一种国槐子叶体细胞胚诱导的成套培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种国槐子叶体细胞胚诱导的成套培养基，属于植物生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 国槐（Sophora japonica Linn)，别名家槐、中国槐，属蝶形花亚科、槐属，是理想 的行道树种和庭院绿化树种。而且，国槐材质优良，花、果实、根皮、树皮可入药，种子可榨油 制皂，具有较高的经济价值，应用前景十分广阔。同时，国槐又是嫁接龙爪槐、金枝槐、聊红 槐、蝴蝶槐等观赏品种的唯一砧木树种，苗木需求大。国槐主要以种子繁殖为主，但其开花 结果具有大小年现象，且种子易受病虫害危害，干瘪、空洞现象严重。常规的育种方法，依靠 种子或扦插繁殖，难以满足生产的需求。
[0003] 近年来，利用生物技术培育具有抗性如抗逆、抗虫、抗病等新型品种是国槐育种的 新趋势。到目前为止，对槐树的形成层培养、茎培养、叶片培养、胚培养、未授粉子房的培养 均已获得了完整的植株，对原生质的培养也取得了一定的进展。袁秀云等利用国槐的子叶 和下胚轴产生了不定芽，王喆之等利用花药培养形成了单倍体植株，Han K. H等（1993， 1997)将直径为0.5~1.0cm的枝条消毒后，取出形成层接入愈伤诱导培养基中诱导愈伤，再 将愈伤组织转入分化培养基中，获得了丛生芽，将成苗转入生根培养基中，可诱导生根。上 述的方法存在的缺点：由于国槐为多年生木本植物，其再生率普遍较低，出芽少，直接影响 了国槐的遗传转化。利用植物体胚诱导技术不但能达到保存母株优良基因、快速繁育的目 的，还是提高基因遗传转化或诱变育种的重要途径。目前，有关国槐的体细胞胚诱导技术研 究的较少，可以参考的现有技术比较少。查阅文献，可以看到别的树种也有人在做体胚诱 导，国槐为多年生乔木，基因组庞大，鉴于基因型的限制，没有参考价值。
[0004] 国槐的离体叶片、根尖等均可诱导产生胚状体。其前提条件是首先要建立一个稳 定的高频再生系统，只有这样，才能提供充足的无菌离体材料。在山东地区，国槐小峰的危 害非常严重，要采集国槐种子，必须在国槐花序刚刚形成开始至授粉形成果荚期间在要采 摘的国槐树及其周边均要喷洒农药，防止国槐小蜂寄存在种子中。果荚膨大成熟后，既可采 收种子。专利CN 102499086 A公开了一种刺槐的繁殖方法，由于国槐与刺槐分属不同的属， 物种差别较大，不能参考刺槐荚果的体细胞培养方法得到国槐子叶的体细胞培养。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种国槐子叶体细胞胚诱导的成套培 养基，以解决国槐再生率低下的问题。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种国槐子叶体细胞胚诱导的成套培养基，包括
[0008] 体细胞胚诱导培养基:A+3 · 0~5 · Omg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)+0 · 5~1 · Omg/ L BA+0.5~1.0mg/L NAA(蔡乙酸）+0.1 ~0.5mg/L TDZ+0.5~1.0mg/L谷氛醜胺+0.5~ 1 · Omg/L CH(水解酪蛋白）+5 · Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0009]不定芽诱导培养基：A+0 · 1 ~0 · 5mg/L ΒΑ+0 · 1 ~0 · 5mg/L ΝΑΑ+0 · 5~I · Omg/L谷氛 酰胺+〇 · 5~I · Omg/L CH(水解酪蛋白）+5 · Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0010] 试管苗增殖培养基配方:MS+1 · 0~2 · Omg/L BA(6-苄基腺嘌呤）+ 1 · 0~2 · Omg/LIBA (吲哚丁酸)+5 · Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0011]壮苗培养基:MS+5 · Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0012] 生根培养基：1/2MS+0.1 ~0.5mg/L ΙΒΑ+0~0.05mg/L NAA+5.0g/L琼脂+20g/L蔗 糖，pH值5.8~6.0，所述1/2MS是MS全量减半；
[0013] 所述:A配方包括MS培养基中的常量营养元素、微量营养元素和B5培养基的有机试 剂。
[0014] 优选:MS培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
[0015]优选:所述MS培养基的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：硝酸钾1900mg/ L，硝酸铵1650mg/L，七水硫酸镁370mg/L，无水磷酸二氢钾170mg/L，二水氯化|丐44〇11^凡，乙 二胺四乙酸二钠37 · 3mg/L，七水硫酸亚铁27 · 8mg/L。
[0016] 优选：所述MS培养基的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：四水硫酸锰 22.311^/1^，硫酸锌8.611^/1^，硼酸6.211^/1^，碘化钾0.8311^/1，钼酸钠0.2511^/1^，硫酸铜 0 · 025mg/L，氯化钴 0 · 025mg/L。
[0017] 优选:A配方所述的B5有机试剂的组分和其对应的浓度如下：盐酸硫胺素100mg/L， 烟酸I 〇mg/L，盐酸吡咳醇10mg/L，肌醇1000mg/L。
[0018] 本发明的有益效果：
[0019] 体细胞胚发生的因素包括内因和外因，内因包括物种和基因型，外因主要涉及培 养基中附加成分的种类和浓度。即使是同一属的植物，由于基因型不同，体细胞胚发生频率 相差极大，原因如下：一是不同基因型体细胞胚发生频率不同，二是不同基因型的最适诱导 条件不同。外植体的生理状态和发育程度都直接影响体细胞胚的发生，一般生理代谢旺盛 而分化程度较低的组织有利于体细胞胚的诱导。
[0020] 对于培养基中必需的生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸，还原性氮盐和外源氨 基酸，PH值等其他因素，他们的作用方向、作用程度都不相同。诱导植物体细胞胚发生的因 素众多，但它们的作用程度不尽相同，各种因子通过转录与翻译水平复杂而精确地调控，使 体细胞胚发生的相关基因在时间上和空间上得以选择性激活和表达，只有各种因素配合使 用时才能快速、高效地诱导出体细胞胚。
[0021] 发明人综合考虑影响国槐子叶体细胞胚发生的各种因素，围绕提高再生率、增加 出芽，提高植株移栽成活率等目的，设计了本发明的一套培养基，该培养基相较于其他的培 养基再生率高、出芽多，植株移栽成活率可达到90 %以上，种苗生长健壮，不但可有效解决 优良种苗种质退化问题，还可为国槐遗传转化或诱变育种提供一个理想的受体系统
[0022] 使用本发明的培养基繁殖国槐幼苗，可省去先建立国槐快繁再生体系这一步骤， 大大节省时间。
【附图说明】
[0023]图1子叶划伤口；
[0024]图2形成胚性愈伤组织；
[0025] 图3愈伤组织诱导出丛生芽。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
[0027] A配方为改良过的MS与B5培养基组合，包括MS培养基中的常量营养元素、微量营养 元素和B5培养基的有机试剂。
[0028] MS培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
[0029]所述MS培养基的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：硝酸钾1900mg/L，硝 酸铵1650mg/L，七水硫酸镁370mg/L，无水磷酸二氢钾170mg/L，二水氯化|丐44〇11^凡，乙二胺 四乙酸二钠37 · 3mg/L，七水硫酸亚铁27 · 8mg/L。
[0030] 所述MS培养基的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：四水硫酸锰22.3mg/ L，硫酸锌8 · 6mg/L，硼酸6 · 2mg/L，碘化钾0 · 83mg/L，钼酸钠0 · 25mg/L，硫酸铜0 · 025mg/L，氯 化钴0.025mg/L。
[0031] 优选:A配方所述的B5有机试剂的组分和其对应的浓度如下：盐酸硫胺素100mg/L， 烟酸I 〇mg/L，盐酸吡咳醇I Omg/L，肌醇1000mg/L。
[0032]优选:所述MS培养基的有机试剂的组分和其对应的浓度如下:甘氨酸20mg/L，盐酸 硫胺素 l〇mg/L，烟酸1 · 0mg/L，盐酸吡咳醇1 · 0mg/L，肌醇100mg/L
[0033] 实施例一：
[0034] 选取生长健壮、无病虫害的当年生国槐成熟种子，去除果荚，用洗洁精仔细清洗 后，流水冲洗1小时，滤纸吸净种子外面多余水分，准备消毒。
[0035]将试材置于超净工作台上，用70%的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用0.1%升 汞灭菌Smin，无菌水冲洗5次，用灭菌滤纸吸干水分，用手术刀片和镊子轻轻剥去种皮，将子 叶取出。将两片子叶用镊子和刀片轻轻分开，保留胚芽，然后将子叶较平的那面朝下，凸面 朝上放置在培养皿中，用手术刀片垂直于子叶凸面面主脉划3~4个伤口，注意不要划至子 叶边缘。
[0036] 将上述子叶接种在体胚诱导培养基(A+3.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L BA+0.5mg/L NAA +0 · lmg/L TDZ+0 · 5mg/L谷氨酰胺+0 · 5mg/L CH(水解酪蛋白）+5 · 0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值 5.8)中。暗培养30d，诱导体胚的形成。开始，叶片慢慢变硬变厚，逐渐形成愈伤组织，经过 45d的暗培养，外植体变为浅黄色黏状愈伤组织。
[0037] 将上述愈伤组织转接到不定芽诱导培养基(A+0 · 3mg/L ΒΑ+0 · lmg/L ΝΑΑ+0 · 5mg/L 谷氨酰胺+〇. 5mg/L CH(水解酪蛋白）+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。放入温度白天 25± 2°C，夜晚20± 2°C，光照强度1000~15001x，光照时间16h/d的培养室中培养，愈伤组织 逐渐增殖。在此环境中培养98d，中间用同种培养基继代两次。继代一次后，愈伤组织出现绿 色的芽点。再继续继代一次，绿色的芽点逐渐长成1~2cm的小苗，形成丛生芽小苗，将丛生 芽小苗切成愈伤快转接到试管苗增殖培养基进行快速培养，所述试管苗增殖培养基配方： MS+1 · 0~2 · 0mg/L BA(6-苄基腺嘌呤)+1 ·0~2 · Omg/LIBA(吲哚丁酸)+5 ·0g/L琼脂+30g/L蔗 糖，pH值5.8 ~6.0。
[0038]将增殖培养的丛生小苗从基部切下，转入壮苗培养基(MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗 糖，pH值5.8)中，进行壮苗培养。培养环境同上。大约培养25d，小苗长至3~4cm高。
[0039] 将小苗从基