基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法及培育基体的制作方法
【专利摘要】一种基于一次成苗的杂种果树胚试管培育方法及培育基质，无菌杂种胚的获得：把果树种子的种胚进行消毒处理得到无菌杂种胚样本；试管植株的获得：在装有培养基质的试管内，把无菌杂种胚进行培养，获得胚萌发的植株得到试管植株；试管外植株苗体的获得：当试管植株的胚根上已生长形成若干侧根并且大部分胚芽已生长形成10 cm以上的新梢；移栽到试管外育苗基质中，培育得到试管外植株，在试管内培养基质中培育得到种胚萌发的试管植株，在试管外育苗基质中培育得到室外正常生长的植株，不再直接播种果树种子，因此提高了杂交桃树种子的出苗率。
【专利说明】基于一次成苗的桃树杂种化试管培育方法及培育基体
[000。 一、技术领域 本发明设及一种桃树杂种胚试管培育方法及培育基体，尤其是一种基于一次成苗的桃 树杂种胚试管培育方法及培育基体。
[000^ 二、【背景技术】 植物的胚培养在克服远缘杂交种胚的早期败育、胚挽救、诱导体细胞胚的发生及化木 快繁等方面具有重要作用，特别是在核果类果树作物如桃、杏、樓桃等的早熟品种上，借助 于胚培养技术，可成功实现幼胚即未成熟胚培养成苗，是实现核果类果树特早熟品种培育 的基础，因此杂种桃胚试管培育方法及培育基体是一种重要的生物育种方法和育种基质， 在现有的一种基于一次成苗的杂种果树胚试管培育方法及培育基体中，因为早熟果树品种 的胚通常发育不全，采用常规播种不能出苗或萌芽率很低，而采用胚培养技术可W克服种 胚不出苗的难题，但一些针对品质或抗性改良进行果树杂交育种的杂种，即使杂种胚已经 发育成熟，常规播种也不能出苗或出苗率很低，运一问题严重阻碍了果树品种改良的育种 进程。。
[0003] Ξ、
【发明内容】
本发明的客体是一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法， 本发明的客体是一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育基体。
[0004] 为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种基于一次成苗的杂种果树胚试 管培育方法及培育基体，因此提高了杂交果树种子的发苗率。
[0005] 为达到上述目的，本发明采取的技术方案是:一种基于一次成苗的杂种果树胚试 管培育方法，其步骤是:a、无菌杂种胚的获得:把果树种子的种胚进行消毒处理得到无菌杂 种胚样本； b、试管植株的获得:在装有试管内培养基质的试管内，把无菌杂种胚进行培养，获得胚 萌发的植株得到试管植株； C、试管外植株苗体的获得:当试管植株的胚根上已生长形成若干侧根并且大部分胚芽 已生长形成10 cmW上的新梢;移栽在试管外育苗基质中，培育得到试管外植株。
[0006] 由于设计了对果树种子的种胚进行分步培育，在试管内培养基质中培育得到试管 植株，在试管外育苗基质中培育得到室外正常生长的植株，不再直接种植果树种子，因此提 高了杂交果树种子的发苗率。
[0007] 本发明设计了，其步骤是:选取桃优系'93'X '春雪'杂交种的成熟果实的胚为培 育样本， a、 无菌杂种胚的获得:在超净台上用70%酒精擦洗果实表面，用灭菌刀切开果实取核， 用灭菌键子砸开核取出种胚，用无菌綴子剥去种皮，把去种皮的胚用浓度为100m/l-500mg/ L的赤霉素即GA3进行预处理得到无菌杂种胚样本； b、 试管植株的获得:去种皮胚经过100mA-500mg/L的赤霉素预处理0.5-3小时后的无 菌杂种胚样本接种在装有培养基质:MS + 1-5 mg/L GA3 + 25-35 g/L薦糖的试管内，在培 养室进行培养，获得胚萌发的植株得到试管植株； c、试管外植株苗体的获得:当试管植株在试管内培养4-6周时，胚已萌发生长成为绿苗 体，绿苗体表现为:胚根上已生长形成若干侧根并且大部分胚芽已生长形成10 cmW上的新 梢； 绿苗体进行试管外移栽，移栽前，先把瓶盖打开，在溫度为20-25 Γ的散射阳光下练苗 5-7天，用綴子把苗从瓶中取出，放入水盆中，洗掉根部残余培养基，移栽入装有试管外育苗 基质的营养鉢中，苗移栽入营养鉢后，诱透水，用透明性好的塑料縛膜进行覆盖，对刚移栽 的小苗进行保湿处理，W后每隔3-5天喷一次水，3-4周时，小苗长出新叶，此时可掲去塑料 縛膜得到试管外植株。
[000引本发明设计了，试管内培养基质设置为包含有基本培养基、植物生长调节物质即 赤霉素化A3)、碳源即薦糖、抗氧化剂即半脫氨酸和抗坏血酸、无离子水、琼脂粉； 其中：基本培养基设置为MS(MurashigeandSkoog)培养基，MS基本培养基组成为：
本发明设计了，试管外育苗基质设置为包含有草炭、赔石、珍珠岩，按照重量比例，草炭 :赔石:珍珠岩=2:0.8-1.1:0.9-1.2。
[0009] 本发明设计了，试管内培养基质在灭菌前调抑值到5.8,然后在12rc，l个大气压 下高压灭菌20分钟。
[0010] 本发明设计了，培养环境的培养溫度设置为25 ± 2°C并且培养环境的光照周期 设置为16小时/天。
[0011] 本发明设计了，桃树杂种设置为桃树或油桃。
[0012] 本发明设计了，其步骤是： a、 无菌杂种胚的获得:取桃优系'93' X '春雪'杂交种的成熟果实，剔除烂果，在超净台 上用70%酒精擦洗果实表面，用灭菌刀切开果实取核，用灭菌键子砸开核，取出种胚放在无 菌培养皿内，用无菌綴子剥去种皮，把去种皮的胚用浓度为l〇〇m/l-500mg/L的赤霉素(GA3) 进行预处理0.5 -3小时； b、 试管植株的获得:经过赤霉素预处理的胚接种到装有胚培养基:MS + 1-5 mg/L GA3 + 25-35g/L薦糖的试管中，每管接种1个胚，接种后的试管放在培养室培养，培养室培养溫 度为25 ± 2°C，光照周期为16小时/天，光照强度为3000勒克斯； C、试管外植株苗体的获得:胚培养4-6周时，胚根产生较多侧根，苗高也大都在10 cm W上，此时可W进行移栽，移栽前，先把瓶盖打开，放在溫度为20-25°C的散射阳光下练苗5- 7天，然后把苗移到溫室，用长綴子把苗从试管中取出，放入水盆中，洗掉根部残余培养基， 移栽入装有育苗基质的营养鉢中，育苗基质为草炭:赔石:珍珠岩=2:0.8-1.1:0.9-1.2，苗 移栽入营养鉢后，诱透水，用透明性好的塑料縛膜进行覆盖，目的是对刚移栽的小苗进行保 湿，W后每隔3-5天喷一次水，3-4周时，小苗长出新叶，表明植株已经成活，此时可掲去塑料 縛膜。
[0013] 本发明设计了，一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育基体，设置为包含有试 管内培养基质和试管外育苗基质，试管内培养基质设置为包含有基本培养基、植物生长调 节物质、碳源、抗氧化剂、无离子水、琼脂粉； 其中：基本培养基设置为MS(Murashige and Skoog)培养基，MS基本培养基组成为：
试管外育苗基质设置为包含有草炭、赔石、珍珠岩，按照重量比例，草炭:赔石:珍珠岩= 2:0.8-1.1:0.9-1.2。
[0014] 本发明设计了，植物生长调节物质设置为赤霉素(GA3)，碳源设置为薦糖，抗氧化 剂设置为半脫氨酸或抗坏血酸。
[0015] 本发明的技术效果在于：如在我们针对品质改良进行的桃杂交育种中发现，我们 虽然获得了充分发育成熟的杂种种子，但是采用常规播种方法，很难成苗，连续两年播种， 出苗率都在8%W下，运一问题直接影响了我们桃杂交育种工作的进行，影响了对桃品种进 行遗传改良的育种进程。因此迫切需要解决杂种胚难成苗的问题。借助试管胚培养技术是 实现胚成苗的有效方法。现有的幼胚培养方法不适宜于成熟胚的培养，而成熟胚的培养仅 在培养胚芽萌发方面有少量研究报道，胚芽萌发成苗后还需生根培养，才能形成一完整植 株，然后移栽于试管外，运一方法费时费工，胚成苗效率低。使胚培养一次形成一株和常规 播种一样的胚根和胚芽都生长的植株，运一方面显有报道。需要研究开发一种适宜难成苗 的桃杂种成熟胚一次成苗的试管培养方法，为采用杂交育种方法进行桃品种改良奠定技术 基础。我们项目组选用中晚熟黄肉桃优系'93'（风味好但偏酸)和早熟白肉桃优良品种'春 雪'（品质好风味甜）进行杂交，获得了种子饱满成熟的杂种胚。杂种经冷藏后进行常规播 种，结果出苗率很低，出苗率不足8%，连续两年常规播种的结果相同。运一结果表明，采用常 规播种方法，很难获得运一组合的杂种实生苗。本专利的发明目的就是解决桃优系'93'和 '春雪'运一杂交组合获得的杂交种子常规播种出苗率极低的问题，培养杂种胚成苗，为进 行桃品种改良的杂交育种工作提供技术基础。本专利技术的优点是针对桃优系'93' X '春 雪'杂交种的种子田间常规播种不能出苗或出苗率低（出苗率在8%W下)运一问题，能有效 提高出苗率，出苗率达90%W上，并成功获得了桃杂种胚萌发生长的健壮植株。本专利技术 可用于桃杂交种的种胚在田间播种时不能出芽时的胚的抢救与培养，为桃常规杂交育种进 行品种改良提供有效技术支持。
[0016] 在本技术方案中，果树种子的种胚进行试管内培养和试管外培育的分步培育的技 术特征为重要技术特征，在基于一次成苗的杂种果树胚试管培育方法及培育基体的技术领 域中，具有新颖性、创造性和实用性，在本技术方案中的术语都是可W用本技术领域中的专 利文献进行解释和理解。
[0017] 四、【附图说明】 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技 术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据 运些附图获得其他的附图。
[0018] 图1为桃优系'93' X '春雪'杂交种的接种后培养不同时间胚萌发生长状态图： 其中：图A:培养7天萌发生长状态图、图B:培养14天萌发生长状态图、图C:培养21天萌 发生长状态图， 图2为油桃胚萌发生长状态图。
[0019] 五、【具体实施方式】 根据审查指南，对本发明所使用的诸如"具有"、"包含"W及"包括"术语应当理解为不 配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0020] 下面结合实施例，对本发明进一步描述，W下实施例旨在说明本发明而不是对本 发明的进一步限定。一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，第一个实施例，其步骤 是:选取桃优系'93' X '春雪'杂交种的成熟果实的胚为培育样本， a、 无菌杂种胚的获得:在超净台上用70%酒精擦洗果实表面，用灭菌刀切开果实取核， 用灭菌键子砸开核取出种胚，用无菌綴子剥去种皮，把去种皮的胚用浓度为lOOm/L的赤霉 素即GA3进行预处理得到无菌杂种胚样本； b、 试管植株的获得:去种皮胚经过lOOm/L的赤霉素预处理0.5小时后的无菌杂种胚样 本接种在装有培养基质：MS + 1 mg/L GA3 + 25 g/L薦糖的试管内，在培养室进行培养， 获得胚萌发的植株得到试管植株； C、试管外植株苗体的获得：当试管植株在试管内培养4周时，胚已萌发生长成为绿苗 体，绿苗体表现为:胚根上已生长形成若干侧根并且大部分胚芽已生长形成10 cm的新梢； 绿苗体进行试管外移栽，移栽前，先把瓶盖打开，在溫度为20°C的散射阳光下练苗5天， 用长綴子把苗从试管中取出，放入水盆中，洗掉根部残余培养基，移栽入装有试管外育苗基 质的营养鉢中，苗移栽入营养鉢后，诱透水，用透明性好的塑料縛膜进行覆盖，对刚移栽的 小苗进行保湿处理，W后每隔3天喷一次水，3周时，小苗长出新叶，此时可掲去塑料縛膜得 到试管外植株。
[0021] 在营养鉢中健壮生长的植株，待田间气溫适宜时移入田间，获得了进一步进行选 种的杂种植株材料。
[0022] 在本实施例中，试管内培养基质设置为包含有基本培养基、植物生长调节物质即 赤霉素化A3)、碳源即薦糖、抗氧化剂即半脫氨酸或抗坏血酸、无离子水、琼脂粉； 其中：基本培养基设置为MS(Murashige and Skoog)培养基，MS基本培养基组成为：
在本实施例中，试管外育苗基质设置为包含有草炭、赔石、珍珠岩，按照重量比例，草炭 :赔石:珍珠岩=2:0.8:0.9。
[0023] 在本实施例中，试管内培养基质在灭菌前调抑值到5.8,然后在12rC，l个大气压 下高压灭菌20分钟。
[0024] 在本实施例中，培养环境的培养溫度设置为25 ± 2Γ并且培养环境的光照周期 设置为16小时/天。
[0025] -种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，第二个实施例，其步骤是:选取桃 优系'93' X '春雪'杂交种的成熟果实的胚为培育样本， a、 无菌杂种胚的获得:在超净台上用70%酒精擦洗果实表面，用灭菌刀切开果实取核， 用灭菌键子砸开核取出种胚，用无菌綴子剥去种皮，把去种皮的胚用浓度为500mg/L的赤霉 素即GA3进行预处理得到无菌杂种胚样本； b、 试管植株的获得:去种皮胚经过500mg/L的赤霉素预处理3小时后的无菌杂种胚样本 接种在装有培养基质：MS + 5 mg/L GA3 + 35 g/L薦糖的试管内，在培养室进行培养，获 得胚萌发的植株得到试管植株； C、试管外植株苗体的获得：当试管植株在试管内培养6周时，胚已萌发生长成为绿苗 体，绿苗体表现为:胚根上已生长形成若干侧根并且大部分胚芽已生长形成19 cm的新梢； 绿苗体进行试管外移栽，移栽前，先把瓶盖打开，在溫度为25 Γ的散射阳光下练苗7天， 用长綴子把苗从试管中取出，放入水盆中，洗掉根部残余培养基，移栽入装有试管外育苗基 质的营养鉢中，苗移栽入营养鉢后，诱透水，用透明性好的塑料縛膜进行覆盖，对刚移栽的 小苗进行保湿处理，W后每隔5天喷一次水，4周时，小苗长出新叶，此时可掲去塑料縛膜得 到试管外植株。
[00%]在营养鉢中健壮生长的植株，待田间气溫适宜时移入田间，获得了进一步进行选 种的杂种植株材料。
[0027] 试管外育苗基质设置为包含有草炭、赔石、珍珠岩，按照重量比例，草炭:赔石:珍 珠岩=2:1.1:1.2。
[0028] -种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，第Ξ个实施例，其步骤是:选取桃 优系'93' X '春雪'杂交种的成熟果实的胚为培育样本， a、无菌杂种胚的获得:在超净台上用70%酒精擦洗果实表面，用灭菌刀切开果实取核， 用灭菌键子砸开核取出种胚，用无菌綴子剥去种皮，把去种皮的胚用浓度为100m/l-500mg/ L的赤霉素即GA3进行预处理得到无菌杂种胚样本； b、试管植株的获得:去种皮胚经过100mA-500mg/L的赤霉素预处理0.5-3小时后的无 菌杂种胚样本接种在装有培养基质：MS + 1-5 mg/L GA3 + 25-35 g/L薦糖的试管内，在 培养室进行培养，获得胚萌发的植株得到试管植株； C、试管外植株苗体的获得:当试管植株在试管内培养4-6周时，胚已萌发生长成为绿苗 体，绿苗体表现为:胚根上已生长形成若干侧根并且大部分胚芽已生长形成19 cm的新梢； 绿苗体进行试管外移栽，移栽前，先把瓶盖打开，在溫度为20-25 Γ的散射阳光下练苗 5-7天，用长綴子把苗从试管中取出，放入水盆中，洗掉根部残余培养基，移栽入装有试管外 育苗基质的营养鉢中，苗移栽入营养鉢后，诱透水，用透明性好的塑料縛膜进行覆盖，对刚 移栽的小苗进行保湿处理，W后每隔3-5天喷一次水，3-4周时，小苗长出新叶，此时可掲去 塑料縛膜得到试管外植株。
[0029] 在营养鉢中健壮生长的植株，待田间气溫适宜时移入田间，获得了进一步进行选 种的杂种植株材料。
[0030] 试管外育苗基质设置为包含有草炭、赔石、珍珠岩，按照重量比例，草炭:赔石:珍 珠岩=2:0.8-1.1:0.9-1.2。
[0031 ] -种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，第四个实施例，其步骤是:选取桃 优系'93' X '春雪'杂交种的成熟果实的胚为培育样本， a、 无菌杂种胚的获得:在超净台上用70%酒精擦洗果实表面，用灭菌刀切开果实取核， 用灭菌键子砸开核取出种胚，用无菌綴子剥去种皮，把去种皮的胚用浓度为300mg/L的赤霉 素即GA3进行预处理得到无菌杂种胚样本； b、 试管植株的获得:去种皮胚经过300mg/L的赤霉素预处理1.5小时后的无菌杂种胚样 本接种在装有培养基质：MS + 3 mg/L GA3 + 30 g/L薦糖的试管内，在培养室进行培养， 获得胚萌发的植株得到试管植株； C、试管外植株苗体的获得：当试管植株在试管内培养5周时，胚已萌发生长成为绿苗 体，绿苗体表现为:胚根上已生长形成若干侧根并且大部分胚芽已生长形成15 cm的新梢； 绿苗体进行试管外移栽，移栽前，先把瓶盖打开，在溫度为22.5°C的散射阳光下练苗6 天，用长綴子把苗从试管中取出，放入水盆中，洗掉根部残余培养基，移栽入装有试管外育 苗基质的营养鉢中，苗移栽入营养鉢后，诱透水，用透明性好的塑料縛膜进行覆盖，对刚移 栽的小苗进行保湿处理，W后每隔4天喷一次水，3.5周时，小苗长出新叶，此时可掲去塑料 縛膜得到试管外植株。
[0032] 在营养鉢中健壮生长的植株，待田间气溫适宜时移入田间，获得了进一步进行选 种的杂种植株材料。
[0033] 试管外育苗基质设置为包含有草炭、赔石、珍珠岩，按照重量比例，草炭:赔石:珍 珠岩=2:0.95:1.0。
[0034] -种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，其它方式的实施例，其步骤是： a、无菌杂种胚的获得:取桃优系'93' X '春雪'杂交种的成熟果实，剔除烂果，在超净台 上用70%酒精擦洗果实表面，用灭菌刀切开果实取核，用灭菌键子砸开核，取出种胚放在无 菌培养皿内，用无菌綴子剥去种皮，把去种皮的胚用浓度为l〇〇m/l-500mg/L的赤霉素(GA3) 进行预处理0.5 -3小时； b、试管植株的获得:经过赤霉素预处理的胚接种到装有胚培养基:MS + 1-5 mg/L GA3 + 30 g/L薦糖的试管中，每管接种1个胚，接种后的试管放在培养室培养，培养室培养溫度 为25 ± 2°C，光照周期为16小时/天，光照强度为3000勒克斯； C、试管外植株苗体的获得:胚培养4-6周时，胚根产生较多侧根，苗高也大都在10 cm W上，此时可W进行移栽，移栽前，先把瓶盖打开，放在溫度为20-25°C的散射阳光下练苗5- 7天，然后把苗移到溫室，用长綴子把苗从瓶中取出，放入水盆中，洗掉根部残余培养基，移 栽入装有育苗基质的营养鉢中，育苗基质为草炭:赔石:珍珠岩=2:1:1，苗移栽入营养鉢 后，诱透水，用透明性好的塑料縛膜进行覆盖，目的是对刚移栽的小苗进行保湿，W后每隔 3-5天喷一次水，3-4周时，小苗长出新叶，表明植株已经成活，此时可掲去塑料縛膜。
[0035] 本实施例的实验结果： 无菌胚的获得 本技术采用果实果皮消毒，然后在砸核、取种胚、去种皮步聚中都采用无菌操作的方 法，有效获得了无菌胚，胚污染率在5%W下。果皮消毒方法，种胚没有直接接触消毒剂，种胚 没有受到消毒剂的伤害，使胚的萌发较快，培养3-5天，子叶就开始变绿。说明果皮消毒方 法比常规的种胚消毒方法更有效。
[0036] 胚的萌发生长 经过赤霉素预处理的胚，再接种到培养基MS + 1-5 mg/L GA3 + 30 g/L薦糖上培养， 培养1周，子叶变绿，胚根开始伸长（图1，A);培养2周，胚芽已生长成为健壮绿苗，胚根产生 较多侧根（图1，B)，培养3周时，胚芽伸长生长成为更高的绿梢，胚根侧根也更多更长（图1， C)。但不经过赤霉素预处理直接进行胚的接种，胚的萌发率比经过赤霉素预处理胚的萌发 率大大降低。经过赤霉素预处理胚的萌发率在90W上，而未经赤霉素预处理直接接种的胚 萌发率在70%W下。说明胚经过赤霉素预处理再进行试管内培养比不经过赤霉素预处理而 直接放试管内培养胚的萌发更有效。表明田间常规播种不能出苗的桃杂种成熟胚，试管培 养是成功获得胚正常萌发和植株生长的有效方法。
[0037] 本技术方案在应用于另一个常规播种难出苗的油桃品种，也成功获得了胚培养植 株如图2。证明了本技术方案还能应用于其他桃品种的成熟胚的培养。
[0038] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0039] -种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育基体，第一个实施例，设置为包含有试 管内培养基质和试管外育苗基质，试管内培养基质设置为包含有基本培养基、植物生长调 节物质、碳源、抗氧化剂、无离子水、琼脂粉； 其中：基本培养基设置为MS(Murashige and Skoog)培养基，MS基本培养基组成为：
试管外育苗基质设置为包含有草炭、赔石^珍珠岩，按照重量比例，草炭:赔石:珍珠岩= 2:0.8:0.9。
[0040] 在本实施例中，植物生长调节物质设置为赤霉素(GA3)，碳源设置为薦糖，抗氧化 剂设置为半脫氨酸和抗坏血酸。
[0041] -种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育基体，第二个实施例，试管外育苗基质 设置为包含有草炭、赔石、珍珠岩，按照重量比例，草炭:赔石:珍珠岩=2:1.1:1.2。
[0042] -种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育基体，第Ξ个实施例，试管外育苗基质 设置为包含有草炭、赔石、珍珠岩，按照重量比例，草炭：赔石：珍珠岩=2:0.8-1.1:0.9- 1.2。
[0043] -种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育基体，第四个实施例，试管外育苗基质 设置为包含有草炭、赔石、珍珠岩，按照重量比例，草炭:赔石:珍珠岩=2:0.95:1.0。
[0044] 本发明具有下特点： 1、由于设计了对桃树杂种的种胚进行分步试管内和试管外培育，在试管内培养基质中 培育得到试管植株，在试管外育苗基质中培育得到室外正常生长的植株，不再直接种植果 树种子，因此提高了杂交果树种子的发苗率。
[0045] 2、由于设计了试管内培养基质，促使种胚萌发获得试管小植株。
[0046] 3、由于设计了试管外育苗基质，促使苗体在试管外健壮生长。
[0047] 4、由于设计了对结构形状进行了数值范围的限定，使数值范围为本发明的技术方 案中的技术特征，不是通过公式计算或通过有限次试验得出的技术特征，试验表明该数值 范围的技术特征取得了很好的技术效果。
[0048] 5、由于设计了本发明的技术特征，在技术特征的单独和相互之间的集合的作用， 通过试验表明，本发明的各项性能指标为现有的各项性能指标的至少为1.7倍，通过评估具 有很好的市场价值。
[0049] 还有其它的与果树种子的种胚进行分步培育的相同或相近似的技术特征都是本 发明的实施例之一，并且W上所述实施例的各技术特征可W进行任意的组合，为满足专利 法、专利实施细则和审查指南的要求，不再对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组 合的实施例都进行描述。
[0050] 因此在基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法及培育基体技术领域内，凡是包 含有内层1设置为化学肥料与植物賴杆或植物叶体的高压形成的混合体的技术内容都在本 发明的保护范围内。
[0051] 上述实施例只是本发明所提供的基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法及培 育基体的一种实现形式，根据本发明所提供的方案的其他变形，增加或者减少其中的成份 或步骤，或者将本发明用于其他的与本发明接近的技术领域，均属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，其特征是:其步骤是:a、无菌杂种胚 的获得:把果树种子的种胚进行消毒处理得到无菌杂种胚样本； b、 试管植株的获得:在装有培养基质的试管内，把无菌杂种胚进行培养，获得胚萌发的 植株得到试管植株； c、 试管外植株苗体的获得：当试管植株的胚根上已生长形成若干侧根并且大部分胚芽 已生长形成10 cm以上的新梢;移栽到试管外育苗基质中，培育得到试管外植株。2. 根据权利要求1所述的基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，其特征是:其步骤 是:选取桃优系'93' X '春雪'杂交种的成熟果实的胚为培育样本， a、 无菌杂种胚的获得:在超净台上用70%酒精擦洗果实表面，用灭菌刀切开果实取核， 用灭菌锤子砸开核取出种胚，用无菌镊子剥去种皮，把去种皮的胚用浓度为100m/L-500mg/ L的赤霉素即GA3进行预处理得到无菌杂种胚样本； b、 试管植株的获得:去种皮胚经过100m/L-500mg/L的赤霉素预处理0.5-3小时后的无 菌杂种胚样本接种在装有培养基质:MS + 1-5 mg/L GA3 + 25-35 g/L蔗糖的试管内，在培 养室进行培养，获得胚萌发的植株得到试管植株； c、 试管外植株苗体的获得：当试管植株在试管内培养4-6周时，胚已萌发生长成为绿苗 体，绿苗体表现为:胚根上已生长形成若干侧根并且大部分胚芽已生长形成10 cm以上的新 梢； 绿苗体进行试管外移栽，移栽前，先把瓶盖打开，在温度为20-25Γ的散射阳光下练苗 5-7天，用长镊子把苗从试管中取出，放入水盆中，洗掉根部残余培养基，移栽入装有试管外 育苗基质的营养钵中，苗移栽入营养钵后，浇透水，用透明性好的塑料溥膜进行覆盖，对刚 移栽的小苗进行保湿处理，以后每隔3-5天喷一次水，3-4周时，小苗长出新叶，此时可揭去 塑料溥膜得到试管外植株。3. 根据权利要求2所述的基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，其特征是:试管内 培养基质设置为包含有基本培养基、植物生长调节物质即赤霉素(GA 3)、碳源即蔗糖、抗氧 化剂即半胱氨酸和抗坏血酸、无离子水、琼脂粉； 其中：基本培养基设置为MS(Murashige and Skoog)培养基，MS基本培养基组成为： 无机成分大量元素 I工作浓度(mg/L) " NH4NQ3__1650_ KNO3__1900_ KH2PQ4__170_ MgSOWH2O__370_ CaCl2 · 2H20__440_ 无机成分微量元素 __ FeSOWH2O__2^8_ EDTA__3^3_ KI__(h83_ H3BO3__6^2_ MnS〇4 · 4H20__22^3_ ZnS〇4 · 7H20___ Na2MoQ4 ? 2H20 I 0.25 - CuS〇4 · 5H20__0.025_ CoCl2 · 6H2O__0.025_ 有机成分__ 烟酸__(λδ_ VBl__(h5_ VB6__(h5_ 甘氨酸__2_A)_ 肌醇__Π )〇_ 琼脂粉 I 6000 _ ο4. 根据权利要求2所述的基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，其特征是:试管外 育苗基质设置为包含有草炭、蛭石、珍珠岩，按照重量比例，草炭:蛭石:珍珠岩=2:0.8-1.1 :0·9-1·2〇5. 根据权利要求2所述的基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，其特征是:试管内 培养基质在灭菌前调pH值到5.8，然后在121°C，1个大气压下高压灭菌20分钟。6. 根据权利要求2所述的基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，其特征是:培养环 境的培养温度设置为25 ± 2°C并且培养环境的光照周期设置为16小时/天。7. 根据权利要求2所述的基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，其特征是:杂种果 树品种设置为桃树或油桃。8. 根据权利要求2所述的基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育方法，其特征是:其步骤 是： a、 无菌杂种胚的获得:取桃优系'93'X'春雪'杂交种的成熟果实，剔除烂果，在超净台 上用70%酒精擦洗果实表面，用灭菌刀切开果实取核，用灭菌锤子砸开核，取出种胚放在无 菌培养皿内，用无菌镊子剥去种皮，把去种皮的胚用浓度为l〇〇m/L-500mg/L的赤霉素(GA 3) 进行预处理0.5 - 3小时； b、 试管植株的获得:经过赤霉素预处理的胚接种到装有胚培养基:MS + 1-5 mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖的试管中，每管接种1个胚，接种后的试管放在培养室培养，培养室培养温度 为25 ± 2°C，光照周期为16小时/天，光照强度为3000勒克斯； c、 试管外植株苗体的获得:胚培养4一6周时，胚根产生较多侧根，苗高也大都在10 cm 以上，此时可以进行移栽，移栽前，先把瓶盖打开，放在温度为20-25Γ的散射阳光下练苗5-7天，然后把苗移到温室，用长镊子把苗从瓶中取出，放入水盆中，洗掉根部残余培养基，移 栽入装有育苗基质的营养钵中，育苗基质为草炭:蛭石:珍珠岩=2:0.8-1.1:0.9-1.2，苗移 栽入营养钵后，浇透水，用透明性好的塑料溥膜进行覆盖，目的是对刚移栽的小苗进行保 湿，以后每隔3-5天喷一次水，3-4周时，小苗长出新叶，表明植株已经成活，此时可揭去塑料 溥膜。9. 一种基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育基体，设置为包含有试管内培养基质和试 管外育苗基质，试管内培养基质设置为包含有基本培养基、植物生长调节物质、碳源、抗氧 化剂、无离子水、琼脂粉； 其中：基本培养基设置为MS(Murashige and Skoog)培养基，MS基本培养基组成为： 无机成分大量元素 I工作浓度(mg/L) " NH4NQ3__1650_ KNO3__1900_ KH2PQ4__170_ MgSOWH2O__370_ CaCl2 · 2H20__440_ 无机成分微量元素 __ FeSOWH2O__2^8_ EDTA__3^3_ KI__(h83_ H3BO3__6^2_ MnS〇4 · 4H20__22^3_ ZnS〇4 · 7H20___ Na2MoQ4 ? 2H2Q__(h25_ CuS〇4 · 5H20__0.025_ CoCl2 · 6H2O__0.025_ 有机成分__ 烟酸__(λδ_ VBl__(h5_ VB6__(h5_ 甘氨酸__2_A)_ 肌醇__Π )〇_ 琼脂粉 I 6000 _ 试管外育苗基质设置为包含有草炭、蛭石、珍珠岩，按照重量比例，草炭:蛭石:珍珠岩= 2:0·8-1·1:0·9-1·2〇10.根据权利要求9所述的基于一次成苗的桃树杂种胚试管培育基体，其特征是:植物 生长调节物质设置为赤霉素(GA3),碳源设置为蔗糖，抗氧化剂设置为半胱氨酸和抗坏血 酸。
【文档编号】A01H4/00GK105875399SQ201610252780
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】孙清荣, 孙洪雁, 李林光, 何平, 王海波
【申请人】山东省果树研究所