一种将胚胎肝内胆管上皮细胞诱导分化为含成熟胆管上皮细胞和胆管结构的细胞模型的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种用于细胞分化的混合胶，和用混合胶将胚胎肝内胆管上皮细胞诱导分化为含成熟胆管上皮细胞和胆管结构的细胞模型的方法。

背景技术：

先天性胆道闭锁是引起小儿阻塞性黄疸的常见疾病，预后差，病死率高，病因至今未明。先天性胆道闭锁可能由于其不成熟的胆管结构，造成肝内、肝外胆管进行性炎症等基本病理变，继而发生肝纤维化，其肝纤维化的发展比其他成人肝胆疾患更快且更具有侵袭性。因此，探究在胆道闭锁发生与发展过程中未成熟胆管上皮细胞的作用机制，尤为重要。但现有的在体外实验研究胆管上皮细胞的方法，均是从胚胎中的肝母细胞诱导分化为胆管上皮细胞，但由于肝母细胞具有双向潜能，会分化出一定比例的肝细胞与胆管上皮细胞混合于细胞培养液中，使所需的胆管上皮细胞纯度不够，影响实验结果，且这些方法操作困难、耗时长、费用高。为了更好的研究胆道闭锁疾病中胆管上皮细胞的作用机制，急需一种体外培养未成熟的胆管上皮细胞定向分化为成熟的胆管上皮细胞和胆管结构的方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，首先提供一种用于细胞分化的混合胶。

本发明的第二个目的是提供一种利用所述混合胶将胚胎肝内胆管上皮细胞诱导分化为含成熟胆管上皮细胞和胆管结构的细胞模型的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种用于体外细胞分化的混合胶，所述混合胶由基质胶和i型鼠尾胶原按照45%：55%的体积百分比混合得到；所述i型鼠尾胶原的浓度为1.1mg/ml。

本发明所述混合胶可用于细胞定向分化。

另外，本研究发现所述混合胶可用于将人种属的不成熟的胚胎肝内胆管上皮细胞诱导分化为成熟胆管上皮细胞，更好的形成管状胆管结构。

本发明还提供所述混合胶在体外制备含成熟肝内胆管上皮细胞和成熟胆管结构的细胞模型中的应用。

本发明还提供一种将胚胎肝内胆管上皮细胞诱导分化为含成熟胆管上皮细胞和胆管结构的细胞模型的方法，包括以下步骤：

s1.分别配制基质胶和浓度为1.1mg/ml的i型鼠尾胶原；

s2.将基质胶和i型鼠尾胶原按照45%：55%的体积百分比混合得混合胶，混合过程中避免气泡产生，短暂离心后将混合胶保存备用；

s3.将未成熟的肝内胆管上皮细胞与混合胶混匀得混合体系，混匀过程中避免气泡产生；

s4.将混合体系铺板孵育培养2～3h；

s5.往s4培养后的混合体系中添加胚胎肝内胆管上皮细胞培养基继续培养24～36h，添加过程中避免破坏混合体系；

s6.往s5培养后的混合体系中添加分化液，培养至胆管结构形成即得含成熟胆管上皮细胞和成熟胆管结构的细胞模型，添加过程中避免破坏混合体系。

体外培养细胞模型为复杂且操作难度大的过程，本发明在上述方法中，每次混合要防止气泡产生，每次添加培养液或分化液的时候要防止破坏原有混合体系，这些细节才能保证后期细胞分化和胆管结构形成。

为了更方便胆管结构形成以及观察混合胶中胆管上皮细胞的分化情况，优选地，s4所述铺板是指将混合体系加入到培养板（如ibidi板）中的孔中，缓慢的倾斜整个培养板，尽可能在最短时间内让混合体系均匀地平铺在培养板中，然后放入co2培养箱中孵育培养。

优选地，s1所述基质胶需在使用混合前一天在0℃过夜溶解；所述i型鼠尾胶原需要在低温（冰上）配制。

优选地，s1所述i型鼠尾胶原是以胚胎肝内胆管上皮细胞培养基作为溶剂配制得到。

优选地，s3中每1ml混合胶中有4×10⁴个未成熟的肝内胆管上皮细胞。

需要说明的是，所述方法中，s5胚胎肝内胆管上皮细胞培养基可选用现有技术中常用的胚胎肝内胆管上皮细胞培养基（epicm，货号4101），如胚胎肝内胆管上皮细胞培养基可选用上皮细胞培养基，添加epicgs和/或青霉素/链霉素溶液和/或fbs。

优选地，所述胚胎肝内胆管上皮细胞培养基epicm，添加了epicgs（货号4152），1%青霉素/链霉素（货号0503）和1～2%fbs。

所述方法中，s6所述分化液可选用现有技术中常用的人肝内胆管上皮细胞分化液，如所述分化液可选用kubota’s肝母细胞生长培养基（货号#11002-250，250ml规格，含有egf），添加hgf和/或vegf和/或fbs。

优选地，s6所述分化液的组成为：kubota’s肝母细胞生长培养基，并添加hgf、vegf和fbs，其中kubota’s肝母细胞生长培养基中hgf的浓度为10ng/ml，vegf的浓度为20ng/ml，fbs的体积百分数为5%。

与现有技术相比，本发明具有有益效果：

本发明运用3d细胞培养技术，提供了用于细胞分化的混合胶，所述混合胶由基质胶和i型鼠尾胶原按照45%：55%的体积百分比混合得到；将该混合胶与胚胎肝内胆管上皮细胞混合，可用于定向分化为成熟的肝内胆管上皮细胞和胆管结构，该方法操作简单，耗时短，成本低，且构建获得的细胞模型稳定，可用于慢性、炎性及自身免疫性等胆管疾病的治疗及机制研究。

附图说明

图1为基质胶和i型鼠尾胶原按照不同体积百分比混合后获得的细胞模型中细胞胆管结构形成情况图；其中图1a为基质胶和1.1mg/mli型鼠尾胶原按照35%：65%的体积百分比混合后胆管形成情况图；图1b为基质胶和1.1mg/mli型鼠尾胶原按照40%：60%的体积百分比混合后胆管形成情况图；图1c为基质胶和1.1mg/mli型鼠尾胶原按照45%：55%的体积百分比混合后胆管形成情况图；其中绿色荧光是γ-gt；蓝色荧光是染细胞核的dapi。

图2为胚胎肝内胆管上皮细胞诱导分化前细胞内的荧光抗体标志物的表达情况图。

图3为胚胎肝内胆管上皮细胞诱导分化后细胞内的荧光抗体标志物的表达情况图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。

本发明具体实施例中用到的人胚胎肝内胆管上皮细胞系由sciencell公司生产（产品号：5100）；显微镜：德国全电动倒置荧光显微镜leicadmi8、激光扫描共聚焦显微镜leicatcssp8

分化液组成：kubota’s肝母细胞生长培养基（货号#11002-250，250ml规格，含有egf），10ng/mlhgf，20ng/mlvegf和5%fbs。

生长液（即胚胎肝内胆管上皮细胞培养基）组成：每500ml上皮细胞培养基epicm，添加了epicgs（货号4152），1%青霉素/链霉素（货号0503）和1～2%fbs。

实施例1

一种将胚胎肝内胆管上皮细胞诱导分化为含成熟胆管上皮细胞和成熟胆管结构的细胞模型的方法，包括以下步骤：

s1.混合前一天基质胶在0℃过夜溶解，并在冰上配制浓度为1.1mg/ml的i型鼠尾胶原（i型鼠尾胶原以胚胎肝内胆管上皮细胞培养基进行稀释）；

s2.将基质胶和i型鼠尾胶原按照45%：55%的体积百分比轻轻混合制得混合胶，混合过程中避免气泡产生，短暂离心数秒后，将混合胶转移至冰上；

s3.将重悬的未成熟的肝内胆管上皮细胞与混合胶混匀得混合体系，混匀过程中避免气泡产生；

s4.将混合体系加入到ibidi板中，每孔10μl，缓慢倾斜整个ibidi板，尽可能在最短时间让混合体系均匀地平铺在板中，进而快速放入37℃co2培养箱中进行培养；

s5.2h后轻柔地添加胚胎肝内胆管上皮细胞培养基继续培养；加入时注意动作轻柔，防止将凝固的混合胶冲下来；

s6.24h后更换为分化液培养至胆管结构形成即得含成熟胆管上皮细胞和成熟胆管结构的细胞模型，更换分化液时也注意动作轻柔，防止将凝固的混合胶冲下来。

图2和图3表明：在诱导分化前后，afp、alb不表达；ck19、ggt强阳性表达，即胚胎肝内胆道上皮细胞被诱导分化为成熟的胆道上皮细胞，且在混合胶中形成胆管样结构，且形成体系稳定。

对比例1

实验方法同实施例1，唯一不同的是：本实施例所述基质胶和i型鼠尾胶原按照100%：0%的体积百分比混合（即不添加i型鼠尾胶原）。

对比例2

实验方法同实施例1，唯一不同的是：本实施例所述基质胶和i型鼠尾胶原按照35%：65%的体积百分比混合（i型鼠尾胶原的浓度为1.1mg/ml）。

对比例3

实验方法同实施例1，唯一不同的是：本实施例所述基质胶和i型鼠尾胶原按照40%：60%的体积百分比混合（i型鼠尾胶原的浓度为1.1mg/ml）。

将对比例2到对比例3所得混合胶按照实施例1相同的方法培养未成熟的肝内胆管上皮细胞，并与实施例1相比，其细胞成管能力如图1所示，随着基质胶和i型鼠尾胶原的混合体积比的改变，细胞模型逐渐稳定和完善，换句话说只有在45%：55%才能构建我们所需要的理想模型。与图1c相比，图1a和图1b中的细胞形态极为不规则，形成的管状结构边界不清晰，混合胶中的细胞不成形的节断比较多，混合胶在免疫荧光的染色过程中也很容易脱落，图1c所示的整个细胞模型形成体系更为稳定。