专利名称：一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物细胞工程中诱导单倍体胚胎发生的培养基。特别是涉及一种诱导大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基及在诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的应用。
背景技术：
黄瓜是我国人民喜食的蔬菜品种之一。黄瓜的杂交育种已取得很大成绩，先后育成的四代黄瓜品种津研、津杂、津春、津优，已占全国黄瓜种植面积的80％以上。目前采用的常规杂交育种方法，首先需要培育性状优良的自交系亲本，由于杂种后代的不断分离，获得一个稳定的自交系需要进行至少6～8代的连续自交和选择，一般花费3-4年时间，到最终育成一个杂交品种通常需要5～8年的时间，费时、费力。
单倍体育种技术是缩短育种周期，提高育种效率的有效手段。单倍体植株加倍获得的双单倍体植株(加倍的单倍体)不仅育性恢复，而且在遗传上是纯合稳定的，以性状表现优良的双单倍体植株作为亲本材料，与常规育种相结合，进行杂交品种选育，可以大大缩短育种年限，1～2年即可获得稳定的纯系。育成一个杂交品种可以由原来的5～8年缩短到3～4年，显著提高育种效率。另外，通过单倍体技术获得的DH(加倍单倍体)群体，对分子遗传图谱构建及分子标记的研究具有特殊的应用价值。因此单倍体技术对育种和遗传学研究都具有十分重要的意义。
单倍体技术已在大麦和水稻等禾本科作物、白菜和油菜等十字花科作物及辣椒等作物上大规模应用，在育种实践中显示出了明显优势。
黄瓜单倍体植株自然发生率极低，低于0.1％，无法应用于育种实践。为了大量获得单倍体，研究者采用了人工诱导单倍体的方法。Truong-Andre(1988)，杜胜利等(1997)报道了以辐射花粉授粉途径诱导黄瓜单倍体发生子房以辐射花粉授粉后，摘取2-6周的授粉子房，拨出胚珠进行培养，获得了黄瓜单倍体植株，但每千个胚珠只能产生3个单倍体植株，无法应用于育种。Sasser和Lazarte，(1982)报道以花药培养的方法诱导黄瓜单倍体发生，获得再生植株，但其较多可能由体细胞发育而来，没有进行再生植株的倍性鉴定。Dirks和Robert(1996)申报美国专利，在世界上首次通过未受精子房培养的方法诱导黄瓜单倍体胚胎发生，获得黄瓜单(双单)倍体植株，单倍体胚胎再生频率为80％。但其存在以下不足①试验材料均为欧洲光滑类型黄瓜，而欧洲光滑类型黄瓜与中国刺瘤类型黄瓜基因型差异较大，我们所作研究主要针对中国刺瘤类型黄瓜，因此其方法在应用上存在局限性；②黄瓜单倍体胚胎发生诱导培养基根据材料的单性结实能力须做调整单性结实能力强的品种需添加细胞分裂素，低浓度生长素；非单性结实的品种需添加生长素。说明该诱导培养基诱导黄瓜单倍体胚胎发生受基因型差异影响较大；③单倍体胚胎再生频率为80％，但大部分再生小植株为单倍体，需秋水仙碱诱导加倍获得二倍体植株，才能应用于育种，而加倍过程时间较长，且对再生植株产生伤害，造成死苗。Gemes和Juhasz(2002)报道在培养初期短期高温处理，有利于未受精子房培养诱导黄瓜单倍体发生，单倍体胚胎发生频率为7.1％-18.4％，没有报道植株再生频率以及再生植株的倍性情况。目前国内外尚未见关于黄瓜单倍体诱导的其它研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基。
本发明的第二个目的是提供一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基的应用。
本发明的技术方案概述如下一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基，包括以下组分KNO3300～2000mg；CaCl2.H2O 100～300mg；MgSO4.7H2O 50～300mg；KH2PO4100～420mg；(NH4)2SO450～400mg；MnSO45～20mg；ZnSO45～15mg；H3BO36～15mg；KI0.5～1.5mg；FeSO4.7H2O 27.8mg；Na2EDTA.2H2O 37.3mg；肌醇 50～200mg；维生素B10.1～2.0mg；维生素B60.5～4.0mg；烟酸 0.5～5.0mg；甘氨酸 1～5mg；生长素 0.2～1.0mg；细胞分裂素 1.0～3.0mg；蔗糖 30g；琼脂 7g；PH5.8，加水至一升，按常规方法制成培养基。
一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基，优选的组分为KNO3为750mg，CaCl2H2O为165mg，MgSO4.7H2O为75mg，KH2PO4为170mg，(NH4)2SO4为120mg，MnSO4为10.5mg，ZnSO4为8.6mg；H3BO3为7.2mg，KI为0.83mg，FeSO4.7H2O 27.8mg；Na2EDTA.2H2O 37.3mg；肌醇为130mg，维生素B1为0.5mg，维生素B6为1.0mg，烟酸为2.0mg，甘氨酸为2.0mg，生长素为0.4mg，细胞分裂素为2.5mg；蔗糖30g，琼脂7g；PH5.8，加水至一升，按常规方法制成培养基。
在上述组分中还可以加入维生素H0.1-2.0mg，抗坏血酸1-5mg，水解乳蛋白0.2-1.0mg。
所述生长素为吲哚乙酸或萘乙酸或二氯苯氧乙酸。
所述细胞分裂素为6-苄基腺嘌呤或激动素或玉米素。
一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基的应用，包括如下步骤将供体基因型材料种植于温室或大棚，取开花前2-3天的未受精子房，表面灭菌后，横切，厚2-3mm的组织接种于权利要求1所述的培养基中，置于培养室23℃～27℃，最好选25℃，每天12～16小时光照，最好选14小时，每天8～12小时黑暗，最好选10小时，光照强度1500～1700勒克斯，最好为1600勒克斯，进行培养，40天后陆续观察到胚胎或愈伤组织出现，即诱导了黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生。将幼小胚胎或愈伤组织继代到分化培养基中成苗。
本发明的一种诱导黄瓜大孢子(未受精子房)离体单倍体胚胎发生的培养基命名为C99。
本发明的特点是1.本发明的培养基组成成分不同于以往研究报道；2.应用本发明的培养基培养中国刺瘤型黄瓜品种，植株再生频率达15％，且再生植株中自然加倍而成的双单倍体植株频率高于80％，显著高于以往文献报道。3.本发明的一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基，特别适于接种国内刺瘤类型黄瓜，可用于温室、大棚、露地品种黄瓜大孢子离体单倍体诱导，经田间筛选后可直接作为育种材料，应用于育种。
图1为应用本发明培养基培养6天的大孢子(未受精子房)切片图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基，包括以下组分KNO3为750mg，CaCl2.H2O为165mg，MgSO4.7H2O为75mg，KH2PO4为170mg，(NH4)2SO4为120mg，MnSO4为10.5mg，ZnSO4为8.6mg；H3BO3为7.2mg，KI为0.83mg，FeSO4.7H2O 27.8mg；Na2EDTA.2H2O 37.3mg，肌醇为130mg，维生素B1为0.5mg，维生素B6为1.0mg，烟酸为2.0mg，甘氨酸为2.0mg，吲哚乙酸为0.4mg，6-苄基腺嘌呤为2.5mg，蔗糖30g，琼脂7g，PH5.8，加水至一升，按常规方法制成培养基。
实施例2一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基，包括以下组分KNO3为550mg，CaCl2.H2O为165mg，MgSO4.7H2O为190mg，KH2PO4为100mg，(NH4)2SO4为120mg，MnSO4为10.5mg，ZnSO4为8.6mg；H3BO3为7.2mg，KI为0.83mg，FeSO4.7H2O 27.8mg；Na2EDTA.2H2O 37.3mg，肌醇为130mg，维生素B1为0.5mg，维生素B6为1.0mg，烟酸为2.0mg，甘氨酸为2.0mg，萘乙酸为0.3mg，激动素为2.0mg，蔗糖30g，琼脂7g，PH5.8，加水至一升，按常规方法制成培养基。
实施例3一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基，包括以下组分KNO3为300mg，CaCl2.H2O为300mg，MgSO4.7H2O为50mg，KH2PO4为150mg，(NH4)2SO4为400mg，MnSO4为5mg，ZnSO4为5mg；H3BO3为6mg，KI为1.0mg，FeSO4.7H2O 27.8mg；Na2EDTA.2H2O 37.3mg，肌醇为200mg，维生素B1为0.1mg，维生素B6为0.5mg，烟酸为3.0mg，甘氨酸为1.0mg，萘乙酸为0.2mg，激动素为1.0mg，蔗糖30g，琼脂7g，PH5.8，加水至一升，按常规方法制成培养基。
实施例4一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基，包括以下组分KNO3为2000mg，CaCl2.H2O为100mg，MgSO4.7H2O为300mg，KH2PO4为100mg，(NH4)2SO4为50mg，MnSO4为20mg，ZnSO4为15mg；H3BO3为15mg，KI为0.5mg，FeSO4.7H2O 27.8mg；Na2EDTA.2H2O 37.3mg，肌醇为50mg，维生素B1为2.0mg，维生素B6为4.0mg，烟酸为0.5mg，甘氨酸为5.0mg，二氯苯氧乙酸为1.0mg，玉米素为3.0mg，蔗糖30g，琼脂7g，PH 5.8，加水至一升，按常规方法制成培养基。
实施例5一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基，包括以下组分KNO3为750mg，CaCl2.H2O为165mg，MgSO4.7H2O为75mg，KH2PO4为420mg，(NH4)2SO4为150mg，MnSO4为15mg，ZnSO4为10mg，H3BO3为7.2mg，KI为1.5mg，FeSO4.7H2O 27.8mg，Na2EDTA.2H2O 37.3mg，肌醇为150mg，维生素B1为1.0mg，维生素B6为2.0mg，烟酸为5.0mg，甘氨酸为5.0mg，吲哚乙酸为0.8mg，6-苄基腺嘌呤为2.5mg，维生素H为0.1mg，抗坏血酸为1mg，水解乳蛋白为1.0mg，蔗糖30g，琼脂7g，PH5.8，加水至一升，按常规方法制成培养基。
实施例6一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基，包括以下组分KNO3为750mg，CaCl2H2O为165mg，MgSO4.7H2O为75mg，KH2PO4为420mg，(NH4)2SO4为150mg，MnSO4为15mg，ZnSO4c为10mg，H3BO3为7.2mg，KI为1.5mg，FeSO4.7H2O 27.8mg，Na2EDTA.2H2O 37.3mg，肌醇为150mg，维生素B1为1.0mg，维生素B6为2.0mg，烟酸为5.0mg，甘氨酸为5.0mg，吲哚乙酸为0.8mg，6-苄基腺嘌呤为2.5mg，维生素H为2.0mg，抗坏血酸为5mg，水解乳蛋白为0.2mg，蔗糖30g，琼脂7g，PH5.8，加水至一升，按常规方法制成培养基。
实施例7一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基的应用，包括如下步骤1、取材将供体基因型材料种植于温室、大棚内，以花冠微露黄色、闭和而即将开始展开的未受精子房为材料，将材料分为大(开花前1天)，中(开花前2-3天)，小(开花前4天)三种类型，大和中两种类型子房可诱导黄瓜单倍体产生。
2、灭菌先用75％乙醇表面灭菌30s，然后用20％次氯酸钙灭菌15分钟，再用无菌水冲洗3-4次，去除材料表面的细菌、真菌等微生物，使其成为无菌材料。
3、接种将无菌材料横切或纵切，厚2-3mm的组织接种于实施例1所述的培养基中，因材料基因型不同，切片方式对单倍体胚胎再生频率会产生影响，须选择适宜的切片方式，置于培养室25℃，每天14小时光照/10小时黑暗，光照强度1600勒克斯培养。
4、培养结果培养40-50天后，可见幼小胚芽或愈伤团出现，二者均可在原培养基上继续培养，形成小植株，或将愈伤团继代至分化培养基上，分化形成大量胚芽，继续培养形成小植株。
5、细胞学观察将不同培养天数的子房取样，制作石蜡切片观察。胚胎分化在培养的初期即开始启动，图1为培养6天的大孢子(未受精子房)切片图，图中心处为胚囊内分化的单倍体原胚，分化细胞起源于胚囊内，未见珠被等体细胞增生。
6、倍性鉴定单倍体与双单倍体再生小植株的田间形态差异明显单倍体植株叶片小，花瓣小且深裂，植株弱小，移栽较难成活，不育；双单倍体小植株形态表现与正常二倍体植株相同，叶片正常，花瓣大、浅裂，植株健壮，移栽易成活，育性恢复，后代性状表现一致，不发生分离。此种方法对于小植株倍性鉴定简便、易行。叶片保卫细胞叶绿体数目、细胞染色体异染色质数量与植株倍性具有相关性，可作为倍性鉴定的依据。
7、再生频率单(双单)倍体植株再生率可达15％(每100个子房数)。黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生已形成完整的培养体系，工作程序简化，平均每人每天可接种500个子房，获得约75株再生小植株，为单倍体技术应用于育种提供了技术保障。
本试验研究结果摘录如下
说明方法1为实施例7所述方法；方法2为采用Gemes和Juhasz(2002)文献报道所述方法和培养基。
由上表可见，采用方法1的植株再生率和双单倍体植株率明显高于文献报道方法的应用结果。
实施例8一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基的应用，包括如下步骤将供体基因型材料种植于温室或大棚，取开花前2天的未受精子房，表面灭菌后，横切，厚2-3mm的组织接种于实施例2所述的培养基中，置于培养室23℃，每天12小时光照/12小时黑暗，光照强度1500勒克斯培养，40天后陆续观察到胚胎或愈伤组织出现，即诱导了黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生。将幼小胚胎或愈伤组织继代到分化培养基中成苗。
实施例9一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基的应用，包括如下步骤将供体基因型材料种植于温室或大棚，取开花前2天的未受精子房，表面灭菌后，横切，厚2-3mm的组织接种于实施例3所述的培养基中，置于培养室27℃，每天16小时光照/8小时黑暗，光照强度1700勒克斯培养，40天后陆续观察到胚胎或愈伤组织出现，即诱导了黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生。将幼小胚胎或愈伤组织继代到分化培养基中成苗，最终获得单(双单)倍体植株。
分化培养基组成及成分MS大量元素，MS微量元素，MS有机，MS铁盐，6-苄基腺嘌呤0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，余量为水，PH5.8。
附MS培养基成分(包含MS大量元素，MS微量元素，MS有机，MS铁盐)NH4NO31650mg/L；KNO31900mg/L；KH2PO4170mg/L；CaCl2.2H2O 440mg/L；MgSO4.7H2O370mg/L；FeSO4.7H2O 27.8mg/L；Na2EDTA.2H2O 37.3mg/L；MnSO44H2O 22.3mg/L；ZnSO4.7H2O 8.6mg/L；H3BO36.2mg/L；KI 0.83mg/L；Na2MoO4.2H2O 0.25；CuSO4.5H2O0.025mg/L；CoCl2.6H2O 0.025；肌醇100mg/L；甘氨酸2mg/L；维生素B10.4mg/L；维生素B60.5mg/L；烟酸0.5mg/L。
权利要求
1.一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基，其特征是包括以下组分KNO3300～2000mg；CaCl2.H2O 100～300mg；MgSO4.7H2O 50～300mg；KH2PO4100～420mg；(NH4)2SO450～400mg；MnSO45～20mg；ZnSO45～15mg；H3BO36～15mg；KI0.5～1.5mg；FeSO4.7H2O27.8mg；Na2EDTA.2H2O37.3mg；肌醇50～200mg；维生素B10.1～2.0mg；维生素B60.5～4.0mg；烟酸0.5～5.0mg；甘氨酸1～5mg；生长素0.2～1.0mg；细胞分裂素1.0～3.0mg；蔗糖30g；琼脂7g；PH 5.8，加水至一升，按常规方法制成培养基。
2.根据权利要求1所述一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基，其特征是所述KNO3为750mg，所述CaCl2H2O为165mg，所述MgSO4.7H2O为75mg，所述KH2PO4为170mg，所述(NH4)2SO4为120mg，所述MnSO4为10.5mg，所述ZnSO4为8.6mg；所述H3BO3为7.2mg，所述KI为0.83mg，肌醇为130mg，维生素B1为0.5mg，维生素B6为1.0mg，烟酸为2.0mg，甘氨酸为2.0mg，生长素为0.4mg，细胞分裂素为2.5mg。
3.根据权利要求1或2所述一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基，其特征是包括维生素H 0.1-2.0mg，抗坏血酸1-5mg，水解乳蛋白0.2-1.0mg。
4.根据权利要求1或2所述一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基，其特征是所述生长素为吲哚乙酸或萘乙酸或二氯苯氧乙酸。
5.根据权利要求1或2所述一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基，其特征是所述细胞分裂素为6-苄基腺嘌呤或激动素或玉米素。
6.一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基的应用，其特征是包括如下步骤将供体基因型材料种植于温室或大棚，取开花前2-3天的未受精子房，表面灭菌后，横切，厚2-3mm的组织接种于权利要求1所述的培养基中，置于培养室23℃～27℃，每天12～16小时光照/8～12小时黑暗，光照强度1500～1700勒克斯培养，40天后陆续观察到胚胎或愈伤组织出现，将幼小胚胎或愈伤组织继代到分化培养基中成苗，即诱导了黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生。
7.根据权利要求6所述一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基的应用，其特征是所述培养室的温度为25℃，所述光照时间为14小时，所述黑暗时间为10小时，所述光照强度为1600勒克斯。
全文摘要
本发明公开了一种诱导黄瓜大孢子离体单倍体胚胎发生的培养基及应用，培养基包括不同含量的KNO
文档编号C12N5/04GK1737122SQ200510014670
公开日2006年2月22日 申请日期2005年7月29日 优先权日2005年7月29日
发明者杜胜利, 魏爱民, 韩毅科, 张历, 王艳飞 申请人:天津科润农业科技股份有限公司