异染色
1.选取体外培养第7天的囊胚，使用2％多聚甲醛固定20min。
2.使用含0.5％bsa的磷酸盐缓冲液(pbs-bsa)洗两次，放入透化液(50μltriton、5μl吐温80和9.945mlpbs)中，室温放置30min。
3.使用2m盐酸室温处理20min，然后使用100mm的tris-hcl室温处理10min，使cdx2蛋白能够与一抗结合。
4.使用pbs-bsa清洗三次，将囊胚放入封闭液(1ml山羊血清、5μl吐温80和8.995mlpbs)中，室温封闭1h，然后转入4℃冰箱封闭过夜。
5.弃去封闭液，cdx2一抗用封闭液按1:200稀释，室温孵育2h，弃去一抗稀释液，用pbs-bsa清洗3次，每次5min。
6.caspase-3一抗(购自cellsignalingtechnology公司)用封闭液按1:200稀释，室温孵育2h，弃去一抗稀释液，用pbs-bsa清洗3次，每次5min。
7.在避光条件下用封闭液按1:200稀释cdx2特异性二抗(购自sigma公司)，室温下避光放置1h。避光条件下弃去二抗稀释液，用pbs清洗3次，每次5min。
8.在避光条件下用封闭液按1:200稀释caspase-3特异性二抗(购自lifetechnologies公司)，室温下避光放置1h。避光条件下弃去二抗稀释液，用pbs清洗3次，每次5min。
9.加入10μg/ml的hochest33342染液染细胞核，室温作用5min，在荧光显微镜下观察并拍照。
10.实验重复三次，每次随机选取10个囊胚，计算凋亡率、icm细胞数/总细胞数来评估囊胚质量。
七、数据统计
实验数据采用统计软件sasv8中的anova程序进行分析，duncan’smultiple-range检验方法判定处理间的差异显著性，当p<0.05时认为差异显著。
八、胚胎后期培养液中添加gsh可显著提高牛体外受精囊胚的发育率
选择gsh添加浓度为0、1、3、5、7mm进行筛选，通过统计卵裂率(即，卵裂率＝受精卵裂数/受精卵数)、4-8细胞率、桑椹胚率、囊胚率(即，囊胚率＝囊胚数/卵裂胚胎数)。
结果：
胚胎后期培养液中gsh添加浓度为0、1、3、5、7mm的五组间的卵裂率和4-8细胞率均差异不显著(p>0.05)，例如五组卵裂率均在0.80～0.88范围内，五组4-8细胞率均在0.67～0.79范围内；
对桑葚胚发育率(即桑椹胚率，桑葚胚率＝桑葚胚胎数/卵裂胚胎数)，3mm和5mm的gsh添加组均显著高于对照组和5mm、7mm实验组(p<0.05)，但3mm和5mm这两组间差异不显著(p>0.05)，例如对照组和5mm、7mm这三组的桑椹胚率在0.46～0.49范围内，而3mm和5mm这两组的桑椹胚率在0.61～0.63范围内；
对囊胚率而言，1mm、3mm和5mm的gsh添加组均显著高于对照组(p<0.05)，而7mm的gsh添加组与对照组间差异不显著(p>0.05)，例如对照组和7mm组的囊胚率分别为0.32和0.36，1mm组的囊胚率为0.42，3mm和5mm组的囊胚率在0.46～0.51范围内；这些结果与cn103898046a表1结果基本一致。可见在胚胎后期培养液中添加gsh均可提高牛ivf胚胎的体外发育率。
九、胚胎后期培养液中添加gsh可提高牛体外受精胚胎的质量
通过统计总细胞数、icm细胞数/总细胞数、凋亡率(即，凋亡率＝凋亡细胞数/总细胞数)，比较分析了gsh不同添加浓度组获得的囊胚质量。结果如下：
对于总细胞数，1mm、3mm、5mm、7mm四个gsh浓度添加组均显著高于对照组(p<0.05)，且3mm、5mm和7mm组均显著高于1mm组(p<0.05)，例如0mm组总细胞数为42.4，1mm组总细胞数为63.6，3mm、5mm和7mm组总细胞数均在82～89范围内；
对于icm细胞数/总细胞数的比率，1mm添加组与对照组差异不显著(p>0.05)，3mm、5mm和7mm组均显著低于对照组(p<0.05)，但这三组之间差异不显著(p>0.05)，例如1mm添加组与对照组的icm细胞数/总细胞数比均在0.41～0.48范围内，3mm、5mm和7mm组的icm细胞数/总细胞数比均在0.41～0.48范围内0.27～0.34范围内；
对于凋亡率，四个添加组与对照组之间差异不显著(p>0.05)，1mm、3mm、7mm的gsh添加组和对照组的凋亡率均显著低于5mm添加组(p<0.05)；这些结果与cn103898046a表2结果基本一致。可见gsh的添加有助于提高牛体外受精胚胎的质量。
十、胚胎后期培养液中添加gsh的最适添加浓度为3mm
在四个实验组中，3mm和5mm的gsh添加组获得的桑葚胚率和囊胚率均显著高于对照组和其它实验组(p<0.05)；但3mm的gsh添加组的桑葚胚率与5mm的gsh添加组间差异不显著(p>0.05)，但囊胚率却显著高于5mm添加组(p<0.05)，可见3mm的gsh添加组中的牛ivf胚胎的发育率是最高的，因此gsh的最适浓度为3mm的gsh添加组。
本实施例筛选出了最适添加浓度，极大地提高了囊胚生产效率，囊胚率由30％提高至50％；对胚胎质量进行评估也显示，添加本产品后囊胚质量也优于对照组。
实施例2：牛体外受精胚胎的培养方法
参照实施例1，不同的仅是其中的胚胎后期培养液组成改为：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.0mm的nahco3、
0.5mm的mgcl2·6h2o、
1.3mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸钠、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸钙、
10v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必须氨基酸、
3mm的谷胱甘肽、和
作为配液溶剂的水。
照实施例1进行试验，结果各项指标均与实施例1中使用3mm的谷胱甘肽组基本相同，例如本实施例中桑葚胚率为0.633、囊胚率为0.508、凋亡率0.050。
实施例3：牛体外受精胚胎的培养方法
参照实施例1，不同的仅是其中的胚胎后期培养液组成改为：
110mm的nacl、
2.9mm的kcl、
26.5mm的nahco3、
1.0mm的mgcl2·6h2o、
1.0mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸钠、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸钙、
10v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必须氨基酸、
3mm的谷胱甘肽、和
作为配液溶剂的水。
照实施例1进行试验，结果各项指标均与实施例1中使用3mm的谷胱甘肽组基本相同，例如本实施例中桑葚胚率为0.636、囊胚率为0.521、凋亡率0.050。
实施例4：牛体外受精胚胎的培养方法
参照实施例1，不同的仅是其中的胚胎后期培养液组成改为：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.0mm的nahco3、
0.5mm的mgcl2·6h2o、
1.3mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸钠、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸钙、
10v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必须氨基酸、
3mm的谷胱甘肽、
枸橼酸钠0.04w/v％、
麦芽糖0.02w/v％、和
作为配液溶剂的水。
结果显示，在实施例1考察的各项指标方面，本实施例4均与实施例1中使用3mm的谷胱甘肽组基本相同，例如本实施例4中桑葚胚率为0.634、囊胚率为0.518、凋亡率0.049；另外，在第9天时统计囊胚孵化率，结果显示本实施例囊胚孵化率达71.6％；另外的统计发现，实施例1～3全部使用3mm谷胱甘肽的试验中囊胚孵化率均在36～39％范围内。
在一个补充的试验中，参照上述实施例4，不同的仅是枸橼酸钠浓度改为0.03w/v％或0.05w/v％(但麦芽糖仍为0.02w/v％)，两个试验中各项指标均与上述实施例4基本相同，例如囊胚孵化率达70.2～71.4％范围。在一个补充的试验中，参照上述实施例4，不同的仅是麦芽糖浓度改为0.01w/v％或0.03w/v％(但枸橼酸钠仍为0.04w/v％)，两个试验中各项指标均与上述实施例4基本相同，例如囊胚孵化率达71.6～72.6％范围内；这一结果表明，在胚胎后期培养液中补充添加适量枸橼酸钠和麦芽糖后能够有效地提高囊胚孵化率。在一个补充的试验中，参照上述实施例4，不同的仅是不添加枸橼酸钠(但麦芽糖仍为0.02w/v％)，或者不同的仅是不添加麦芽糖(但枸橼酸钠仍为0.04w/v％)，两个试验中除了囊胚孵化率以外的各项指标均与上述实施例4基本相同，但是囊胚孵化率显著的小，均在38～40％范围内(p<0.05，具有显著性差异)；这一结果表明，仅添加枸橼酸钠和麦芽糖二者之一时不能有效提高囊胚孵化率。
实施例5：牛体外受精胚胎的培养方法
参照实施例1，不同的仅是其中的胚胎后期培养液组成改为：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.0mm的nahco3、
0.5mm的mgcl2·6h2o、
1.3mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸钠、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸钙、
2.5v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必须氨基酸、
3mm的谷胱甘肽、
枸橼酸钠0.04w/v％、
麦芽糖0.02w/v％、和
作为配液溶剂的水。
结果显示，在实施例1考察的各项指标方面，本实施例5均与实施例1中使用3mm的谷胱甘肽组基本相同，例如本实施例5中桑葚胚率为0.628、囊胚率为0.522、凋亡率0.048；另外，在第9天时统计囊胚孵化率，结果显示本实施例囊胚孵化率达70.2％；另外的统计发现，实施例1～3全部使用3mm谷胱甘肽的试验中囊胚孵化率均在36～39％范围内。
在一个补充的试验中，参照上述实施例5，不同的仅是枸橼酸钠浓度改为0.03w/v％或0.05w/v％(但麦芽糖仍为0.02w/v％)，两个试验中各项指标均与上述实施例5基本相同，例如囊胚孵化率达69.7～71.8％范围。在一个补充的试验中，参照上述实施例5，不同的仅是麦芽糖浓度改为0.01w/v％或0.03w/v％(但枸橼酸钠仍为0.04w/v％)，两个试验中各项指标均与上述实施例5基本相同，例如囊胚孵化率达71.8～72.4％范围内；这一结果表明，在胚胎后期培养液中补充添加适量枸橼酸钠和麦芽糖后能够有效地提高囊胚孵化率。在一个补充的试验中，参照上述实施例5，不同的仅是不添加枸橼酸钠(但麦芽糖仍为0.02w/v％)，或者不同的仅是不添加麦芽糖(但枸橼酸钠仍为0.04w/v％)，两个试验中除了囊胚孵化率以外的各项指标均与上述实施例5基本相同，但是囊胚孵化率显著的小，均在36～39％范围内(p<0.05，具有显著性差异)；这一结果表明，仅添加枸橼酸钠和麦芽糖二者之一时不能有效提高囊胚孵化率。在一个补充的试验中，参照上述实施例5，不同的仅是不添加枸橼酸钠和麦芽糖，试验中除了囊胚孵化率以外的各项指标均与上述实施例5基本相同，但是囊胚孵化率显著的小，为31.3％(p<0.05，具有显著性差异)；这一结果表明，在将胎牛血清浓度降至2.5v/v％的情况下如果不添加枸橼酸钠和麦芽糖二者时不能有效提高囊胚孵化率。在一个补充的试验中，参照上述实施例5，不同的仅是胎牛血清浓度改为2v/v％或3v/v％，两个试验中各项指标均与上述实施例5基本相同，例如囊胚孵化率达70.3～71.7％范围内；这一结果表明，在胚胎后期培养液中补充添加适量枸橼酸钠和麦芽糖的情况下，即使将胎牛血清浓度降至2～3v/v％的范围时仍然能够有效地提高囊胚孵化率，此时胎牛血清这种昂贵的试剂的用量是实施例1用量的20～30％，而增加的枸橼酸钠和麦芽糖的成本是非常低的。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。