专利名称：一种利用颠茄外植体诱导胚性细胞的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特指一种利用颠茄(Atropa belladonna L .)无菌苗诱导胚性细胞以及胚性细胞再生植株的方法。
背景技术：
东莨菪碱(scopolamine，C17H21O4N)和莨菪碱(hyoscyamine，C17H23O3N)(其外消旋体为阿托品)均为莨菪烷类生物碱(Tropane alkaloids, TAs是)，是在临床上广泛使用的两种重要的基本药物。主要用于镇痛、麻醉、抗晕动药、治疗帕金森症、改善微循环、戒毒脱瘾、治疗农药中毒等，市场需求十分巨大。随着TAs是新功能的不断开发，其需求还在迅速增长。TAs 是主要从茄科植物颠茄belladonna ),^^^ {Hyoscyamus niger )、曼陀罗(J)atura stramonium)中提取，产量有限。其中颠茄是TAs是最主要的商业栽培药源， 我国药典规定的唯一 TAs是是药源植物。体细胞胚胎发生是体细胞向胚胎发生途径转变的发育再建过程，也是植物全能性预言的最好说明。体细胞胚发生现象被看作是开展生物学理论研究的良好模型。研究颠茄体细胞胚发生对于阐明植物发育的分子机理，促进中草药的遗传工程改良，无论在基础理论还是在实际应用价值上都具有极其重要的意义。通过颠茄胚性再生植株，可以快速大量繁殖颠茄脱毒苗，胚性细胞也可创造、筛选优良无性系，获得TAs是含量相对较高而稳定的植株，也可作为转基因的受体培育高产转基因颠茄，为TAs是的生产提供优质新型药源，目前除了本实验室的研究成果外，尚无相关报道。
发明内容
本发明的第一目的就是提供一种利用颠茄外植体诱导胚性细胞以及胚性细胞再生植株的方法。通过建立适合颠茄的胚性细胞悬浮培养体系，该体系通过体细胞胚胎发生途径再生植株，达到以颠茄胚性细胞为受体，建立快速、高效的转基因颠茄以及利用胚性细胞突变筛选优良无性系的目的。本发明是这样实现的
一种以颠茄胚性细胞为受体的遗传转化方法，其以颠茄茎尖或侧芽、种子为材料，以附加2，4-D 3. Omg/L的MS固体培养基(MSA)诱导胚性细胞；胚性细胞的扩繁继代将胚性细胞在以附加2，4-D 2. 0mg/L的MS固体培养基(MSB)上筛选、继代培养。在附加2，4_D 2. 0mg/L、0. 2mg/mL 6-苄氨基嘌呤(6_BA)、2. 2g/L KCl、40g/L 蔗糖的 MS 液体培养基(LMS) 上悬浮培养；最后将胚性细胞在MS培养基上再生完成植株重建。胚性细胞可用作转基因的优良受体以及使用遗传物质诱变剂处理的受体。具体包括
1)颠茄无菌外植体的获得
利用颠茄成熟叶片、茎段或种子，消毒处理后接种后于MS培养基，光照培养，获得材
3料，适时继代，继代时将其剪成带有两片展开叶的节段接种。2)胚性细胞悬浮培养体系的建立
剥取颠茄茎尖或侧芽分生组织，以及种子消毒灭菌后突破种皮的胚切成数段后，接种于附加2，4-D 3. Omg/L的MS固体培养基(MSA)中，光照培养，4_6周后，即可获得胚性细胞。 在Mkon SMZ800体视显微镜下，放大观察，筛选诱导出来的典型胚性细胞，在附加2，4-D 2. Omg/L的MS固体培养基(MSB)上纯化保存、扩繁，每月一次。3)胚性细胞的液体培养
胚性愈伤在扩繁6-8周后，将胚性愈用筛网破碎成均勻的小细胞团，转移到加有适当体积的附加 2，4-D 2. Omg/L,0. 2mg/mL 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、2. 2g/L KCl、40g/L蔗糖的MS 液体培养基(LMS)中悬浮培养，3-10d继代一次，细胞团较大时用0. 5mm筛网进行破碎。4)植株再生
将胚性愈伤细胞再转移至MS固体培养基上，25°C光照(16L/8D)筛选培养。在2_6周间将平皿上出现愈伤变绿，每月转移到新鲜MS固体培养基上继续再生，体胚会逐渐成熟， 最终形成丛生芽和小植株。在本发明中，获得的胚性细胞可用于脱毒苗，也可以利用遗传物质诱导突变产生新的新品系，也可以作为转化受体获得了高产TAs是的颠茄转化子，为TAs是的生产提供了一种新型优质的可持续使用的药源。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1
颠茄无菌外植体的获得
方法一利用叶片建立颠茄无菌外植体
采取颠茄成熟叶片，或带节的茎段，流水冲洗1小时；75%乙醇处理30秒，然后用2% (M/V) NaClO溶液或0. 1% (M/V)升汞(HgCl2)浸泡10分钟，用无菌水冲洗6次；然后接种在添加丛生芽诱导培养基中(培养基于121 灭菌20分钟后分装于培养瓶或平皿中)，该培养基配方为MS基本培养基，添加植物生长调节物2.0 mg/L BAP (苄基腺嘌呤)，0.3 mg/L NAA (萘乙酸)，3(^/1蔗糖，？!1值为5.8，再添加5(%琼脂粉。在光照培养箱中培养颠茄的幼芽，培养条件为25°C，12小时光照，光照强度为55μπι01. πΓ2. s—1。40天后，即可获得无菌的颠茄无菌外植体，接种继代于MS培养基中，等到5个节以上时可用于剥离茎尖或侧芽分生组织。方法一利用茎段建立颠茄无菌外植体
采取颠茄带节的茎段，流水冲洗1小时；75%乙醇处理30秒，然后用2% (M/V) NaClO 溶液或0. 1% (M/V)升汞(HgCl2)浸泡10分钟，用无菌水冲洗6次；然后接种在MS培养基中。在光照培养箱中培养诱导侧芽萌发成苗，培养条件为25°C，12小时光照，光照强度为 55ymol. πΓ2. s—1。10天后，即可获得无菌的颠茄无菌外植体，等到5个节以上时可用于剥离茎尖或侧芽分生组织。
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方法二 利用颠茄种子在无菌条件下萌发获得无菌外植体
水选法筛选成熟饱满的种子，流水冲洗1小时；75%乙醇处理30秒，然后用2% (M/V) NaClO溶液或0. 1 % (M/V)升汞(HgCl2)浸泡10分钟，用无菌水冲洗6次；然后接种在MS 培养基中。在光照培养箱中培养诱导侧芽萌发成苗，培养条件为25°C，12小时光照，光照强度为55μπι01. πΓ2. s—1。30天后，即可获得无菌的颠茄无菌外植体，等到5个节以上时可用于剥离茎尖或侧芽分生组织。实施例2
胚性细胞悬浮培养体系的建立
方法一利用颠茄无菌苗茎尖或侧芽诱导获得胚性细胞
在Nikon SMZ800体视显微镜下，放大观察，用注射器针头剥取长约0. 5mm的颠茄茎尖或侧芽分生组织，接种于附加2，4-D 3. Omg/L的MS固体培养基(MSA)中诱导培养基上， 25°C，光照培养，4-6周后，即可诱导胚性细胞。在体视显微镜放大600-800倍的条件下筛选诱导出来的胚性细胞，诱导出来的体胚可通过继代到新的附加2，4-D 2. Omg/L的MS固体培养基(MSB)继代保存。方法一利用颠茄种子诱导获得胚性细胞
水选法筛选成熟饱满的种子，流水冲洗1小时；75%乙醇处理30秒，然后用2% (M/V) NaClO溶液或0. 1 % (M/V)升汞(HgCl2)浸泡10分钟，用无菌水冲洗6次；然后接种在MS 培养基中。在光照培养箱中培养诱导侧芽萌发，胚芽突破种皮后取出胚体，切成数段，转至 MSA培养基中，25°C，光照培养，4-6周后，即可诱导胚性细胞。在体视显微镜放大观察的条件下筛选诱导出来的胚性细胞接种于MSB保存备用。实施例3
胚性细胞的筛选、扩繁、继代
诱导出来的胚性细胞可通过继代到新的胚性细胞诱导培养基上保存，每月继代一次， 同时将非胚性愈伤去除以纯化体胚，体胚经纯化和扩繁以便保存和提供悬浮培养的材料。胚性愈伤细胞在扩繁6-8周后，将胚性愈伤细胞过0.5mm的筛网破碎成小细胞团， 转移到加有30-50ml的MS悬浮培养基的三角瓶或者塑料瓶中悬浮培养，3-10d继代一次，需要在继代时用0. 5mm筛网进行破碎。悬浮培养条件为30°C，摇床转速为120rpm。实施例4
胚性细胞再生获得植株
1、将过筛后悬浮培养10-30d的细胞培养液去除，并可以用新鲜培养基清洗愈伤一次；
2、吸干细胞，转至新鲜的MS固体培养基上，25°C光照(16L/8D)培养。每培养20-30天转移到新鲜MS培养基上，在2-6周间将平皿上出现的绿色胚状体，体胚会逐渐成熟，最终形成丛生芽和小植株。
权利要求
1.一种利用颠茄外植体诱导胚性细胞的方法，特征在于附加2，4-D 3.0mg/L的MS固体培养基MSA诱导胚性细胞，胚性细胞在以附加2，4-D 2. Omg/L的MS固体培养基MSB上筛选、继代培养，其过程包括(1)在颠茄无菌苗长侧芽诱导胚性细胞，诱导胚性细胞，以附加2，4-D3. Omg/L的MS固体培养基MSA诱导胚性细胞；(2)胚性细胞的扩繁继代将胚性细胞在以附加2，4-D2. Omg/L的MS固体培养基MSB 上筛选、继代培养，在附加2，4-D 2. Omg/L,0. 2mg/mL 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、2. 2g/L KC1、 40g/L蔗糖的MS液体培养基LMS上悬浮培养；(3)胚性细胞诱导植株再生将胚性细胞在MS培养基上再生完成植株重建。
2.根据权利要求1所述的利用颠茄无菌苗诱导胚性细胞的方法，其特征在于无菌苗或者继代苗长至5片叶以上时，去除顶芽和叶片，继续培养2天以上，诱导侧芽发生后，在体视显微镜下剥离茎尖，接种于体细胞胚诱导培养基上培养。
3.根据权利要求1所述的利用颠茄无菌苗诱导胚性细胞的方法，其特征在于所述颠茄胚性细胞要不断进行纯化，其方法是在体视显微镜放大筛选诱导出来的典型胚性细胞， 在新的MSB培养基上继代、保存。
4.根据权利要求1所述的利用颠茄无菌苗诱导胚性细胞的方法，其特征在于所述步骤(3)中的利用胚性细胞悬浮培养使用较高浓度的KCl和蔗糖的液体培养基，即附加2，4-D 2. Omg/L、0. 2mg/mL 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、2. 2g/L KCl、40g/L 蔗糖的 MS 液体培养基。
全文摘要
本发明提供了一种诱导颠茄胚性细胞的方法。涉及包含离体培养系统建立，胚性细胞的诱导、胚性细胞悬浮培养，以及利用胚性细胞获得植株再生。其过程是用颠茄无菌苗长诱导胚性细胞，胚性细胞的扩繁继代，胚性细胞诱导植株再生。该方法诱导获得的胚性细胞可用于生产脱毒苗，也可以利用遗传物质诱导突变产生新的新品系，也可以作为转化受体获得了产莨菪烷类生物碱的颠茄转化子。
文档编号A01H4/00GK102396417SQ20101027624
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者唐克轩, 廖志华, 张磊, 杨春贤, 陈敏 申请人:西南大学