一种β?受体激动剂替代模板分子印迹聚合物微球及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种β?受体激动剂替代模板分子印迹聚合物微球及其制备方法与应用。所述方法包括如下步骤：(1)将模板分子和甲基丙烯酸进行预聚合；模板分子为对羟基苯乙醇或对羟基苯乙胺；(2)向预聚合后的体系中加入二乙烯基苯和偶氮二异丁腈，进行聚合反应得到聚合物；(3)用乙酸的甲醇溶液洗涤聚合物，即得β?受体激动剂替代模板分子印迹聚合物微球。本发明将利用分子印迹聚合物中的模板分子与激动剂空间构型相匹配、具有多重作用点的空穴，能对激动剂进行选择性识别，因此具有了更好的包结络合能力和化学稳定性。本发明测试了分子印迹聚合物磁性微球对β?受体激动剂的吸附性能，并用HPLC/MS/MS对其吸附性能进行检测，并将其应用与尿液中β?受体激动剂的测定。
【专利说明】
一种β-受体激动剂替代模板分子印迹聚合物微球及其制备方 法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种β-受体激动剂替代模板分子印迹聚合物微球及其制备方法与应 用。
【背景技术】
[0002] β-受体激动剂（简称，β-激动剂），在医学或兽医临床上主要用于扩张支气管和增 加肺通气量，可治疗支气管哮喘。激动剂被大量的用于畜牧生产，以促进家畜生长和改善 肉质。近些年由于一些养殖业主受经济利益的驱使，非法使用"瘦肉精"等激动剂，导致了 动物性食品中该类药物残留严重超标，消费者食用这类食品后会产生严重的毒副作用，至 今已发生了多起"瘦肉精"集体中毒和活猪供港受阻事件。这些事件的发生已导致我国畜产 品在国际上声誉下降和消费者对肉类产品安全性的担忧，造成了巨大的经济损失和政治影 响，"瘦肉精"等受体激动剂目前已成了困扰我国畜牧业健康发展的重大问题。因此建立 一种方便可靠的富集检测激动剂及其类似物的方法极为重要。
[0003] 分子印迹技术是将要分离的目标分子与功能单体通过共价或非共价作用进行预 组装与交联剂共聚制备得到聚合物。除去目标分子后，聚合物中形成与目标分子空间互补 并具有预定的多重作用位点的"空穴"，对目标分子的空间结构具有"记忆"效应，能够高选 择性识别复杂样品中的印迹分子。但同时也存在模板分子泄露的可能。尤其对于痕量分析， 残留模板的泄露会直接影响分析结果的准确性，而寻找一个结构与模板分子相似的化合物 即具有相似的母体结构或相同的子官能团。作为替代模板分子可以解决模板分子溶解性能 差，价格高和泄露等问题。
[0004] 用替代模板分子制备的分子印迹聚合物对目标模板分子仍具有较好的选择性。这 是因为替代模板分子印迹聚合物留下的三维空腔结构和作用位点。与模板分子仍具有一定 的匹配性，此外。替代模板分子还可以解决一些特殊的模板分子因溶解性差而难以制备分 子印迹聚合物的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种β_受体激动剂替代模板分子印迹聚合物微球及其制备 方法与应用，本发明制备的受体激动剂替代模板分子印迹聚合物微球，可以直接选择性 分离富集多种受体激动剂，达到快速简便的分离。
[0006] 本发明所提供的β_受体激动剂替代模板分子印迹聚合物微球的制备方法，包括如 下步骤：
[0007] (1)将模板分子和甲基丙烯酸进行预聚合；
[0008] 所述模板分子为对羟基苯乙醇或对羟基苯乙胺；
[0009] (2)向所述预聚合后的体系中加入二乙烯基苯和2,2'_偶氮二异丁腈，进行聚合反 应，得到聚合物；
[0010] (3)用乙酸的甲醇溶液洗涤所述聚合物，即得所述β-受体激动剂替代模板分子印 迹聚合物微球。
[0011] 上述的制备方法中，步骤(1)中，所述预聚反应在乙腈中进行；
[0012] 所述预聚反应的温度可为25°C~30°C，时间可为2~4小时，如在25°C下反应4小 时。
[0013] 上述的制备方法中，步骤(2)中，所述聚合反应在惰性气氛下进行；
[0014] 所述聚合反应的温度可为40~60°C，时间可为12~24小时，如在60°C下反应24小 时。
[0015]上述的制备方法中，所述模板分子、所述甲基丙烯酸、所述二乙烯基苯与所述偶氮 二异丁腈的质量比可为1:4~10:5~20:0.1~0.4,具体可为1:5.8:6.7:0.14。
[0016]上述的制备方法中，所述乙酸的甲醇溶液中乙酸的质量百分含量为5~20%，具体 可为5~10% ;
[0017] 采用所述乙酸的甲醇溶液洗涤所述聚合物，用于去除其中的所述模板分子。
[0018] 上述的制备方法中，所述洗涤步骤之后，所述方法还包括采用甲醇洗涤所述聚合 物的步骤，以除去其中的杂质。
[0019]所述方法制备的β_受体激动剂替代模板分子印迹聚合物微球也是本发明的保护 范围。
[0020] 本发明β-受体激动剂替代模板分子印迹聚合物微球可用于吸附β-受体激动剂；
[0021] 所述β-受体激动剂可为沙美特罗、异克舒令、克伦赛罗、拉贝特罗、莱克多巴胺、利 托君、溴布特罗、溴氯布罗、喷布特罗、马喷特罗和异克伦潘特中至少一种。
[0022] 上述应用中，所述吸附可在PBS缓冲溶液或乙酸铵缓冲溶液中进行；
[0023]所述PBS缓冲溶液或所述乙酸铵缓冲溶液的pH值可为2~11.0,具体可为3~8或 6.5〇
[0024] 所述吸附的时间可为5~30min，具体可为5min。
[0025] 本发明所述β-受体激动剂替代模板分子印迹聚合物微球还可用于检测尿液中的 β-受体激动剂。
[0026]本发明具有如下有益效果：
[0027] 本发明将利用分子印迹聚合物中的模板分子与激动剂空间构型相匹配、具有多重 作用点的空穴，能对激动剂进行选择性识别，因此具有了更好的包结络合能力和化学稳定 性。本发明运用多种手段对于制得的分子印记微球进行表征，以表现所制备微球优良的性 能，并对其吸附性能进行了测试。本发明测试了分子印迹聚合物磁性微球对受体激动剂 的吸附性能，并用HPLC/MS/MS对其吸附性能进行检测，并将其应用与尿液中β-受体激动剂 的测定。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明实施例1制备的分子印迹聚合物微球的扫描电镜照片。
[0029]图2为本发明实施例1制备的丽IP与丽IP对β-受体激动剂的吸附量。
[0030] 图3为本发明实施例1制备的丽IP在不同pH值条件下对β-受体激动剂的吸附效果。
[0031] 图4为本发明实施例1制备的丽IP对β-受体激动剂的吸附量随吸附时间的变化。
[0032] 图5为本发明实施例1制备的MMIP对尿液中β-受体激动剂的吸附量随吸附时间的 变化。
【具体实施方式】
[0033] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0034] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035]下述实施例中HPLC-MS/MS的检测方法如下：
[0036] 1、LC_MS/MS 的条件：
[0037] a)色谱柱:Ci8 100mmX3.0mm，粒径 1·7μηι。
[0038] b)柱温：40 °C。
[0039] c)进样量：10yL。
[0040] d)流动相及流速见表1。
[0041 ] 表1流动相及流速表
[0042]
[0043] 2、质谱条件：
[0044] a)离子源:电喷雾离子源。
[0045] b)扫描方式:正离子模式。
[0046] c)检测方式:多反应监测。
[0047] d)脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体 流量以使质谱灵敏度达到检测要求。
[0048] e)毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最佳灵敏度。
[0049] f)定性离子对、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表2。
[0050] 表2 β-受体激动剂的定性、定量离子对及锥孔电压、碰撞电压的参考值
[0051]
[0052]
[0053] 实施例1、β_受体激动剂替代模板分子印迹聚合物微球(MMIP)的制备
[0054] 将对羟基苯乙胺0.138g、MMA 850mL(0.8024g)溶解于15mL乙腈中，超声15min，25 °C放置4h，使模板分子与功能单体充分发生作用，然后加入二乙烯基苯lmL( 20mmol， 0.919g)、AIBN 20mg，超声处理lOmin，使其充分溶解混合，向混合溶液中通入N22min后，密 封，于60 °C水浴聚合24h，得玻璃状的固体聚合物(MIP)。将该聚合物粉碎、聚合物进行研磨， 再使用300目的筛子进行筛分，得到粒径小于48μπι的聚合物;再使用质量分数为5~20%乙 酸的甲醇溶液洗脱模板分子，再使用甲醇进行清洗，至清洗液中无杂质，再在温度为60°C下 进行干燥9h~12h，得到β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物。
[0055] 本实施例制备的分子印迹聚合物微球的扫描电镜照片(5.0kv，5.6mm，10.0 k)如图 1所示，可以看出，丽IP呈大小均匀的球状，内径约为lym左右。
[0056] 本发明为了对比本发明ΜΜΙΡ的表征和吸附效果，制备了非分子印迹聚合物作为对 照，记为ΜΝΙΡ，制备方法基本与上述方法相同，不同之处在于:在制备方法中不加入模板分 子对羟基苯乙胺。
[0057] 实施例2、β_受体激动剂替代分子印迹聚合物微球吸附性能的研究
[0058] (1 )β_受体激动剂替代分子印迹聚合物微球的吸附选择性
[0059] 分别准确配制100ng/mL的22种结构类似物的ρΗ8·0的PBS标准溶液，加入10mg的分 子印迹微球吸附相同时间后进行HPLC-MS/MS检测。
[0060]吸附结果见表3,结果表明合成的分子印迹微球对于克伦特罗、沙丁胺醇、氯丙那 林、西马特罗、马步特罗等激动剂的吸附效果最差，吸附率不足35%。而对苯乙醇胺A、拉贝 特罗、异克舒令和沙美特罗的吸附率可以达到99%以上，其它如莱克多巴胺，班布特罗等结 构类似物吸附效率相对偏低，但也可达50%以上。这可能是由于MMIP在吸附过程中优先选 择的是对羟基苯乙酮类的化合物，然后再根据空腔中的活性位点选择其它化合物。本发明 中合成的分子印迹微球对于多种激动剂药物都有较高的吸附效率，这说明MMIP已经可以于 用激动剂类药物萃取和处理。
[0061 ]表3丽IP对于各种激动剂的吸附情况
[0062]
[0063] (2)分子印迹磁性微球与非分子印迹微球的比较
[0064]配制200yg/L的苯乙醇胺A、拉贝特罗、沙美特罗和莱克多巴胺的标准溶液，分别加 入10mg的MMIP和MNIP颗粒，以2mL pH6.5的PBS缓冲溶液吸附相同时间后，0.8mL 2%乙酸-水洗脱后进行HPLC/MS/MS检测，吸附量如图2所示，可以看出，MMIP吸附后的激动剂明显多 于丽IP，大约为丽IP的2~4倍。
[0065] (3)MMIP的吸附溶液与实验条件
[0066] 配制的100ng/mL标准溶液，分别以超纯水、不同pH的roS缓冲溶液、0.1M盐酸溶液 和0.1M氢氧化钠溶液作溶剂，加入1 Omg制备的分子印记微球，吸附相同时间后进行HPLC/ MS/MS检测。同时添加空白实验，结果如图3所示。
[0067]由图3可以看出，本发明分子印记微球在pH3~8.0的PBS缓冲溶液中达到较好的吸 附效果，而在强酸或强碱条件下吸附效果较差。
[0068] (4)MMIP的洗脱溶液优化条件
[0069] 取实施例1中制备的聚合物，加入2mL不同的洗脱溶液，漩涡混合，于摇床上摇动 30min，离心，上机检测，进行不同种洗脱溶剂进行考察。结果发现用5~10wt%的乙酸或甲 酸的甲醇溶液均将MMIP上的目标分子全部洗脱下来;考虑到实际应用，因此选用5~10%甲 酸的甲醇溶液作为洗脱溶剂。
[0070] (5)分子印迹微球的吸附时间考察
[0071] 分别准确称取1 Omg分子印记微球，在1ml，pH = 6 · 5，20ppb浓度的激动剂的PBS溶液 中，分别在摇床上以163r/min的速度常温摇振吸附2、5、10、20、30和50min，再离心5min， 5000r/min取上清液，将吸附液氮气吹干，用lml 0.1 %甲酸水溶液复溶，过0.22μπι水膜，最 后上机检测，计算激动剂的吸附效率。
[0072] 结果如图4所示，由图4可以看出，该分子印记微球对激动剂吸附在5min左右达到 饱和吸附，当吸附时间超过5min的时候，吸附量保持稳定，因此吸附时间选择5min为宜。
[0073]实施例4、MMIP对尿液中激动剂的方法应用
[0074] 1、吸附与洗脱时间实验条件
[0075] (1)分子印记微球在尿液体系中的吸附效果
[0076] 取空白尿液样品2mL，置于具塞离心管中，准确加入100ng/mL激动剂和2mL0.2mM乙 酸铵溶液，50μ?3-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，20yL激动剂内标标准溶液和10mg分子印记 微球。涡旋混匀30s。反应30min，检测其吸附能力，结果如表2所示。
[0077]由表2中的数据可以看出，虽然与PBS溶液体系相比，吸附能力有所下降，但是回收 率仍然能达到50%以上，结果表明，本发明制备的分子聚合物微球可以应用于尿液酶解体 系中，并且吸附效果较好。
[0078] 表4 MMIP在PBS溶液(pH值为6.5)和尿液中对于各种激动剂的吸附情况
[0079]
[0080]
[0081 ] (2)分子印记微球在尿液体系中的稳定性
[0082] 取空白尿液样品2mL，置于具塞离心管中，准确加入1 OOng苯乙醇胺A、拉贝特罗、沙 美特罗和莱克多巴胺标准溶液和2mL 0.2mM乙酸铵溶液，50μ?3-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯 酶，20yL激动剂内标标准溶液和10mg分子印记微球。涡旋混匀30s。分别在摇床上以163r/ min的速度常温摇振2h、4h、8h和16h，结果如图5所不。结果表明：在16小时内，所制备的分子 聚合物微球吸附量维持不变，吸附稳定性好。
[0083] (3)分子印记在尿液中的洗脱条件的选择
[0084] 洗脱实验：溶液清除的分子印记材料，加入lmL 5 %甲酸的甲醇溶液，分别混合 3〇8、1111；[11、21]1；[11和51]1；[11，结果表明，该分子在5%甲酸甲醇洗脱效果良好，可以直接混合308， 便可进行处理。
[0085] 2、应用丽IP测定尿液中激动剂的方法
[0086] 称取2~5mL样品于50mL离心管中，准确加入2~5mL乙酸铵溶液(4.6)和50μLβ-葡 萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，20yL激动剂内标标准溶液、20~50mg分子印记微球。37 °C水解 过夜(应大于16小时），然后于8000r/min离心5min，弃去上清液。加入2mL5%甲酸甲醇，漩祸 混合30s，收集上清液，用氮吹仪在50°C条件下吹干或用旋转蒸发仪蒸干，用1. OmL样品稀释 液溶解，过0.22μπι滤膜。用HPLC-MS/MS法测定，分别相应的氘代内标物作为内标以内标法定 量。使用该方法测定尿液中11种激动剂回收率大于75%，相对偏差小于15%。
【主权项】
1. 一种β-受体激动剂替代模板分子印迹聚合物微球的制备方法，包括如下步骤： (1) 将模板分子和甲基丙烯酸进行预聚合； 所述模板分子为对羟基苯乙醇或对羟基苯乙胺； (2) 向所述预聚合后的体系中加入二乙烯基苯和偶氮二异丁腈，进行聚合反应，得到聚 合物； (3) 用乙酸的甲醇溶液洗涤所述聚合物，即得所述β-受体激动剂替代模板分子印迹聚 合物微球。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)中，所述预聚反应在乙腈中进 行； 所述预聚反应的温度为25°C~30°C，时间为1.0~4.0小时。3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)中，所述聚合反应在惰性 气氛下进行； 所述聚合反应的温度为40~60 °C，时间为12~24小时。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于:所述模板分子、所述甲基 丙稀酸、所述二乙烯基苯与所述2,2'-偶氮二异丁腈的质量比为1:4~10:5~10:0.1~0.4。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于:所述乙酸的甲醇溶液中乙 酸的质量百分含量为5~20% ; 所述洗涤步骤之后，所述方法还包括用甲醇清洗所述聚合物的步骤。6. 权利要求1-5中任一项所述方法制备的β-受体激动剂替代模板分子印迹聚合物微 球。7. 权利要求6所述β-受体激动剂替代模板分子印迹聚合物微球在吸附β-受体激动剂中 的应用； 所述受体激动剂为沙美特罗、异克舒令、克伦赛罗、拉贝特罗、莱克多巴胺、利托君、 溴布特罗、溴氯布罗、喷布特罗、马喷特罗和异克伦潘特中至少一种。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述吸附在PBS缓冲溶液或乙酸铵缓冲溶 液中进行； 所述吸附的时间为5~30min。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述PBS缓冲溶液或所述乙酸铵缓冲溶液 的pH值为2~11.0。10. 权利要求6所述β-受体激动剂替代模板分子印迹聚合物微球在检测尿液中β-受体 激动剂中的应用； 所述受体激动剂为沙美特罗、异克舒令、克伦赛罗、拉贝特罗、莱克多巴胺、利托君、 溴布特罗、溴氯布罗、喷布特罗、马喷特罗和异克伦潘特中至少一种。
【文档编号】C08F212/36GK106084115SQ201610409394
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】索德成, 王培龙, 苏晓鸥, 李阳, 王瑞国, 张春艳
【申请人】中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所