一种国槐子叶体细胞胚诱导的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种国槐子叶体细胞胚诱导的快速繁殖方法，属于植物生物技术领 域。
【背景技术】
[0002] 国槐（Sophora japonica Linn)，别名家槐、中国槐，属蝶形花亚科、槐属，是理想 的行道树种和庭院绿化树种。而且，国槐材质优良，花、果实、根皮、树皮可入药，种子可榨油 制皂，具有较高的经济价值，应用前景十分广阔。同时，国槐又是嫁接龙爪槐、金枝槐、聊红 槐、蝴蝶槐等观赏品种的唯一砧木树种，苗木需求大。国槐主要以种子繁殖为主，但其开花 结果具有大小年现象，且种子易受病虫害危害，干瘪、空洞现象严重。常规的育种方法，依靠 种子或扦插繁殖，难以满足生产的需求。
[0003] 近年来，利用生物技术培育具有抗性如抗逆、抗虫、抗病等新型品种是国槐育种的 新趋势。到目前为止，对槐树的形成层培养、茎培养、叶片培养、胚培养、未授粉子房的培养 均已获得了完整的植株，对原生质的培养也取得了一定的进展。袁秀云等利用国槐的子叶 和下胚轴产生了不定芽，王喆之等利用花药培养形成了单倍体植株，Han K. H等（1993， 1997)将直径为0.5~1.0cm的枝条消毒后，取出形成层接入愈伤诱导培养基中诱导愈伤，再 将愈伤组织转入分化培养基中，获得了丛生芽，将成苗转入生根培养基中，可诱导生根。上 述的方法存在的缺点：由于国槐为多年生木本植物，其再生率普遍较低，出芽少，直接影响 了国槐的遗传转化。利用植物体胚诱导技术不但能达到保存母株优良基因、快速繁育的目 的，还是提高基因遗传转化或诱变育种的重要途径。目前，有关国槐的体细胞胚诱导技术研 究的较少，可以参考的现有技术比较少。查阅文献，可以看到别的树种也有人在做体胚诱 导，国槐为多年生乔木，基因组庞大，鉴于基因型的限制，没有参考价值。
[0004] 国槐的离体叶片、根尖等均可诱导产生胚状体。其前提条件是首先要建立一个稳 定的高频再生系统，只有这样，才能提供充足的无菌离体材料。在山东地区，国槐小峰的危 害非常严重，要采集国槐种子，必须在国槐花序刚刚形成花蕾时采集，必须在国槐花序刚刚 形成开始至授粉形成果荚期间在要采摘的国槐树及其周边均要喷洒农药，防止国槐小蜂寄 存在种子中。果荚膨大成熟后，既可米收种子。专利CN 102499086 A公开了一种刺槐的繁殖 方法，由于国槐与刺槐分属不同的属，物种差别较大，不能参考刺槐荚果的体细胞培养方法 得到国槐子叶的体细胞培养。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种国槐子叶体细胞胚诱导的快速繁 殖方法，以解决国槐再生率低下的问题。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种国槐子叶体细胞胚诱导的快速繁殖方法，包括以下步骤：
[0008] (1)将国槐子叶接种在体细胞胚诱导培养基上培养形成愈伤组织，所述体细胞胚 诱导培养基为：Α+3·0~5.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸）+0.5~l.Omg/L BA+0.5~ 1.0mg/L NAA(蔡乙酸）+0.1 ~0.5mg/L TDZ+0.5~1.0mg/L谷氛醜胺+0.5~1.0mg/L CH(水 解酪蛋白）+5 · Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0009] (2)将上述愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，培养形成丛生芽小苗，所述不定 芽诱导培养基为：A+0 · 1~0 · 5mg/L ΒΑ+0 · 1~0 · 5mg/L ΝΑΑ+0 · 5~1 · Omg/L谷氛醜胺+0 · 5~ 1 · Omg/L CH(水解酪蛋白）+5 · Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0010] (3)将丛生芽小苗切成愈伤块转接到试管苗增殖培养基上进行增殖快繁培养，所 述试管苗增殖培养基配方:MS+1.0~2. Omg/L BA(6-苄基腺嘌呤)+ 1.0~2. Omg/LIBA(吲哚 丁酸)+5 · Og/L 琼脂+30g/L 蔗糖，pH值5 · 8 ~6 · 0;
[0011] (4)将增殖培养的丛生芽从基部切开，转入壮苗培养基中，进行壮苗培养，所述壮 苗培养基为:MS+5 · Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0012] (5)将壮苗培养后的小苗切成单株转接到生根培养基上培养后，即可炼苗移栽，所 述生根培养基为：1/2MS+0· 1 ~0·5mg/L ΙΒΑ+0~0·05mg/L NAA+5·0g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH 值5.8~6.0，所述I/2MS是MS全量减半。
[0013] (6)炼苗移栽。
[0014]优选:所述国槐子叶的采集方法：
[0015] (1)选取当年生国槐种子(优选：国槐种子为无病虫害的当年成熟种子，用洗洁精 仔细清洗后，流水冲洗1小时。优点：以减少外植体消毒过程中的污染。），去除果荚，清洗干 净后准备消毒；
[0016] (2)将国槐种子消毒（优选：于超净工作台上，用体积分数为70%酒精浸泡30~ 60s，无菌水冲洗2~3次，再用质量分数为0.1%升汞(氯化汞)溶液消毒8~12min，然后用无 菌水冲洗4~6次。）后，用手术刀片和镊子轻轻剥去种皮，将子叶取出，用手术刀划3~4个伤 □ 〇
[0017] 优选:上述各步骤中培养条件除特殊说明外，均为培养室温度白天25±2°C，夜晚 18 ± 2 °C，光照强度1000~15001X，光照时间16h/d。
[0018]优选:A配方为改良过的MS与B5培养基组合，包括MS培养基中的常量营养元素、微 量营养兀素和B5培养基的有机试剂。
[0019] 优选:MS培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
[0020] 优选:所述MS培养基的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下:硝酸钾1900mg/ L，硝酸铵1650mg/L，七水硫酸镁370mg/L，无水磷酸二氢钾170mg/L，二水氯化|丐44〇11^凡，乙 二胺四乙酸二钠37 · 3mg/L，七水硫酸亚铁27 · 8mg/L。
[0021] 优选：所述MS培养基的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：四水硫酸锰 22.311^/1^，硫酸锌8.611^/1^，硼酸6.211^/1^，碘化钾0.8311^/1，钼酸钠0.2511^/1^，硫酸铜 0 · 025mg/L，氯化钴 0 · 025mg/L。
[0022] 优选:A配方所述的B5有机试剂的组分和其对应的浓度如下：盐酸硫胺素100mg/L， 烟酸I 〇mg/L，盐酸吡咳醇10mg/L，肌醇1000mg/L。
[0023]优选:所述MS培养基的有机试剂的组分和其对应的浓度如下:甘氨酸20mg/L，盐酸 硫胺素 l〇mg/L，烟酸1 · 0mg/L，盐酸吡咳醇1 · 0mg/L，肌醇100mg/L。
[0024]优选:步骤(8)中炼苗移栽的具体步骤为:将试管苗封口膜绑绳松开，在培养室适 应1~2d，转入遮光度50%的温室中，去掉封口膜，炼苗2~3d，待小苗叶片上的气孔可自主 开合后，用镊子轻轻将小苗夹出，清水洗去基部残留的培养基，移栽到装有混合育苗基质的 花盆中，保持相对湿度在80%以上。
[0025]优选：所述花盆混合育苗基质的成分以体积比计为：珍珠岩：锯末：腐殖土 = 30: 30:40。
[0026]优选:利用间歇喷雾装置或人工喷水保持相对湿度。具体要求为:喷水一定为非常 细小的雾状水，使叶面保持湿润，而花盆中基质状态为用手攥不滴水，松手不散开。如此驯 化炼苗5~IOd后，长出新根，新芽萌出，逐渐减少饶水次数并进行常规管理。
[0027]本发明的有益效果：
[0028] 体细胞胚发生的因素包括内因和外因，内因包括物种和基因型，外因主要涉及培 养基中附加成分的种类和浓度。即使是同一属的植物，由于基因型不同，体细胞胚发生频率 相差极大，原因如下：一是不同基因型体细胞胚发生频率不同，二是不同基因型的最适诱导 条件不同。外植体的生理状态和发育程度都直接影响体细胞胚的发生，一般生理代谢旺盛 而分化程度较低的组织有利于体细胞胚的诱导。
[0029] 对于体细胞胚诱导的快速繁殖方法所使用的培养基中必需的生长素、细胞分裂 素、赤霉素、脱落酸，还原性氮盐和外源氨基酸，PH值，光照、温度等其他因素，他们的作用方 向、作用程度都不相同。诱导植物体细胞胚发生的因素众多，但它们的作用程度不尽相同， 各种因子通过转录与翻译水平复杂而精确地调控，使体细胞胚发生的相关基因在时间上和 空间上得以选择性激活和表达，只有各种因素配合使用时才能快速、高效地诱导出体细胞 胚。
[0030] 发明人综合考虑