一种改良的蛋白质印迹方法
【技术领域】
[0001] 本申请涉及生命科学研究领域，具体地涉及改良的蛋白质印迹实验技术。
【背景技术】
[0002] 蛋白质印迹法(免疫印迹试验）即Western Blot，是分子生物学、生物化学和免疫 遗传学中常用的分析方法，并且是一种能对蛋白进行定性和半定量的分析的方法。蛋白免 疫印迹是一种蛋白质检测技术，主要涉及将电泳分离后的从细胞或组织提取的蛋白质从凝 胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原，其基本原理是 通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的已分离的蛋白质进行着色，通过分析着色的位置和着 色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息(参见图1)。
[0003] 蛋白质印迹法现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病 早期诊断等多个方面。蛋白质印迹法可分为电泳、转膜、酶免疫反应，二抗上的酶底物反应 产生信号和蛋白信号检测五个阶段。蛋白质印迹法的灵敏度主要依赖于最终的信号放大与 信号检测，总体可分为两种，即酶促反应和同位素标记放射自显影。其中，放射自显影所用 试剂有辐射性;经典蛋白质印迹法中，对二抗偶联的酶和底物的信号检测方式包括：
[0004] 底物呈色：（二抗用HRP标记）HRP的生色底物有二氨基联苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB)、氯萘酸（4-chlor〇-l_naphthol，4_CN)、CN/DAB、3_氨基_9_乙基味 P坐（3-amino-9-ethylca;rbazol，AEC)和四甲基联苯胺（3,3,5,5tetramethylbenzidine， TMB)等（而得到可溶性产物的底物如0PD、ABTS等则适用于ELISA)中，底物显色主要是利用 底物在有HRP和过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测蛋白质印 迹法的结果；
[0005] 经典增强化学发光法(ECL)(二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇 到HRP，酶促基团发光，结果通过X光片压片使胶片曝光后洗出条带而显影；
[0006] 底物荧光ECF:反应底物为过氧化物和鲁米诺，经HRP催化发生化学反应。
[0007] 底物DAB显色方法的缺点缺陷就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能 永久保存，需要拍照记录，而且有毒;传统的ECL采用X光片检测酶和底物反应产生的化学发 光，该方法需要通过显影和定影两步过程才能实现最终对蛋白的显色。这种方式需要根据 信号强弱调整曝光时间，还需要X光片及显影液，温度过低时(低于16°C)需适当延长显影时 间，因此操作繁琐，有放射性污染的风险，而且不易掌握，成本较高。
[0008] 表1.经典蛋白质印迹法中，HRP的不同生色底物（可参见http:z7www.biofly.cn/ view.asp?id = 44)
[0009]
[0010] 因此，现代生命科学研究领域亟待一种灵敏度高、操作简单的影像获取技术代替 现有蛋白质印迹法的影像显示，改良蛋白质印迹法的操作以降低生命科学科研人员的劳动 强度。
【发明内容】
[0011] 本申请提供了一种改良的蛋白质印迹方法，包括以下步骤：⑴目标蛋白质的SDA-PAGE电泳分离；（2)转膜；（3)酶免疫定位；（4)蛋白信号检测;其中，步骤(3)所述的酶免疫反 应是膜上的目标蛋白质先后分别与特异性一抗和酶标二抗发生反应，所述酶标二抗是偶联 酶标记物的特异性一抗的抗体;并且所述酶标二抗的酶标记与显色底物反应产物产生荧 光，所述步骤(4)是采用活体生物成像装置检测步骤(3)产生的荧光信号。在一些实施方案 中，所述步骤(4)中采用活体生物成像装置检测的曝光时间为0.025s~2.5s，优选0.25s。在 一些实施方案中，所述酶标记物选自辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖 苷酶β中的一种。在一些实施方案中，所述酶标记物是辣根过氧化物酶。在一些实施方案中， 所述与酶标二抗上偶联的酶标记的反应底物包括但不限于DAB、4-CN、CN/DAB、AEC、TMB和 ECL。在一些实施方案中，所述酶标二抗的偶联酶标记的反应物底物是ECL。在一些实施方案 中，所述目标蛋白质包括动物蛋白。在一些实施方案中，步骤(2)中所述转膜是将在凝胶中 已经分离的条带转移至固相膜上，所述固相膜选自硝酸纤维素膜(NC)和PVDF膜中的一种。 在一些实施方案中，步骤(4)所述的活体生物成像装置为荧光成像装置，优选小动物活体成 像仪。
[0012 ]本申请的目的是提供一种灵敏度高，操作简单，成本低的改良的蛋白质印迹方法。
[0013] 本申请实现上述目的的技术方案是：
[0014] -种改良的蛋白质印迹方法，包括步骤：
[0015] ⑴蛋白质的SDA-PAGE电泳分离，
[0016] (2)转膜，
[0017] (3)酶免疫定位，
[0018] (4)蛋白信号检测，
[0019] 其中，步骤(3)所述酶免疫反应是膜上的目标蛋白质先后分别与特异性一抗和酶 标二抗发生反应，所述酶标二抗是偶联酶标记的特异性一抗的抗体。
[0020] 在本申请的改良的蛋白质印迹方法中，所述酶标二抗上的酶标记物与显色底物反 应产物产生荧光，步骤(4)所述蛋白信号检测是在活体生物成像装置检测固体膜在步骤(3) 酶-底物反应产生的荧光信号。本申请的步骤(4)蛋白信号检测步骤中用活体生物成像装置 检测荧光的方式代替传统增强化学发光法(ECL)检测中的X胶片法，避免了 X胶片曝光、显影 和定影等步骤中的不利因素的影响，降低了操作的复杂程度。
[0021 ]本申请的改良的蛋白质印迹方法中，步骤（1)中蛋白质的SDA-PAGE电泳分离利用 的是抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子 量越小，泳动速度就越快的特性分离蛋白样品。蛋白样品可以是动物蛋白。
[0022] 本申请的改良的蛋白质印迹方法中，步骤(2)转膜是选用低电压和大电流，通电将 在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜(NC)或PVDF膜上。所用电压为30V~70V，优 选40V，所用电流为120~250mA，优选200mA，转移时间为2h~4h。
[0023] 本申请的改良的蛋白质印迹方法中，步骤(3)所述酶免疫反应是膜上的目标蛋白 先后分别与特异性一抗和酶标二抗发生反应，所述酶标二抗是偶联酶标记的特异性一抗的 抗体。
[0024] 本申请的改良的蛋白质印迹方法中，步骤(4)酶免疫定位酶标二抗上的酶标记物 与显色底物反应产生荧光，所述蛋白信号检测是采用活体生物成像装置检测步骤(3)产生 的荧光信号。其中，偶联在二抗上的酶标记物包括过氧化物酶P0D类、碱性磷酸酶AP (Alkaline Phosphatase)，葡萄糖氧化酶（Glucose 〇xidase)、0 半乳糖苷酶（β-Galactosidase)，优选地为辣根过氧化物酶HRP(Horseradish Peroxidase)，HRP的生色底 物包括但不限于DAB、4-CN、CN/DAB、AEC、TMB和ECL，优选地为ECL。
[0025] 本申请的改良的蛋白质印迹方法中，目标蛋白质包括动物蛋白。
[0026] 本申请的改良的蛋白质印迹方法中，步骤(4)所述的活体生物成像装置为荧光成 像装置。
[0027] 在本发明一具体实施例中，荧光成像装置为小动物活体成像仪。
[0028] 在本发明一具体实施例中，步骤（4)采用活体生物成像装置检测的曝光时间为 0.5s〇
[0029] 在本发明一具体实施例中，步骤（4)采用活体生物成像装置检测的曝光时间为 0. ls〇
[0030] 在本发明一具体实施例中，步骤(4)采用活体生物成像装置检测的曝光时间为5s。
[0031] 本申请的有益效果是:灵敏度高，操作简单，容易掌握，环保安全。
[0032] 本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变 得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的目的和其他优点可通过在说明书、权利 要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
【附图说明】
[0033]附图用来提供对本申请技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本 申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。
[0034] 图1为免疫印迹法原理示意图；
[0035] 图2为实施例1的兔单克隆抗体的改良的蛋白质印迹法结果(曝光时间为0.5s，从 左至右的泳道M、l、2、3、4、5分别代表Marker (5ul)- Anti-GAPDH和上样浓度为0.925/ 500mg/mL、0 · 925/1000mg/mL、0 · 925/2000mg/mL、0.925/4000mg/mL、0.925/8000mg/mL 的样 品）；
[0036] 图3为实施例2的兔单克隆抗体的改