专利名称：一种蛋白质分子印迹聚合物颗粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质分子印迹聚合物颗粒的制备，具体地说是制备一种颗粒状的分 子印迹聚合物，实现对溶液中的模板蛋白的特异性的识别和结合。
背景技术：
在自然界，很多生命过程都涉及到分子识别，例如免疫应答、配体-受体作用和酶 触反应等。因此，分子识别在生命演变过程中起着重要而特殊的作用。分子印迹技术(MIT) 则是对这一过程的人工模拟。通过制备含有人工识别位点的分子印迹聚合物(MIP)，实现对 某一特定的目标分子的高选择性识别。由于MIT的最终目标是实现人工抗体分子的合成， 因此涉及到高分子化学、材料科学、生物化学、主客体化学和超分子化学等众多学科，是极 具挑战性的研究领域。传统的分子印迹材料大多先制备成整体材料，再通过磨碎过筛，获得 粒径较大(5-100 μ m)且形状不规则的颗粒。因此不仅在用作色谱填料时柱效较低，而且对 于大分子，如蛋白质印迹时，吸附和解吸速度均很慢。为解决上述问题，近年来聚合物颗粒 印迹技术得到了人们的关注，形状规则的印迹聚合物颗粒，能有效提高样品的传质速度，而 且可以用作固相萃取和色谱填料。最近，Tong等采用微乳液聚合方法合成了蛋白质分子印 迹磁性颗粒，具有较大吸附容量(Tan, C.J. ；Tong, Y. W. Anal. Chem. 2007，79，299-306)，但 是制备过程繁琐，所制备的印迹聚合物选择性较差。Bossi等以硅球为基质，制备了 HAS为 模板蛋白的印迹颗粒，吸附和解吸速度较快，但是需要先将模板蛋白共价固定在硅球表面， 形成印迹位点后再用草酸去除，步骤繁琐，而且制备的印迹硅球吸附容量比较低，选择性也 不理想。(Bonini, F. ；Piletsky, S. ；Turner, A. P. F. ；Speghini, Α. ；Bossi, A. Biosens. Bioelectron.2007,22,2322-2328)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白质印迹聚合物颗粒的制备方法，以期解决在制备 蛋白质印迹聚合物时模板蛋白质洗脱困难，所得到的印迹材料吸附解吸速度慢，吸附容量 小，选择性差的缺点。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为以有机聚合物反应溶液为例用甲基丙烯酰胺，甲基丙烯酸为功能单体，哌嗪双丙 烯酰胺为交联剂，硫酸铵和吐温20为辅助试剂，磷酸盐缓冲液为溶剂配制成反应溶液。将 蛋白质溶液通过振荡或者抽滤等方法吸附在多孔硅胶的孔道内。在反应溶液中加入引发剂 后，通过真空泵将反应溶液抽入硅胶的孔道内。隔绝氧气室温反应M小时，腐蚀掉硅球后， 得到蛋白质分子印迹聚合物颗粒。具体为1).为了避免蛋白质变性和将硅胶孔道内吸附的蛋白洗脱下来，建议反应体系为 水相，反应溶液PH值为4-11(根据蛋白质的等电点确定)；所含有机溶液不可使蛋白质变性，体积浓度0-20% ；如乙腈、二甲基亚砜；致孔剂的无机盐浓度0.01-1M。由于蛋白质种类众多，性质复杂，可以根据实际情况予以调整。如 果反应体系为非水相，选择原则为必须保证反应液溶剂不可使蛋白质变性，同时又不将先 吸附在硅胶表面的蛋白质洗脱下来。反应溶液黏度视硅胶孔径大小和灌注方式而定，必须 保证反应溶液可以进入到硅胶孔道内。本例中所用磷酸盐缓冲液的pH值为5-6. 5。磷酸盐缓冲液中所添加的各组分的最 终重量浓度为模板蛋白0.2 1.6%，功能单体3.0 6.0%，交联剂5.0 12.0%，辅助 试剂2. 0 5. 0%，磷酸盐缓冲液和乙腈体积之比为1 4 1 6。2).可以以不同粒径的多孔硅胶颗粒为基质，为了有利于蛋白质和反应溶液在孔 道内的输运，建议孔道直径最少为5倍蛋白质分子直径，最好为10倍以上蛋白质分子直径。 将模板蛋白溶液通过振荡或者抽滤等方法吸附在多孔硅胶的孔道内，蛋白质与硅胶的质量 比为1 10 1 20，在反应溶液中加入引发剂，重量浓度为0.08 0.2%，通过真空泵 将反应溶液泵入硅胶的孔道内，隔绝氧气反应M小时。聚合反应结束后腐蚀掉硅球，得到 蛋白质分子印迹聚合物颗粒。3).制备得到的蛋白质分子印迹聚合物颗粒用含有10%的十二烷基磺酸钠(质量 /体积浓度)和10% (体积浓度)的乙酸混合溶液冲洗M小时，最后用蒸馏水反复冲洗， 直至流出液PH值为7左右。室温下晾干保存。本发明的优点为(1)本方法制备方法简便，步骤少；( 制备的聚合物颗粒粒径 规则；C3)制备的蛋白质印迹整体聚合物具有较快的传质速率，较高的吸附容量和较好分 子识别特性；(4)制备得到的蛋白质分子印迹颗粒聚合物可以作为吸附材料加入到溶液 中，或者做为固相萃取柱的填料来特异性结合溶液中的模板蛋白。
图1是制备的蛋白质分子印迹聚合物颗粒的扫描电镜图(X20000)图2是四个蛋白混合溶液的HPLC色谱图，从左到右分别为核糖核酸酶B，细胞色素 C，猪血清白蛋白和β-乳球蛋白的色谱峰。图3是四个蛋白的混合溶液经过蛋白质分子印迹聚合物颗粒吸附处理后的色谱 图。可以看到处理后溶液中的模板蛋白(猪血清白蛋白)被特异性去除，而对其他蛋白质 的吸附很小。这表明蛋白质分子印迹聚合物颗粒对模板分子具有较好的选择性识别能力。
具体实施例方式按照如下步骤制备一种蛋白质印迹聚合物颗粒。实施例1磷酸盐缓冲液中所添加的各组分的最终重量浓度为模板蛋白0. 2 1. 6%，功能 单体3. 0 6. 0 %，交联剂5. 0 12. 0 %，辅助试剂2. 0 5. 0 %，磷酸盐缓冲液和乙腈体积 之比为1 4 1 6。磷酸盐缓冲液的pH值为模板蛋白等电点士2的范围内调节。将模板蛋白溶液通过振荡或者抽滤等方法吸附在多孔硅胶的孔道内，蛋白质与 硅胶的质量比为1 8-1 20，在反应溶液中加入引发剂和增速剂，重量浓度为0.08 0.2%，通过真空泵将反应溶液泵入硅胶的孔道内，隔绝氧气反应M小时，热引发控制温度 在60°C以下。聚合反应结束后用氟化氢，氟化氢铵或者是氢氧化钠溶液腐蚀掉硅球，得到蛋白质分子印迹聚合物颗粒。 制备得到的蛋白质分子印迹聚合物颗粒用含有10%的十二烷基磺酸钠(质量/体 积浓度)和10% (体积浓度)的乙酸混合溶液冲洗M小时，最后用蒸馏水反复冲洗，直至 流出液PH值为7左右。室温下晾干保存。
模板蛋白为猪血清白蛋白(PSA)。
聚合物颗粒的合成条件如下表所示
权利要求
1.一种蛋白质分子印迹聚合物颗粒的制备方法，其特征在于先将蛋白质吸附在多孔硅胶的孔中，然后灌注反应溶液，并进行反应，最后进行硅胶的 腐蚀，得到蛋白质分子印迹聚合物颗粒。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述反应液为有机聚合物溶液或天然的高分子材料配制的反应溶液，反应体系为水 相，反应溶液PH值为4-11 ；反应溶液在硅胶孔道内发生的反应为聚合反应或凝聚反应；反应结果是在硅胶孔道内 充满连续的整体材料。
3.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述天然的高分子材料为壳聚糖或 琼脂糖。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于制备不同粒径的聚合物颗粒可以选用不同粒径和孔径的多孔硅胶作为基质，多孔硅胶 的孔道是相互连通的；硅胶孔道直径> 5倍蛋白质分子直径度；所述蛋白质是任何一种或者多种的蛋白质配成的蛋白质溶液，蛋白质溶液浓度 0. l-5mg/mL，蛋白质与硅胶的质量比为1 8-1 20。
5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述蛋白质溶液为蛋白质的磷酸盐缓冲液，PH值为4-11，磷酸盐缓冲液中所添加的蛋 白质最终重量浓度为0. 2 1. 6% ；所述反应溶液采用磷酸盐缓冲液配制，各组分的最终重量浓度为功能单体浓度为 3. 0 6. 0%，交联剂哌嗪双丙烯酰胺浓度为5. 0 12. 0%，功能单体为甲基丙烯酸与甲基丙烯酰胺，它们的质量比为1 15-21 ；引发剂为过硫酸 铵重量浓度为0. 01-0. 04%，增速剂为N, N, N、，N:四甲基乙二胺重量浓度为0. 05-0. 2% ； 分散剂Tween-20或乙腈重量浓度为0-20% ；致孔剂硫酸铵浓度为0. 01-1M ；功能单体与蛋白质用量的摩尔比为2000-4000 1。
6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于反应于温度23-27°C，时间14-M小时。
7.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于制备得到的蛋白质分子印迹聚合物颗粒用含有10%的十二烷基磺酸钠(质量/体积浓 度)和10% (体积浓度)的乙酸混合溶液冲洗M小时，最后用蒸馏水反复冲洗，直至流出 液PH值为7，室温下晾干保存；制备得到的蛋白质分子印迹聚合物颗粒具有与抗体相似的与模板蛋白特异性结合的 能力。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白质分子印迹聚合物颗粒的制备，具体地说是发明了一种颗粒状的用蛋白质分子印迹技术合成的有机聚合物。即先配制反应溶液，再将蛋白质溶液通过振荡或者抽滤等方法吸附在多孔硅胶的孔道内，然后通过真空泵或其他方法将反应溶液抽入硅胶的孔道内，在硅胶孔道内进行聚合或者凝聚反应，最后聚合或者凝聚反应结束后，腐蚀掉硅球，得到蛋白质分子印迹聚合物颗粒。本发明的优点为制备方法简便，所得聚合物颗粒粒径规则，对模板蛋白吸附量大。与其他分子印迹聚合物颗粒制备方法相比，本方法制备步骤少，所得聚合物颗粒对模板蛋白的吸附解吸速度快，对模板蛋白有很好的特异性识别。
文档编号B01J20/285GK102114416SQ200910248928
公开日2011年7月6日 申请日期2009年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者刘晋湘, 张丽华, 张玉奎, 梁振, 邓启良 申请人:中国科学院大连化学物理研究所