一种诱导楸树体细胞胚发生的方法
【专利摘要】本发明提供一种诱导楸树体细胞胚发生的方法，该方法是将成熟的楸树种子经过消毒后，放置于诱导愈伤的培养基中经过暗培养生成愈伤组织，然后愈伤经过继代增殖培养后获得大量的愈伤，最后将愈伤平铺于诱导培养基中诱导楸树体细胞胚的发生。本发明为楸树利用转基因技术培育抗病虫的新品种提供了一个成熟的再生体系。
【专利说明】一种诱导楸树体细胞胚发生的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物工程技术的方法，尤其涉及一种植物组织培养技术，具体为 楸树体细胞胚的诱导发生。
【背景技术】
[0002] 楸树（Catalpa bungei)为紫葳科（Bignoniaceae)梓属（Catalpa)高大乔木，原产 中国，已有2000多年的栽培历史。楸树树体高大挺拔，树冠浓密，枝、叶和花都具有很高的 观赏价值，其木材质地坚韧致密，不易虫蛀、耐磨、耐腐、隔潮，具有极高的经济价值，在中国 丰富的树木资源中，惟其"材"貌双全，自古素有"木王"之美称。楸树的适应性强，分布于 我国东起海滨，西至甘肃，南始云南，北到长城的广大区域内，是可以大面积栽培的优良珍 贵的用材树种。近年来楸树病虫害比较严重，限制了楸树的大面积推广。因此利用转基因 技术培育抗病虫楸树新品种对楸树人面积的推广具有重要的意义。
[0003] 高频率的再生体系是转基因技术的关键技术之一。目前，楸树的再生体系主要以 器官发生途径为主，但该体系产生的嵌合体较多。体细胞胚胎发生是在离体培养条件下，植 物离体培养的细胞、组织、器官可以产生类似于胚的结构，其形成过程也经历一个类似于胚 胎发生和发育的过程。在木本植物上，体细胞胚胎发生的研究始于上世纪70年代后期，在 80年代后期得到了迅猛发展。近年来，随着分子生物学技术的迅猛发展及其在体细胞胚胎 研究中的应用，植物体细胞胚胎发生技术不仅成为植物快速繁殖的最重要的手段，而且已 发展成为植物胚胎发生机理、遗传转化的重要系统。目前关于楸树体细胞胚诱导的研究还 鲜有报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为楸树利用转基因技术培育抗病虫的新品种提供一个成熟的再 生体系。
[0005] 本发明是通过以下实验步骤实现的：
[0006] (1)楸树成熟种子处理
[0007] 将楸树成熟的种子用纱布包好后用自来水冲洗30min，接着75%酒精表面灭菌 60s，无菌水冲洗2次后用0. 1 %氯化汞溶液灭菌12min，无菌水冲洗6次。接种时剪开纱布， 将种子两端边缘种皮略微剪破接种。
[0008] ⑵愈伤组织诱导
[0009] 将处理过的楸树种子平铺于1/2MS+0. 3-0. 5mg · L玉米素+0· 3?0· 9mg · L吲哚 乙酸的诱导愈伤的培养基上，培养基放置于温度25?28°C，无光照的培养室中暗培养20d 后获得愈伤组织。
[0010] (3)愈伤组织的继代增殖培养
[0011] 将愈伤组织放置在相同的诱导愈伤的培养基上，在光强为15001uX，光照时间是 12h/d，温度25?28°C培养室中培养10d。
[0012] (4)体细胞胚的诱导
[0013] 选择浅黄色、紧致、表面上呈颗粒状的愈伤组织，切成0. 5X0. 5X0. Scm的小块， 放置于MS+0. 5-3. Omg · L激动素+0. 05mg · L吲哚乙酸的诱导体细胞胚的培养基上，在光强 为15001ux，光照时间是12h/d，温度25?28°C培养室中诱导楸树体细胞胚发生。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1 :楸树成熟种子处理后接入培养基。
[0015] 图2 :楸树成熟种子经暗培养20d后诱导的愈伤组织。
[0016] 图3 :继代增殖培养10d后的楸树愈伤组织。
[0017] 图4 :愈伤组织诱导30d后楸树体细胞胚发生。
【具体实施方式】：
[0018] (1)楸树成熟种子处理
[0019] 将楸树成熟的种子用纱布包好后用自来水冲洗30min，接着75 %酒精表面灭菌 60s，无菌水冲洗2次后用0. 1 %氯化汞溶液灭菌12min，无菌水冲洗6次。接种时剪开纱布， 将种子两端边缘种皮略微剪破接种。接种时剪开纱布，将种子两端边缘种皮略微剪破接种。 每瓶接3个种子，每处理30瓶，重复3次。
[0020] (2)愈伤组织诱导
[0021] 将处理过的楸树种子平铺于1/2MS+0. 3-0. 5mg · L玉米素+0· 3?0· 9mg · L吲哚 乙酸的诱导愈伤的培养基上，培养基添加蔗糖3%，调节PH = 5. 8,培养基放置于温度25? 28°C，无光照的培养室中暗培养20d后获得愈伤组织。
[0022] (3)愈伤组织的继代增殖培养
[0023] 将子叶上的愈伤切下放置在相同的诱导愈伤的培养基上，在光强为15001UX，光照 时间是12h/d，温度25?28°C培养室中培养10d。
[0024] (4)体细胞胚的诱导
[0025] 选择浅黄色、紧致、表面上呈颗粒状的愈伤组织，切成0. 5X0. 5X0. 5cm的小块， 放置于MS+0. 5-3. Omg · L激动素+0. 05mg · L吲哚乙酸的诱导体细胞胚的培养基上，培养基 添加蔗糖3%，调节PH = 5. 8,在光强为15001ux，光照时间是12h/d，温度25?28°C培养室 中培养30d获得楸树体细胞胚。
【权利要求】
1. 一种诱导楸树体细胞胚发生的方法，包括下列步骤： (1)楸树成熟种子处理 将楸树成熟的种子用纱布包好后用自来水冲洗30min，接着75%酒精表面灭菌60s，无 菌水冲洗2次后用0. 1 %氯化汞溶液灭菌12min，无菌水冲洗6次。接种时剪开纱布，将种 子两端边缘种皮略微剪破接种。（2)愈伤组织诱导 将处理过的楸树种子平铺于诱导愈伤的培养基上，培养基放置于温度25?28°C，无光 照的培养室中暗培养20d后获得愈伤组织。 (3) 愈伤组织的继代增殖培养 将愈伤组织放置在相同的诱导愈伤的培养基上，在光强为15001UX，光照时间是12h/ d，温度25?28°C培养室中培养10d。 (4) 体细胞胚的诱导 选择活力高的愈伤组织将其切成合适的小块后放置于诱导体细胞胚的培养基上，在光 强为15001ux，光照时间是12h/d，温度25?28°C培养室中诱导楸树体细胞胚发生。
2. 如权利要求1 (2)中所述的诱导愈伤的培养基，其特征是1/2MS+0. 3-0. 5mg · L玉米 素+0. 3?0. 9mg · L吲哚乙酸。KT为激动素。
3. 如权利要求1(4)中所述的活力高的愈伤组织，其特征是浅黄色、紧致、表面上呈颗 粒状的愈伤组织。
4. 如权利要求1(4)中所述的诱导体细胞胚的培养基，其特征是MS+0. 5-3. 0mg*L激动 素+0· 05mg · L卩引哚乙酸。
5. 如权利要求1(4)中所述合适的小块，其特征是愈伤大小为0. 5X0. 5X0. 5cm。
【文档编号】A01H4/00GK104041418SQ201410327692
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】王鹏, 杨如同, 李亚, 马玲玲, 汪庆, 李林芳 申请人:江苏省中国科学院植物研究所