一种灵芝酸a分子印迹聚合物的制备方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种灵芝酸A分子印迹聚合物的制备方法及其应用，它以灵芝酸A为模板分子，以氯仿为致孔剂，以丙烯酰胺为功能单体，以二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，以偶氮二异丁腈为引发剂，制备灵芝酸A分子印迹聚合物。本发明所述方法所获得的灵芝酸A分子印迹聚合物选择性强，当用于定向分离灵芝中灵芝酸A时，只有灵芝酸A及与其结构高度相似的灵芝酸C2可以进入印迹聚合物的孔穴中，对灵芝酸A和灵芝酸C2选择吸附性强，其他化合物吸附极少，分离效果显著，且制备方法工艺步骤简单，有机溶剂消耗少，成本低，更环保，易于实施，具有选择性强、吸附量大、纯度高等优点。
【专利说明】
一种灵芝酸A分子印迹聚合物的制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种分子印迹聚合物的制备方法和应用，具体涉及一种灵芝酸A分子 印迹聚合物的制备方法及其应用，属于新材料领域。
【背景技术】
[0002] 分子印迹技术(molecular imprinting technique，MIT)是一种制备对特定目标 分子具有高度特异性和选择性分子识别材料的新兴仿生技术。其基本原理是以目标化合物 为模板(template)，在适当介质中，模板分子与功能单体(functional monomer)混合，通过 共价或分子间作用力使功能单体在模板分子周围作一定取向并排列形成分子聚集体，再进 行交联固定，形成聚合物的模型；当模板分子被脱除以后，形成具有与模板分子空间结构互 补的特异性识别位点的分子印迹聚合物(molecular imprinted polymers，MIPs)，进而能 对模板分子进行特异性选择结合。分子印迹聚合物是在结合位点及化学空间结构与某种特 定化合物(模板分子)相匹配的高分子聚合物。制备这种聚合物的方法即为分子印迹技术。 分子印迹技术是人工模拟抗原-抗体、生物素-抗生物素及酶与底物等之间的特异性作用发 展起来的一种分析、分离技术，主要应用于手性物质分离、仿生传感器固相萃取等领域。 [0003] 灵芝来源于担子菌纲多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)和紫芝 Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子实体，是一种药食兼用真菌。灵芝中含有多 糖、三萜、核苷、生物碱、氨基酸多肽、微量元素等成分，其中三萜类化合物是灵芝具有广泛生 理活性的重要物质基础。现代药理研究表明，灵芝三萜类化合物具有保肝、抗肿瘤、抗HIV-1及 HIV-1蛋白酶活性、抗组织胺释放、抑制血管紧张素、抗氧化等作用。1982年，日本学者Kubota 首次从灵芝子实体中分离得到灵芝酸A和灵芝酸B，此后，各国学者陆续从灵芝中分离得到130 余种三萜类化合物，多数属于高度氧化的羊毛留烷衍生物。但是，灵芝中三萜类化合物结构相 似，种类繁多，分离困难，传统的提取分离方法大致有以下三种:1、用甲醇或乙醇提取，提取物 直接分离;2、用甲醇或氯仿提取，提取物经酸碱萃取分出总酸再进一步分离;3、用制备衍生 物的方法进行分离。但是无论采取上述何种传统提取分离方法，均存在提取分离步骤繁琐、 成本昂贵，有机溶剂消耗大，难以简单快速地获得纯度较高的灵芝三萜类化合物的缺陷。
[0004] 因此，亟需提供一种新的技术方案解决上述问题，即一种灵芝酸A分子印迹聚合物 的制备方法及其应用。
【发明内容】
[0005] 1、要解决的问题
[0006] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种灵芝酸A分子印迹聚合物的制 备方法及其应用，本发明所述方法所获得的灵芝酸A分子印迹聚合物选择性强，当用于定向 分离灵芝中灵芝酸A时，只有灵芝酸A及与其结构高度相似的灵芝酸C2可以进入印迹聚合物 的孔穴中，对灵芝酸A和灵芝酸C2选择吸附性强，其他化合物吸附极少，分离效果显著，且制 备方法工艺步骤简单，有机溶剂消耗少，成本低，更环保，易于实施，具有选择性强、吸附量 大、纯度高等优点。
[0007] 2、技术方案
[0008] 为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0009] 所述的一种灵芝酸A分子印迹聚合物的制备方法，其依次按下列步骤进行制备灵 芝酸A分子的印迹聚合物：
[0010] (1)以灵芝酸A为模板分子，以丙烯酰胺为功能单体，并将所述模板分子与功能单 体混合，溶解在致孔溶剂中，形成模板分子-功能单体复合物；
[0011] (2)向步骤(1)所得的模板分子-功能单体复合物中加入引发剂、交联剂，然后充入 氮气脱氧15min，密封，得反应混合液，涡旋振荡混合均匀；
[0012] (3)将步骤(2)中混合均匀的产物于45 °C恒温水浴中加热24h，得棒状聚合物；
[0013] (4)将所述棒状聚合物粉碎过筛，保留100~200目聚合物颗粒，用甲醇与乙酸按一 定比例混合的溶液置索氏提取器中，连续回流洗涤24h，除去模板分子及未反应化合物； [0014] (5)再用甲醇溶液连续回流洗涤10h，同法三次，充分洗去乙酸，聚合物晾干后于60 °(：条件下真空干燥24h至恒重，得分子印迹聚合物。
[0015] 优选地，步骤(1)中所述模板分子灵芝酸A与功能单体丙烯酰胺的摩尔比为1:6;所 述致孔剂为氯仿。
[0016] 优选地，步骤(2)中所述引发剂为2,2_偶氮二异丁腈，所述交联剂为二甲基丙烯酸 乙二醇酯。
[0017] 优选地，所述功能单体丙烯酰胺与交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯的摩尔比为1:5， 所述交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯与致孔剂的体积比为1.4~1.5:6，所述述模板分子灵芝 酸A与引发剂偶氮二异丁腈的质量比为25:2。
[0018] 优选地，步骤(4)中所述混合洗脱溶液中甲醇与乙酸的体积比为9:1。
[0019] 优选地，将所述灵芝酸A分子印迹聚合物作为柱层析填充料装柱，可应用于灵芝提 取液中灵芝酸A和灵芝酸C2的定向分离和提取。
[0020] 优选地，将用于灵芝提取液中灵芝酸A和灵芝酸C2的定向分离和提取后的灵芝酸A 分子印迹聚合物用体积比为9:1的甲醇与乙酸的混合洗脱液洗脱，即可再生用于下一次灵 芝提取液中灵芝酸A和灵芝酸C2的定向分离和提取。
[0021] 3、有益效果
[0022] 相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0023] (1)本发明首次将分子印迹技术用于灵芝提取物中三萜类化合物的提取与分离， 与传统方法相比，制备方法工艺步骤简单，有机溶剂消耗少，成本低，更环保，易于实施，具 有选择性强、吸附量大、纯度高等优点；
[0024] (2)本发明所获得的灵芝酸A分子印迹聚合物选择性强，当用于定向分离灵芝中灵 芝酸A时，只有灵芝酸A及与其结构高度相似的灵芝酸C2可以进入印迹聚合物的孔穴中，对 灵芝酸A和灵芝酸C2选择吸附性强，其他化合物吸附极少，分离效果显著，因此，制得的灵芝 酸A和灵芝酸C2的纯度高达98%以上，为从复杂样品中定向分离灵芝三萜提供了可能；
[0025] (3)本发明获得的灵芝酸A分子印迹聚合物可经甲醇-乙酸混合洗脱液洗脱再生， 再生方法简便可行，具有良好的再生和循环使用功能。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明所述灵芝酸A分子印迹聚合物的合成示意图；
[0027] 图2为本发明所述灵芝酸A分子印迹聚合物的扫描电镜图谱；
[0028]图3为本发明所述灵芝酸A分子印迹聚合物的IR图谱；
[0029]图4为本发明空白聚合物和灵芝酸A分子印迹聚合物的吸附等温线图；
[0030]图5为本发明所述灵芝酸A分子印迹聚合物吸附的Scatchard分析图；
[0031]图6-1为本发明灵芝总三萜HPLC色谱图；
[0032]图6-2为本发明灵芝总三萜经MIP吸附后三氯甲烷洗脱液HPLC色谱图；
[0033]图6-3为本发明灵芝总三萜经MIP纯化后HPLC色谱图。
【具体实施方式】
[0034]下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0035] 实施例
[0036]如图1所示，一种灵芝酸A分子印迹聚合物的制备方法，即一种能定向分离富集灵 芝酸A的分子印迹聚合物的制备方法。
[0037]以灵芝酸A为模板分子，以氯仿为致孔剂，以丙烯酰胺为功能单体，以二甲基丙烯 酸乙二醇酯为交联剂，以偶氮二异丁腈为引发剂，制备灵芝酸A分子印迹聚合物，步骤如下： [0038] 将250mg灵芝酸A溶解在12mL氯仿中，再加入0.21g丙烯酰胺，充分振荡30min，混匀 后加入2.82mL二甲基丙烯酸乙二醇酯，振荡15min，使充分混合均匀，加入20mg偶氮二异丁 腈，混匀，立即充入氮气脱氧15min，密封，得反应混合液。
[0039]将上述反应混合液45 °C恒温水浴中加热24h，得固体聚合物；
[0040]将上述固体聚合物粉碎并过筛，保留100~200目聚合物颗粒，然后将聚合物颗粒 用甲醇：乙酸等于9:1的混合溶液置150mL索氏提取器中连续回流24h，除去模板分子及未反 应化合物。再以甲醇连续回流l〇h，同法三次，充分洗去乙酸。聚合物晾干后60°C真空干燥至 恒重，得灵芝酸A分子印迹聚合物MIP。
[0041] -种灵芝酸A分子印迹聚合物的应用，将所述灵芝酸A分子印迹聚合物作为柱层析 填充料装柱，可应用于灵芝提取液中灵芝酸A和灵芝酸C2的定向分离和提取。具体地，将用 于灵芝提取液中灵芝酸A和灵芝酸C2的定向分离和提取后的灵芝酸A分子印迹聚合物用体 积比为9:1的甲醇与乙酸的混合洗脱液洗脱，即可再生用于下一次灵芝提取液中灵芝酸A和 灵芝酸C2的定向分离和提取。
[0042]测试实施例
[0043]取上述聚合物进行如下测试
[0044] 1.扫描电镜表征
[0045] 图2是本发明合成的灵芝酸A分子印迹聚合物电镜扫描图。由图2可见，聚合物表面 留有孔穴，这些孔穴有利于分子印迹聚合物的吸附作用。
[0046] 2.红外光谱测试
[0047]图3是分子印迹聚合物的红外光谱图，由图可见，3619CHT1处是-N-H的伸缩振动吸 收峰，2987CHT1是-C-H的伸缩振动吸收峰，1732CHT1为C = 0的伸缩振动。
[0048] 3.静态吸附实验
[0049]精密称取30mg印迹聚合物和非印迹聚合物各9份，振荡分散于3mL系列浓度为0.02 ~1. Omg ? mL-1的灵芝酸A氯仿溶液中，密闭，35°C振荡4h，吸附平衡后用0.22_微孔滤膜过 滤，HPLC测定吸附前后灵芝酸A浓度，按公式（1)计算单位质量聚合物的吸附量Q(wii 〇l ? g 4)，结果见表1、图4。
公式（1)
[0051] 注:C总为吸附前的灵芝酸A的浓度，mol ? ml/Sc平衡为吸附后灵芝酸A的平衡浓 度，mol ?mL-Sm为聚合物的质量，mg。
[0052] 表1印迹聚合物MIP和空白聚合物NIP在25°C时的静态吸附量
[0055] 从图4、表1分别给出的分子印迹聚合物MIP和空白聚合物NIP对灵芝酸A的吸附等 温线可知，MIP对模板的吸附量随着底物初始浓度增加而增大，当底物浓度相同时，MIP的吸 附量高于NIP对同种模板分子的吸附量。表明MIP中含有大量与模板分子大小、官能团相匹 配的键合位点。
[0056] 采用Scatchard模型评价分子印迹聚合物对灵芝酸A的吸附参数。以Q/Op衡对Q作 图，并根据公式(2)计算结合位点的平衡解离常数K D(mol ? ml/1)，和最大表观吸附量Qmax(y mol ? f1)。结果见图5。
公式（2)
[0058]图5灵芝酸A分子印迹聚合物吸附的Scatchard分析图表明，印迹聚合物与模板分 子有两类结合点，高亲和力结合位点的解离平衡常数为〇.〇229mmol ? I/1，最大表观吸附量 13.12wiiol ? g_S低亲和力结合位点的解离平衡常数为0.3081mmol ? I/1，最大表观吸附量 52.75wiiol ? g_i。当模板分子浓度较低时，具有高选择性、高亲和力的结合位点吸附印迹聚 合物，不易解离；当模板分子浓度较高时，高选择性的结合位点趋于饱和，吸附能力下降，易 解尚。
[0059] 4.应用分子印迹聚合物定向富集灵芝药材中的灵芝三萜类化合物。
[0060]取500mg灵芝酸A分子印迹聚合物填充于固相萃取小柱中，用30ml氯仿平衡;再将 2ml 0.2g ? ml/1灵芝药材的氯仿提取液加入到平衡好的固相萃取小柱中，用35mL氯仿洗脱， 使灵芝酸A被吸附在聚合物上并洗去非特异性吸附物质，继续用30mL甲醇继续洗脱。收集各 洗脱液并用旋转蒸发仪除去溶剂，最后用2mL甲醇定容。HPLC-UV法检测各洗脱液，结果见 图6-1，6-2,6-3。结果显示灵芝酸A分子印迹聚合物可除去灵芝药材三氯甲烷提取液中绝大 多数其它三萜类化合物，可定向富集灵芝酸A和保留时间为15min极性比灵芝酸A大的另一 三萜类化合物。经与对照品保留时间及紫外图谱比对，确定此化合物为灵芝酸C2。结论:得 到被分子印迹聚合物特异性吸附的灵芝酸A和灵芝酸C2。
[0061] 5.将上述分子印迹聚合物MIP用甲醇：乙酸(9:1)混合液洗脱，即可再生用于下一 次分呙。
[0062] 基于上述，本发明首次将分子印迹技术用于灵芝提取物中三萜类化合物的提取与 分离，与传统方法相比，制备方法工艺步骤简单，有机溶剂消耗少，成本低，更环保，易于实 施，具有选择性强、吸附量大、纯度高等优点；所获得的灵芝酸A分子印迹聚合物选择性强， 当用于定向分离灵芝中灵芝酸A时，只有灵芝酸A及与其结构高度相似的灵芝酸C2可以进入 印迹聚合物的孔穴中，对灵芝酸A和灵芝酸C2选择吸附性强，其他化合物吸附极少，分离效 果显著，因此，制得的灵芝酸A和灵芝酸C2的纯度高达98%以上，为从复杂样品中定向分离 灵芝三萜提供了可能；获得的灵芝酸A分子印迹聚合物可经甲醇-乙酸混合洗脱液洗脱再 生，再生方法简便可行，具有良好的再生和循环使用功能。
[0063] 以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所 示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技 术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案 相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种灵芝酸A分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于依次按下列步骤进行制备灵 芝酸A分子的印迹聚合物： (1)以灵芝酸A为模板分子，以丙烯酰胺为功能单体，并将所述模板分子与功能单体混 合，溶解在致孔溶剂中，形成模板分子-功能单体复合物； (2) 向步骤（1)所得的模板分子-功能单体复合物中加入引发剂、交联剂，然后充入氮气 脱氧15 min，密封，得反应混合液，涡旋振荡混合均匀； (3) 将步骤(2)中混合均匀的产物于45°C恒温水浴中加热24 h，得棒状聚合物； (4) 将所述棒状聚合物粉碎过筛，保留100~200目聚合物颗粒，用甲醇与乙酸按一定比 例混合的溶液置索氏提取器中，连续回流洗涤24h，除去模板分子及未反应化合物； (5) 再用甲醇溶液连续回流洗涤10h，同法三次，充分洗去乙酸，聚合物晾干后于60°C条 件下真空干燥24 h至恒重，得分子印迹聚合物。2. 根据权利要求1所述的一种灵芝酸A分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步 骤(1)中所述模板分子灵芝酸A与功能单体丙烯酰胺的摩尔比为1:6;所述致孔剂为氯仿。3. 根据权利要求1所述的一种灵芝酸A分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步 骤(2)中所述引发剂为2,2_偶氮二异丁腈，所述交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯。4. 根据权利要求3所述的一种灵芝酸A分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述 功能单体丙烯酰胺与交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯的摩尔比为1:5,所述交联剂二甲基丙 烯酸乙二醇酯与致孔剂的体积比为1.4~1.5:6,所述模板分子灵芝酸A与引发剂偶氮二异 丁腈的质量比为25: 2。5. 根据权利要求1所述的一种灵芝酸A分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步 骤(4)中所述混合洗脱溶液中甲醇与乙酸的体积比为9:1。6. 按照权利要求1所述的一种灵芝酸A分子印迹聚合物的应用，其特征在于，将所述 灵芝酸A分子印迹聚合物作为柱层析填充料装柱，可应用于灵芝提取液中灵芝酸A和灵芝酸 C2的定向分离和提取。7. 根据权利要求6所述的一种灵芝酸A分子印迹聚合物的应用，其特征在于，将用于 灵芝提取液中灵芝酸A和灵芝酸C2的定向分离和提取后的灵芝酸A分子印迹聚合物用体积 比为9:1的甲醇与乙酸的混合洗脱液洗脱，即可再生用于下一次灵芝提取液中灵芝酸A和灵 芝酸C2的定向分离和提取。
【文档编号】C08J9/26GK105968257SQ201610237569
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年4月15日
【发明人】乐巍, 邱蓉丽, 吴玉兰, 李璘, 邵霞
【申请人】南京中医药大学