一种改良猪肌肉品质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种改良猪肌肉品质的方法。本发 明构建了猪骨骼肌特异性启动子MCK与过氧化物酶体增殖物激活受体Y (PPARY)结合 P-N1载体构造为肌肉特异性诱导PPARy超表达系统，通过电转染的方式导入猪胚胎成纤 维细胞，并通过体细胞核移植技术制备转基因猪，在转基因猪个体水平上验证其对肌内脂 肪和猪肉品质的影响，为培育出良好肌肉品质的瘦肉猪新品种奠定技术基础。
【背景技术】
[0002] 转基因动物（Transgenic animal)是指运用生物工程的方法将构建好的外源目 的基因片段导入并稳定整合到受体染色体基因组内，从而制备的可稳定遗传给下一代的动 物。1980年Gordon等人使用显微注射方法首次成功制备了转基因小鼠动物模型带有外源 基因HSV和SV40。1982年Palmiter等人运用显微注射方法将大鼠的生长激素基因显微注 射进入小鼠受精卵中，获得所谓的"超级大鼠"，曾经引起整个生物学界的轰动。到目前为 止，人类已获得转基因鼠、鱼、兔、羊、牛和猪等转基因动物。
[0003] 体细胞核移植技术是指将外源目的基因通过电转染或脂质体转染等方式导入到 供体细胞中，选择稳定整合带有外源基因的供体单克隆细胞进行扩增，然后将供体细胞的 细胞核注入一个去核的未受精的成熟卵母细胞中，融合并激活后体外培养重构胚，待重构 胚胎发育到桑椹胚或囊胚后移植入生理同步的假孕动物输卵管中，使其妊娠直至分娩。 1997年Wilmut等人利用此方法制备了转基因羊Dolly。此后获得了转基因小鼠（Wakyama et al.，1998)、转基因猪（Polejaeva et al.，2000)等多种转基因动物。此方法的操作复 杂，胚胎发育率也较低，但转基因效率显著超过显微注射，可以方便的建立生产畜群。
[0004] 利用转基因动物可提高动物的繁育及生长速度，转基因动物在改良动物品种中也 有着较好的应用。1982年Palmiter等通过原核显微注射的方法将大鼠生长激素基因导入 小鼠的基因组后获得转基因巨型小鼠。1988年Vizge等人将猪源生长激素导入猪受精卵 中，获得日增重增加的转基因猪。将人的生长激素基因导入猪的基因组中，制备出的转基因 猪的生长周期显著缩短，具有非常高的经济价值，并且瘦肉率和饲料利用率大幅提高。将人 生长激素基因导入鲤鱼的基因组中，外源的生长激素基因可以在转基因鱼体内有效表达， 并且可以充分发挥导入的外源基因的功能，使转基因鱼能够较快速的生长。这些研究均表 明外源生长激素的表达可以大大促进转基因动物的繁育及生长速度。
[0005] 启动子作为真核生物基因表达调控的顺式作用元件，其含有基因表达调控网络的 重要信息，决定了基因表达的强度及特异性（Kim et al.，2005)。外源基因在细胞或生物 体中的表达需要进行严格控制，在保证具有生物有效性的同时，一方面需要保证对生物体 没有毒副作用以及基因的稳定表达，另一方面需要解决的问题是要定时定量的调控外源基 因的表达，即具备严格的时间和空间的特异性。因此，分离和构建较高活性组织特异性启动 子调控外源基因进行表达的诱导系统成为研究的热点。肌肉肌酸激酶（Muscle Creatine Kinase，MCK)，被证实在骨骼肌和心肌组织中高水平的表达，一些体外转染骨骼肌肌细胞和 成纤维细胞的研究，已鉴定出2个MCK增强子元件和一个近端启动子元件，这些元件只在分 化的骨骼肌细胞中表达，一个包含MCK5'端序列3300个核苷酸的整合基因显示出氯霉素乙 酰基转移酶的活性水平在骨骼肌中，比其它肌肉组织，如肾、肝和脾高1〇 4,在心肌中的表达 也比其它非肌肉组织高2-3个数量级。
[0006] 过氧化物酶体增殖物激活受体y (PPARy)作为脂肪细胞形成的关键调节因子， 在脂肪组织的形成过程中是必须的。但PPARy 2在肌肉中的表达量仅是脂肪的5-10% (Loviscach et al.，2000)。骨骼肌中特异性的敲除PPARy引起严重的胰岛素抵抗，对脂 肪组织和肝脏也有些不利影响（Hevener et al.，2003)。研究证明肌肉细胞培养时异位表 达PPARy和C/EBPa，可以使成肌细胞转分化为成熟的脂肪细胞（Hu et al.，1995)。此外， 之前有研究证实超表达并激活PPAR Y 2可使成肌细胞转分化，促进脂肪细胞的形成（Rosen et al. , 1999 ；Forman et al. , 1995)〇
[0007] 国外血统的长白猪和杜洛克猪两个品种在脂肪沉积方面有很大差异，长白猪比杜 洛克猪有更多的内部脂肪、较少的皮下脂肪和肌内脂肪（Edwards et al.，1992 ;Kolstad et al.，1996)。1998年Grindflek等研究了两个品种间PPARy的表达模式，不同龄的猪 的组织之间有很大的差异。在1日龄时两个猪种的PPARymRNA水平没有差异，但是相对于 长白猪，5周龄和体重lOOKg杜洛克猪的PPARy表达量特别高，发现脾脏组织中的表达模 式也相似。在年幼的长白猪肌内脂肪中PPARy 2的表达量较高，因此我们推断PPARy 2是 影响頂F发育和沉积的重要基因（Grindflek et al.，1998 ;2001)。研究发现PPARy 2基 因在猪群体内存在多个SNPs，启动子区存在Bsr-PCR-RFLP多态性位点（Fan et al.，2011; Grindflek et al.，2004)，该多态性位点在杜洛克猪、长白猪和金华猪（中国地方猪品种） 等很多猪种中存在，与猪肉的嫩度和背膘厚之间呈显著相关，对脂肪相关性状的表达有影 响（Chen et al. 2011 ;Emnett et al.，2000)。而在挪威的商品猪中此位点和脂肪性状的 相关性却不显著（Grindflek et al.，2004)。2013年朱云等研究发现"PPARy 2基因BsrI 位点的不同基因型所对应的脂肪性状如肌内脂肪含量和剪切力都存在显著差异，但是大理 石纹不存在显著性差异"。在牛、羊等动物肌内脂肪的研究也证明PPARy和肌内脂肪的沉 积相关。？?六1?丫2基因是影响畜禽肉质性状的主要候选基因〇^1^的 &的&1.，2000)。
[0008] 猪肉是人类摄取动物蛋白的主要方式。随着人们对猪肉品质的要求的增高和品 质的注重，肉质改良是现今时代猪育种的重要任务。影响猪肉质性状的因素很多，肌内脂 肪含量与肌肉的嫩度、肉色和多汁性直接相关，肌内脂肪含量是影响猪肉品质的重要性状 之一（Wood et al.，1998)，肌内脂肪含量在2-3%时肉质的口感是最佳的（Bejerholm 和Barton-Gade，1986)。然而为了提高瘦肉率，现如今瘦肉型猪的平均肌内脂肪含量降 至1. 5%左右。肌内脂肪含量的遗传改良是可行的，因为肌内脂肪是高度可遗传的性状 (Hovenier et al.，1992)。不同猪种间的肌内脂肪含量不等，这些差异不仅与饲养和管 理有关，还和猪种间的遗传背景相关。当肌内脂肪含量增多时，肌肉的断面呈现较多的大 理石状花纹，肌肉剪切力下降，进而嫩度增加（Van Laack，2001)。对杜洛克猪肉质性状 进行关联研究分析，发现当肌内脂肪含量提升时，肉的系水力提高，肉色变亮（Suzuki et al. , 2005) 〇
[0009] 与本发明密切相关的文献是本申请人所在猪遗传育种农业部重点实验室构建 对卩?六1^2基因的分离克隆以及构建的口附-]\1〇(^^41^2表达载体0^11113即11皿即6七 al. S卩，黄锦亮1，2012)显微注射的方法获得了了模式动物转基因小鼠，在小鼠上初步验证 了 PPAR Y 2基因的功能，结果发现小鼠的骨骼肌中脂肪合成及转运等相关基因的表达出现 不同程度的增加。但是该pNl-MCK-PPAR y 2载体的构建使用的外源基因为猪源的PPAR y 2 基因，并没有在转基因猪个体上进行过生物学功能的验证。
[0010] 迄今为止，尚未见到有关转PPARy 2基因培育改良猪肌肉品质的方法的报道。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种改良猪肌肉品质的方法。本发 明将过氧化物酶体增殖物激活受体Y基因（即PPARY基因）作为改良猪肌肉品质和提高 猪肌内脂肪含量的重要候选基因，通过构建猪骨骼肌特异性启动子MCK，构建与PPARy基 因结合P-N1载体的肌肉特异性诱导PPARy的超表达系统，建立大白猪30日龄胎儿成纤维 细胞系，利用电转染的方法将Swal线性化的表达载体pNl-MCK-PPAR y 2转入大白猪30日 龄胚胎成纤维细胞内，通过体细胞核移植得到肌肉超表达PPAR Y基因的转基因猪。
[0012] 本发明的技术方案如下所示：
[0013] 图1是本发明的总体技术路线图。
[0014] 一种改良猪肌肉品质的方法，其步骤包括克隆PPARy基因（其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示）、制备调控该PPARy基因的启动子（核苷酸序列如SEQ ID N0 :2所示），通 过构建猪骨骼肌中超表达PPARy基因的表达载体和