洗 后，流水冲洗1小时，滤纸吸净种子外面多余水分，准备消毒。
[0067]将试材置于超净工作台上，用70%的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用0.1%升 汞灭菌12min，无菌水冲洗5次，用灭菌滤纸吸干水分，用手术刀片和镊子轻轻剥去种皮，将 子叶取出。将两片子叶用镊子和刀片轻轻分开，保留胚芽，然后将子叶较平的那面朝下，凸 面朝上放置在培养皿中，用手术刀片垂直于子叶凸面面主脉划3~4个伤口，注意不要划至 子叶边缘。
[0068] 将上述子叶接种在体胚诱导培养基(A+5.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L BA+1.0mg/L NAA +0 · 5mg/L TDZ+1 · Omg/L谷氨酰胺+1 · Omg/L CH(水解酪蛋白）+5 · Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值 5.8)中。经过35d的暗培养，外植体变为浅黄色黏状愈伤组织。
[0069] 将上述愈伤组织转接到不定芽诱导培养基(A+0 · 5mg/L ΒΑ+0 · lmg/L NAA+1 · Omg/L 谷氨酰胺+1. 〇mg/L CH(水解酪蛋白）+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。放入温度白天 25±2°C，夜晚20±2°C，光照强度1000~15001x，光照时间16h/d的培养室中培养。在此环境 中培养85d，中间用同种培养基继代两次。继代一次后，愈伤组织出现绿色的芽点。再继续继 代一次，绿色的芽点逐渐长成1~2cm的小苗，形成丛生芽小苗，将丛生芽小苗切成愈伤快转 接到试管苗增殖培养基进行快速培养，所述试管苗增殖培养基配方:MS+1.0~2.0mg/L BA (6-苄基腺嘌呤)+1 · 0~2 · Omg/LIBA(吲哚丁酸)+5 · 0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0。
[0070] 将增殖培养的丛生小苗从基部切下，转入壮苗培养基(MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗 糖，pH值5.8)中，进行壮苗培养。培养环境同上。大约培养25d，小苗长至3~4cm高。
[0071] 将小苗从基部剪下，去除小苗下半部分的叶片，插入生根培养基（1/2MS+0.5mg/L ΙΒΑ+0·05mg/L NAA+5·0g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH值5·8)中。8d左右，小苗基部有根原基长出， 11d，有新根长出，待新根长至0.5cm以上时，即可炼苗移栽。
[0072]首先将试管苗封口膜绑绳松开，在培养室适应1~2d，转入遮光度50%的温室中 (不要通风），去掉封口膜，炼苗2~3d，待小苗气孔可自主开合后，用镊子轻轻将小苗夹出， 清水洗去基部残留的培养基，移栽到装有混合育苗基质的花盆中，利用间歇喷雾装置或人 工喷水保持相对湿度在80 %以上，如此驯化炼苗5~IOd后，长出新根，新芽萌出，逐渐减少 饶水次数并进行常规管理。
[0073 ]花盆中混合育苗基质的成分以体积比计为:珍珠岩:锯末:腐殖土 = 30:30:40。 [0074]按照该实施例的结果如下表：
[0076]上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范 围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不 需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1. 一种国槐子叶体细胞胚诱导的快速繁殖方法，其特征是:包括以下步骤： (1) 将国槐子叶接种在体细胞胚诱导培养基上培养形成愈伤组织，所述体细胞胚诱导 培养基为：A+3.0~5.0mg/L 2,4-D+0.5~l.Omg/L BA+0.5~l.Omg/L NAA+0.1 ~0.5mg/L TDZ+0 · 5~1 · Omg/L谷氨酰胺+0 · 5~1 · Omg/L CH+5 · Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0; (2) 将上述愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，培养形成丛生芽小苗，所述不定芽诱 导培养基为：A+0.1 ~0.5mg/L BA+0.1 ~0.5mg/L NAA+0.5~1.0mg/L谷氛醜胺+0.5~ 1 · Omg/L CH+5 · Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0; (3) 将丛生芽小苗切成愈伤块转接到试管苗增殖培养基上进行增殖快繁培养，所述试 管苗增殖培养基配方:MS+1 · 0~2 · Omg/L BA(6-苄基腺嘌呤)+1 · 0~2 · Omg/LIBA(吲哚丁酸） +5 · Og/L 琼脂+30g/L 蔗糖，pH值5 · 8 ~6 · 0; (4) 将增殖培养的丛生芽从基部切开，转入壮苗培养基中，进行壮苗培养，所述壮苗培 养基为:MS+5 · Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0; (5) 将壮苗培养后的小苗切成单株转接到生根培养基上培养后，即可炼苗移栽，所述生 根培养基为：1/2MS+0 · 1 ~0 · 5mg/L ΙΒΑ+0~0 · 05mg/L NAA+5 · Og/L琼脂+20g/L蔗糖，pH值 5.8~6.0，所述1/2MS是MS全量减半； (6) 炼苗移栽。2. 如权利要求1所述的快速繁殖方法，其特征是:所述步骤(1)中国槐子叶的采集方法： 选取当年生国槐种子，去除果荚，清洗干净后准备消毒;将国槐种子消毒后，用手术刀 片和镊子轻轻剥去种皮，将子叶取出，用手术刀划3~4个伤口。3. 如权利要求2所述的快速繁殖方法，其特征是:所述消毒为:于超净工作台上，用体积 分数为70%酒精浸泡30~60s，无菌水冲洗2~3次，再用质量分数为0.1%升汞溶液消毒8~ 12min，然后用无菌水冲洗4~6次。4. 如权利要求1所述的快速繁殖方法，其特征是:所述步骤（1)中子叶接种时的处理方 法:取消毒好的种子剥去种皮，将子叶取出，将两片子叶分开，保留胚芽，然后将子叶较平的 那面朝下，凸面朝上放置在培养皿中，用手术刀片垂直于子叶凸面面主脉划3~4个伤口。5. 如权利要求1所述的快速繁殖方法，其特征是：所述各步骤中培养条件除特殊说明 外，均为培养室温度白天25 ± 2 °C，夜晚18 ± 2 °C，光照强度1000~15001X，光照时间16h/d。6. 如权利要求1所述的快速繁殖方法，其特征是:所述A培养基为MS常量营养元素、MS微 量营养元素和B5有机试剂;所述MS培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。7. 如权利要求6所述的快速繁殖方法，其特征是:所述MS培养基的常量营养元素的组分 和其对应的浓度如下：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，七水硫酸镁370mg/L，无水磷酸二 氢钾170mg/L，二水氯化钙440mg/L，乙二胺四乙酸二钠37 · 3mg/L，七水硫酸亚铁27 · 8mg/L。8. 如权利要求6所述的快速繁殖方法，其特征是:所述MS培养基的微量营养元素的组分 和其对应的浓度如下：四水硫酸锰22 · 3mg/L，硫酸锌8 · 6mg/L，硼酸6 · 2mg/L，碘化钾0 · 83mg/ L，钼酸钠 0 · 25mg/L，硫酸铜 0· 025mg/L，氯化钴 0· 025mg/L。9. 如权利要求6所述的快速繁殖方法，其特征是:A配方所述的B5有机试剂的组分和其 对应的浓度如下:盐酸硫胺素 l〇〇mg/L，烟酸10mg/L，盐酸吡咳醇10mg/L，肌醇1000mg/L; MS配方所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下:甘氨酸20mg/L，盐酸硫胺素10mg/ L，烟酸1 · 0mg/L，盐酸吡咳醇1 · 0mg/L，肌醇100mg/L。10.如权利要求1所述的快速繁殖方法，其特征是:所述步骤(6)中炼苗移栽的具体步骤 为:将试管苗封口膜绑绳松开，在培养室适应1~2d，转入遮光度50 %的温室中，去掉封口 膜，炼苗2~3d，待小苗叶片上的气孔自主开合后，用镊子轻轻将小苗夹出，清水洗去基部残 留的培养基，移栽到装有混合育苗基质的花盆中，保持相对湿度在80 %以上。
【专利摘要】本发明公开了一种国槐子叶体细胞胚诱导的快速繁殖方法，步骤如下：选取国槐当年生无病虫害成熟种子消毒后，取出子叶，划伤后接种在体胚诱导培养基上培养形成愈伤组织；将上述愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，培养形成丛生芽小苗；将丛生芽小苗切成愈伤块转接到试管苗增殖培养基或不定芽诱导培养基上进行培养；将培养的丛生芽转入壮苗培养基中，进行壮苗培养后即可炼苗移栽。本发明方法，再生率高、出芽多，植株移栽成活率可达到90％以上，种苗生长健壮，可有效解决优良种苗种质退化问题。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105638472
【申请号】
【发明人】庞彩红, 李双云, 孙超, 王因花, 毛秀红, 刘盛芳, 王学文, 夏阳
【申请人】山东省林业科学研究院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月12日