一种利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物繁殖技术领域，尤其涉及一种利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方 法。
【背景技术】
[0002] 香根草(Vetiveria zizanioides L.)，又名培地茅、岩兰草，是一种禾本科多年丛 生的草本植物，原产于印度等国，现主要分布于东南亚、印度和非洲等（亚）热带地区，我国 主要分布在广东、云南等地。香根草极难结实或不结实，主要靠分蘖繁殖，即每年春季，上年 留在田里的香根草根部会萌发新的分蘖，一般情况下，每兜香根草根部在春季可增生40株 左右的分蘖。理论上讲，每个分蘖都可以长成独立的具有6-10节的茎，实际上，只有较大分 蘖(平均有15株分蘖/兜)形成的茎节数可达6-10节。香根草具有适应能力强，生长繁殖快， 根系发达，耐旱耐瘠等特性，在水土保持，改良生态环境、经济开发利用中有重要的应用，受 到国内外的广泛重视并得到迅速的推广。目前国内对香根草的需求较大，种苗供不应求，而 导致种苗缺乏的主要原因是繁殖速度过慢。目前生产上香根草种苗繁殖方式有三种，一是 通过分离香根草新生分蘖苗法获得。该方法的优点是技术简单，存在的主要问题是种苗繁 殖系数低，一般情况下1亩香根草种苗圃可以繁殖4-6亩种苗，限制了香根草的大规模开发 利用。二是直接利用香根草外植体(如叶鞘、茎段、蘖节等），通过体细胞发育形成完整植株。 第三种方法是应用香根草愈伤组织再生新苗。其生产程序是，先选择外植体-外植体消毒 -外植体接种在诱导培养基上诱导愈伤组织细胞形成-(或将愈伤组织细胞继代培养)- 将愈伤组织块接种在生芽培养基上诱导生芽-将芽接种在生根培养基上诱导生根-成苗， 形成一个完整的植株。后两种方法的优点是繁殖系数较低一种方法明显增高，但是存在培 养过程污染率不容易控制的问题。污染的主要原因是诱导成苗过程需要转接3次，每一次转 接都有可能引起污染。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法，旨在解决现有 的繁殖香根草种苗方法存在培养过程污染率不容易控制的问题。
[0004] 本发明是这样实现的，一种利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法，所述利用愈伤 组织繁殖香根草种苗的方法包括：
[0005] 配制培养基，培养基成分包括，IXMS营养元素，30g/L蔗糖、7g/L琼脂、211^/16-ΒΑ、0 · 2mg/L IBA;培养基用5mol/L的氢氧化钠调至pH = 5 · 5~6 · 5，高温湿热灭菌20~30分 钟，后冷却至50°C时，分装在无菌组配瓶内，自然冷却凝固后备用；S102:选取外植体:从生 长健壮、无病虫害的香根草基部剪取具4个以上茎节的茎，去除叶、叶鞘和顶芽，在茎节上下 Icm处用剪刀剪断，留下带掖芽的茎段作为外植体；
[0006] 组培苗培养:将接种的培养瓶密封瓶口，然后放置在25 ± TC培养室内先暗培养3 天，然后在16/18光暗交替下继续培养，在培养的第30天在掖芽基部切口处形成愈伤组织， 第50天愈伤组织分化形成丛状新芽，第70天在新芽周围长出新根，形成高3cm的丛状香根草 幼苗。
[0007] 进一步，所述配制培养基后需要：
[0008] 选取外植体:从生长健壮、无病虫害的香根草基部剪取具4个以上茎节的茎，去除 叶、叶鞘和顶芽，在茎节上下Icm处用剪刀剪断，留下带掖芽的茎段作为外植体；
[0009] 消毒外植体:取所修剪后茎段，放入去污液中并浸泡2h，然后用流水清洗浸泡后的 茎杆2h;接着在工作台内再依次分别用75%酒精、0.1%升汞和5%的多菌灵浸没茎段消毒 0.5、6和10分钟，最后用无菌水冲洗莖段4-6遍，于无菌滤纸上瞭干后备用；
[0010] 接种外植体:取消毒晾干后的茎段，在超净工作台内用无菌剪刀将掖芽基部〇. Ιο. 3cm 以上顶端部分剪去； 用无菌解剖刀在茎苄基部等距离纵切 3 个伤口 ，伤 口深度 0. lcm， 伤口长度均为〇 . 3cm;用无菌镊子将去除掖芽顶端且切伤后的茎段按自然生长方向插入培 养基中，扎入深度为茎苄基部刚好接触培养基上平面。
[0011] 进一步，所述去污液为1 %洗衣粉的蒸馏水。
[0012] 进一步，所述组培苗培养后需要：
[0013]配制幼苗移栽培养基：营养土培养基由花土、壤土和沙按照1:1:1的比例配制，营 养钵选用高度为25cm，钵底和钵口直径不小于5cm，混勾的营养土盛装在营养钵内，营养土 培养基用量为营养钵高度的1/2，移栽前将装有营养土培养基的营养钵放置在自来水内，使 营养土饱和吸水，然后再将营养钵自然控水5小时后备用；
[0014]幼苗的分离与移栽:从培养瓶内取出丛状香根草幼苗，去除连带在幼苗上的培养 基残渣，用剪刀或镊子轻轻将具有独立根系的单个幼苗从丛状香根草幼苗上分离出来，然 后将单个幼苗移栽到装有营养土培养基的营养钵内；
[0015] 移栽苗的培养:剪取比营养钵口径稍大的透明薄塑料布块，并将其展开轻轻覆盖 在移栽后的营养钵口上;然后将覆盖有塑料布的营养钵放置培养室内保湿培养7天，然后去 掉塑料布继续培养60天，幼苗即可长至10-15cm大小，培养是条件是25 ± TC、16/18光暗交 替。
[0016] 本发明提供的利用愈伤组织繁殖香根草种苗的方法，其优点在于1)优化了培养基 成分，提高了茎节掖芽愈伤组织诱导效率(按最初接种外植体数量计，最高可达88.3%) ;2) 采用一次接种培养即可完成三个培养环节(愈伤组织诱导、愈伤组织分化生芽和不定芽生 根），中间不需要进行转接，减少了杂菌污染的机会，提高了成苗率(按最初接种外植体数量 计，成苗率超过70 %，最高可达73.3 % )。
[0017] 本发明提供的方法就是在整个香根草组培苗培养过程中只进行一次接种，这样就 杜绝了愈伤组织细胞和不定芽被真菌细菌污染的机会，减少培养过程中污染率，因为提高 了成苗率。为进一步证明这种效果，设计实验来验证。实验用培养基为本发明优化的培养基 (含I XMS营养元素、7g//L琼脂、2mg/L 6-BA、O · 2mg/L IBA、30g/L蔗糖），香根草掖芽基部外 植体的选择和消毒处理措施同本发明一样。
[0018] 实验处理措施有4个，分别是A:使用本发明的方法，用一个培养基，只接种一次，完 成愈伤组织诱导、生芽、生根成苗;B:配置2个培养基，接种二次，第一次是将掖芽接种到培 养基上培养至不定芽生成，第二次是将无菌不定芽转接到培养基上生根成苗;C:配置2个培 养基，接种二次，第一次是将掖芽接种到培养基上培养至愈伤组织细胞生成，第二次是将无 菌愈伤组织细胞接种到培养基上培养至生根成苗;D:配置3个培养基，接种三次，即第一次 是将掖芽外植体接种到培养基上培养之愈伤组织生成，第二次是将愈伤组织转接到培养基 上培养至生芽，第三次是将不定芽转接到培养基上培养至生根成苗。按照本发明的方法，每 组培瓶这接种一个外植体(掖芽、愈伤组织块、不定芽），分别在第30、50、70天统计产生无菌 愈伤组织瓶数、分化形成无菌不定芽瓶数、分化出根的无菌苗瓶数和被污染瓶数，最后计算 愈伤组织诱导率、生芽率、成苗率和污染率。愈伤组织诱导率、生芽率、生根成苗率的计算同 实验1，污染率=被污染总瓶数/接种掖芽总数X100%。
[0019] 应用本发明的技术路线进行培养，香根草掖芽诱