专利名称：有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱的制作方法
技术领域：
本发明属于蛋白质组学领域，涉及一种分子印迹毛细管整体柱的制备方法，更具体地涉及一种有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱及其制备方法和应用。
背景技术：
分子印迹技术是指制备具有特异性识别作用的客体目标分子的技术，是一种高选择性的仿生识别方法。模板与客体的作用如同“锁与钥匙”之间的作用。分子印迹技术具有三大显著特点构效预定性(predetermination)、特异识别性(specific recognition)和广泛实用性(practicability)，因而发展迅速，在许多领域如色谱分离、固相萃取、仿生传感、模拟酶催化、临床药物分析研究等得到日益广泛的研究。近年来，分子印迹技术逐步拓展到蛋白质的分离、富集、纯化、鉴定等与蛋白质组学相关的生命科学领域。蛋白质印迹聚合物的制备方法主要有包埋法，表面印迹法，和抗原决定基法。目前报导的蛋白质分子印迹技术多为合成聚合物颗粒，其模板分子包埋严重，选择性低，蛋白质固有的特性如体积庞大、构象灵活、结构复杂以及水溶性使得小分子的分子印迹技术不适用于制备蛋白质分子印迹整体柱，因而有关于蛋白质分子印迹整体柱的方法研究鲜有报道。蛋白质印迹的困难集中在如何保持印迹蛋白质构象的的完整性，提高蛋白质印迹聚合物的选择性。整体柱又称连续床、棒状柱或无柱塞柱，是具有无孔填料和膜的快速分离能力，又有高效液相色谱(HPLC)多孔填料的高容量，却不增加柱背压的一种新型高效色谱填料，已被广泛用于高效液相色谱、毛细管电色谱及毛细管液相色谱中。目前制备整体柱的方法多采用自由基原位聚合的方法，与传统的填充柱相比，此方法具有制备简单、易于改性、高容量、传质快、柱效高以及试剂耗量少等优点，特别适合于来源宝贵的微量生物样品，是当前微分离分析领域的研究热点(Sykora. D, Svec. F，Frechet. J. M, J. Chromatogr. A,1999，852: 297)。按其基质不同，整体柱可分为有机聚合物整体柱和无机硅胶整体柱。有机聚合物整体柱是由单体、引发剂、致孔剂等混合物通过原位聚合制备而成的棒状整体，它具有制备简单、结构均匀、重现性较好、柱效较高及可进行快速分离等优点，但有机聚合物整体柱存在着固有的缺点如机械强度相对较差，特别是在有机溶剂的作用下，柱体会发生收缩或溶胀现象，致使柱性能发生变化，导致柱寿命缩短，微孔结构不适宜小分子物质的分离和分析，柱容量低。无机硅胶整体柱则不存在上述缺点，硅胶整体柱的特殊结构使其具有极好的通透性，柱容量和柱效高，机械稳定性好，但也存在一定的缺陷如制备繁琐、需高温老化、抗溶剂性能差，另外，该柱有一定的PH使用范围的限制。近年来发展的有机-无机杂化整体柱结合了有机聚合整体柱和无机硅胶整体柱的优点，具有宽的PH适用范围及良好的机械稳定性。然而，“一步”或“二步”催化法可供选择的有机硅烷种类较少，成本昂贵，反应时间过长，操作繁琐，严重制约着该方法的推广。最新发展的将“一锅法”应用于有机-无机整体柱的制备(Wu M. H, Wu R. A, Wang F. J, Ren L. B，Dong J, Liu Z, Zou H. F.Anal. Chem. , 2009，81: 3529)则有效地解决“一步”或“二步”催化法存在的问题。“一锅法”反应中的多步反应可以从相对简单的原料出发，不经中间体的分离，直接获得结构复杂的分子。具有取材广泛、反应条件温和、反应成本低廉以及环境友好等优点。有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱兼具有机-无机杂化整体柱和分子印迹的优点，操作简单，选择性高，生物兼容性好，为蛋白质的选择性分离提供新的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱及其制备方法和应用，该方法制备过程简单，合成成本低，制备的整体柱具有高选择性及高物兼容性。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
一种有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱的制备方法包括如下步骤
1)将硅烷前驱体、分散剂以及催化剂混合，于冰水浴下剧烈搅拌至透明粘稠状；
2)将有机功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和模板蛋白混合，于0 4°C下超声至完全溶解后加入步骤I)的透明粘稠液，于0 4°C下超声至混合均匀，将混合液注入经乙烯基改性的石英毛细管内，密封后置于水浴锅内，于35 45°C和50 60°C下分别加热8 24小时完成聚合反应，再用十二烷基磺酸钠和乙酸的混合溶液冲洗制得所述的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱。步骤I)中，所述硅烷前驱体为四甲氧基硅烷和四乙氧基硅烷中的一种以及乙烯基二甲氧基娃烧和乙稀基二乙氧基娃烧中的一种的混合物，或四甲氧基娃烧和四乙氧基娃烧中的一种以及3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷和3-(甲基丙烯酰氧)丙基三乙氧基硅烷中的一种的混合物，混合物中两者的体积比为9-3 1 ;分散剂为聚乙二醇10000，用量为硅烷前驱体质量的20%-35% ;催化剂为0. 01mol/L乙酸溶液，催化剂与硅烷前驱体的体积比为4-1:1;
步骤2)中，所述有机功能单体为丙烯酰胺；交联剂为N，N’-亚甲基双丙烯酰胺；致孔剂为甲醇或甲醇和水的混合物；引发剂为偶氮二异丁腈；模板蛋白为溶菌酶、核糖核酸酶A或辣根过氧化物酶；甲醇与水的质量比为30-80:0-50 ;有机功能单体、交联剂、致孔剂和弓I发剂的质量比为7-29:0. 9-3. 9:40-160:0. 2-1. 0 ;有机功能单体与模板蛋白的摩尔比为2000-10000:1 ;有机功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和模板蛋白的总质量占透明粘稠液质量的32%-38%。步骤2)中，十二烷基磺酸钠和乙酸的混合溶液中的十二烷基磺酸钠的重量浓度为2-10%,乙酸的体积浓度为0. 05-0. 1%。一种如上所述的制备方法制得的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱。一种如上所述的制备方法制得的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱用于选择性分离模板蛋白质。本发明的优点如下
I)本发明提供的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱制备方法，制备过程简单，合成成本低，不破坏蛋白质的构象，制得的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱骨架上留有与模板蛋白质体积、结构、极性相匹配的孔穴，识别能力强，能有效地选择性分离模板蛋白，实现高丰度目标蛋白的去除或低丰度蛋白的富集。2)本发明中蛋白质模板分子非常容易从分子印迹整体柱中被洗脱。
3)本发明提供的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱可满足目标蛋白的选择性分离，具有印迹效率高，特异性强等优点。
图I为本发明的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱截面的扫描电镜 图2为图I所示整体柱柱体与管内壁连接处的扫描电镜 图3为溶菌酶蛋白质分子印迹整体柱对溶菌酶蛋白的识别效果 图4为溶菌酶蛋白质分子印迹整体柱对鸡蛋清实际样中溶菌酶蛋白的选择性分离效果图。
具体实施例方式下面通过具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明，但是本发明不仅限于此。本发明采用的原材料可在市场购得，或可用本领域已知的方法合成。实施例I
I.柱子预处理
将毛细管内壁依次用丙酮冲洗30 min、水冲洗30 min、氢氧化钠冲洗12h、水冲洗30min,盐酸冲洗3h,水冲洗30 min,甲醇冲洗30 min,最后通氮气吹干。2.硅烷化
在预处理过的毛细管内注入无水甲醇与甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(Y-MAPS)体积比为1:1的混合液，在45°C下反应12h，然后用甲醇冲洗30 min，在60 °C下氮气吹干。3.柱内合成
准确称取38 mg聚乙二醇10000 (PEG 10000)于圆底烧瓶中，分别加入0. 01 mo I/L的乙酸0.35 mL，四甲氧基硅烷(TMOS)132 u L, y -MAPS 22 U L，在冰水浴条件下剧烈搅拌Ih，混合物呈透明粘稠状。于上述混合物中分别加入14 mg丙烯酰胺(AM)、I. 9 mg N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(BisAM)、甲醇50 u L、水30 y L、0. 5 mg溶菌酶和0. 7 mg偶氮二异丁腈(AIBN)，于0 4 °C下反复超声20 min，直至混合物完全溶解。将粘稠状混合物注入乙烯基改性后的75 Pm内径毛细管中，至25 cm处，两端封口放入40 °C水浴中反应12 h后转A 60 °C水浴中再反应12 h。反应结束后取出冷却至室温，在高压恒流泵的低流速下用含2%(ff/V)十二烷基磺酸钠溶液(SDS)的1%(V/V)乙酸溶液(HAc)和水分别冲洗24h和12h以洗脱模板蛋白和除去未反应的功能单体以及反应产生的一些副产物，制得有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱。4.空白对照物
非分子印迹整体柱的制备，除不加模板蛋白质分子外，其他步骤同上。5.蛋白质样品分析
在微柱液相色谱(U HPLC)模式下，以pH 7. 0，100 mmol/L磷酸盐缓冲液为流动相A，以水为流动相B ;色谱梯度条件0 4 min, 25% A ;4 5min，25-50% A，5 min之后，50% A ;泵流速为0.05 mL/min ;检测波长为214 nm ;竞争蛋白(牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白0VA、胰岛素Ins,各含0.2 mg/mL)与模板蛋白(溶菌酶Lyz (0.2 mg/mL))在上述实施示例中制得的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱上实现高效选择性的分离，其色谱分离图如图3所示。6.实际样分析
取一定体积的鸡蛋清用超纯水稀释1000倍，用0. 45 i! m的纤维素滤膜过滤后置于4 V冰箱中保存，待用。在微柱液相色谱(UHPLC)模式下，以pH 7.0,100 mmol/L磷酸盐缓冲液为流动相A，以水为流动相B ;色谱梯度条件0 5 min, 25% A ;5 6min，25-50% A，6 min之后，50% A ;泵流速为0. 05 mL/min ;检测波长为214 nm ;蛋清样品中的非模板蛋白与溶菌酶(模板蛋白)在本实施示例中制得的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱上实现高效选择性的分离，其色谱分离图如图4所示。通过分段收集，可以实现溶菌酶的高效去除或富集。以上所述仅为本发明的较佳实施 例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
1.ー种有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱的制备方法，其特征在于所述方法包括如下步骤 1)将硅烷前驱体、分散剂以及催化剂混合，于冰水浴下剧烈搅拌至透明粘稠状； 2)将有机功能単体、交联剂、致孔剂、引发剂和模板蛋白混合，于O 4°C下超声至完全溶解后加入步骤I)的透明粘稠液，于O 4°C下超声至混合均匀，将混合液注入经こ烯基改性的石英毛细管内，密封后置于水浴锅内，于35 45°C和50 60°C下分别加热8 24小时完成聚合反应，再用十二烷基磺酸钠和こ酸的混合溶液冲洗制得所述的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱。
2.根据权利要求I所述的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱的制备方法，其特征在于步骤I)中，所述硅烷前驱体为四甲氧基硅烷和四こ氧基硅烷中的一种以及こ稀基ニ甲氧基娃烧和こ稀基ニこ氧基娃烧中的一种的混合物，或四甲氧基娃烧和四こ氧基硅烷中的一种以及3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷和3-(甲基丙烯酰氧)丙基三こ氧基硅烷中的ー种的混合物，混合物中两者的体积比为9-3 1 ;分散剂为聚こニ醇10000，用量为硅烷前驱体质量的20%-35% ;催化剂为0. 01mol/Lこ酸溶液，催化剂与硅烷前驱体的体积比为4_1 I ； 步骤2)中，所述有机功能单体为丙烯酰胺；交联剂为N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺；致孔剂为甲醇或甲醇和水的混合物；引发剂为偶氮ニ异丁臆；模板蛋白为溶菌酶、核糖核酸酶A或辣根过氧化物酶；甲醇与水的质量比为30-80:0-50 ;有机功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂的质量比为7-29:0. 9-3.9:40-160:0. 2-1. 0 ;有机功能单体与模板蛋白的摩尔比为2000-10000:1 ;有机功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和模板蛋白的总质量占透明粘稠液质量的32%-38%。
3.根据权利要求I所述的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱的制备方法，其特征在于步骤2)中，反应温度分别优选40°C和60°C ;反应时间各优选12小吋。
4.根据权利要求2所述的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱的制备方法，其特征在于所述硅烷前驱体混合物中两者的体积比优选为5-6 1 ;分散剂的用量优选为硅烷前驱体质量的25%-30% ;所述催化剂与硅烷前驱体的体积比优选为2-3 1 ;所述有机功能単体、交联剂、致孔剂和引发剂的质量比优选为14-20:2-3:80:0. 7，功能単体与模板蛋白的摩尔比优选为4000-6000 ;甲醇与水的比例优选为5:3，有机功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和模板蛋白的总质量占透明粘稠液质量的34%。
5.根据权利要求I所述的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱的制备方法，其特征在于所述步骤2)中，十二烷基磺酸钠和こ酸的混合溶液中的十二烷基磺酸钠的重量浓度为2-10%，こ酸的体积浓度为0. 05-0. 1%。
6.一种如权利要求I所述的制备方法制得的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱。
7.—种如权利要求I所述的制备方法制得的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱用于选择性分离模板蛋白质。
全文摘要
本发明公开了一种有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱及其制备方法和应用，将硅烷前驱体、分散剂和催化剂混合并水解后，加入到含有机功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和模板蛋白的混合液中，于0～4℃下超声至完全溶解，再注入经乙烯基改性的石英毛细管内，通过原位聚合反应制得有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱。本发明操作简单，反应条件温和，制备的整体柱兼备有机整体柱和无机整体柱的优点，将分子印迹的专一识别特性和整体柱在线分离的特性相结合，为蛋白质组学研究提供一种高丰度蛋白质去除的新方法。
文档编号B01J20/281GK102626609SQ201210110319
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月16日 优先权日2012年4月16日
发明者张兰, 杨黄浩, 林子俺, 林瑶, 陈国南 申请人:福州大学