一种二醇二氮烯鎓结构的一氧化氮供体及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种二醇二氮烯鎓结构的一氧化氮供体及其制备方法和应用。本发明采取分步法制备工艺，采用自由基沉淀聚合的方式，利用丙烯单体聚合得到粒径均一的聚合物微球；利用得到的聚合物微球，以bocAmEMA为功能单体，选择合适的交联剂和引发剂，加热蒸馏引发聚合反应，获得核壳结构的双层高分子复合纳米微球；而后，将核心纳米微球选择性的去除掉，得到空心结构的单层高分子聚合物纳米微球；最后，将得到的纳米微球，与高纯度的一氧化氮气体在常温、常压条件下反应，获得高负载量密度的二醇二氮烯鎓结构的一氧化氮负载微球，其一氧化氮负载量可达6.5mmol/g，利于作为高效药物来使用。
【专利说明】
一种二醇二氮烯鐺结构的一氧化氮供体及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于功能高分子材料领域，涉及一种二醇二氮烯鑰结构的一氧化氮供体及其制备方法和应用，具体涉及一类负载量高、形态可控的具有二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球及其制备方法。【背景技术】
[0002]—氧化氮作为反应性活性因子广泛存在于生物体内。生物体中血管壁的正常伸缩舒张、血小板聚集和粘附作用、系统的免疫应答、伤口愈合过程、癌症中的生理学作用、以及细菌免疫等方面都需要生理浓度的一氧化氮参与，因此当体内一氧化氮生物合成途径受到破坏或者抑制的时候，生物体就会出现一系列的病变，包括心脑血管功能异常、组织或者器官正常菌群失调甚至癌变，因而外源性N0对于这些疾病的预防和治疗有重要意义。
[0003]然而，一氧化氮气体的高反应活性，使得一氧化氮本身不可能作为直接的药剂或者治疗措施来使用。目前，市面上关于一氧化氮供体的药物很少，一般为小分子一氧化氮类药物，比如硝酸或者亚硝酸的有机酯类。但这类小分子的一氧化氮供体作用机制长期不明确，且不具备控制释放的机制存在，使用中会存在一些问题。
[0004]为了得到可控的一氧化氮供体体系，涌现出了众多一氧化氮供体体系或者模型构建的报道:包括有机(亚)硝酸盐类化合物、金属-一氧化氮复合物、亚硝基胺类化合物、二醇二氮烯鑰结构物以及亚硝基硫醇结构物等。由于能够在生理条件或者媒介中，能够自动得释放出一氧化氮，二醇二氮烯鑰结构物的一氧化氮负载体系表现出广泛的应用前景。
[0005]稳定的二醇二氮烯鑰结构物可以由一氧化氮和二级胺类物质在强碱条件下合成。 有效的二醇二氮烯鑰结构物的形成需要一类二级碱基团位点(可以为一类未反应的胺类物质和一类加入的有机金属碱)与一氧化氮发生亲核反应过程而形成，金属有机碱可以提供的正离子，对于形成的二醇二氮烯鑰结构物中阴离子，起到稳定作用。二醇二氮烯鑰类型的一氧化氮供体因为能被激发胺基位点形成的二醇二氮烯鑰结构物从而释放出一氧化氮(二醇二氮烯鑰结构物在pH为7.4,37°C生理条件下，每一个二醇二氮烯鑰位点释放出两分子的一氧化氮)，因而受到关注，适合在生物体需要的时候，作为一氧化氮供应源来满足机体正常机理活动。
[0006]然而将二醇二氮烯鑰结构物负载体系作为一氧化氮供应源来使用，其负载量有限，如何进一步提高N0负载量、获得尽量高负载密度的负载体系，仍是本领域内面临的技术难题。
【发明内容】
[0007]针对二醇二氮烯鑰结构的一氧化氮负载量低的问题，发明人前期研究发现，二醇二氮烯鑰结构物负载体系结合交联空心结构的聚合物纳米微球，设计负载有二醇二氮烯鑰结构物的空心纳米微球可以实现一氧化氮高负载量化(Tuanwei Liu et al，“Silica/ polymer microspheres and hollow polymer microspheres as scaffolds for nitricoxide release in PBS buffer and bovine serum”，Polym.Chem.，2015，6，1512)，然而， 其一氧化氮的负载量仍有待于进一步提高。发明人在此基础上，进一步研发从而提出了本发明。
[0008]本发明的首要目的在于提供一种高负载密度的二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球的制备方法。
[0009]本发明的目的之二在于提供上述二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球。
[0010]本发明的目的之三在于提供上述二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球的应用。
[0011]为实现上述目的，具体的，本发明涉及以下技术方案:
[0012]首先，本发明公开了一种高负载密度的二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球的制备方法，所述方法包括:
[0013] (1)采用聚丙烯酸纳米聚合物微球作为反应核心，加入功能性单体(2-乙基(叔丁氧羰基)氨基)乙基甲基丙烯酸酯，bocAmEMA)、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)以及引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)进行反应，获得核壳结构的双层高分子复合纳米微球；
[0014] (2)双层高分子复合纳米微球通过碱溶解脱除聚丙烯酸纳米聚合物微球，得空心聚合物纳米微球;将得到的空心聚合物纳米微球，与一氧化氮反应进行一氧化氮的负载，获得高负载密度的二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球。
[0015]发明人基于研究发现，不同的聚合物微球核心以及不同的聚合引发剂、单体等的选择，对于核壳结构的双层高分子复合纳米微球以及空心聚合物纳米微球的形成，存在明显的差异化影响，包括:
[0016] (1)本发明采用聚丙烯酸纳米聚合物微球作为反应核心，并为最终获得的空心聚合物纳米微球提供提条件，与Polymer Chemsitry论文中采用的MPS修饰的二氧化娃纳米微球相比，具有:原料低价，制作过程方便(单步聚合，无需后续修饰)，且后续的脱附过程简单 (二氧化硅纳微球需要用氢氟酸选择性的脱附掉;而采用聚丙烯酸纳米聚合物微球作为反应核心，在后面的负载一氧化氮过程中，环境里强碱性的条件(甲醇钠)使得其可以溶解而自然脱附掉)的特点；[〇〇17] (2)由于使用了聚丙烯酸纳米聚合物微球作为反应核心，结合不同的聚合引发剂、 交联剂以及聚合物单体的选择，使得二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球获得了更高的一氧化氮负载量(6.5mmol/g)，利于将来作为高效药物来使用。
[0018]在本发明技术方案中，步骤(1)中，聚丙烯酸纳米聚合物微球是指丙烯酸作为单体进行聚合得到的聚丙烯酸纳米聚合物微球;其可以采用现有的聚丙烯酸纳米聚合物微球或通过本领域已知的制备方法进行制备；[〇〇19]优选的技术方案中，步骤(1)中，聚丙烯酸纳米聚合物微球通过丙烯(AA)做单体、 偶氮二异丁腈(AIBN)做引发剂，发生自由基聚合反应进行制备。优选的，丙烯酸单体、偶氮二异丁腈的比例为(l-5)ml: (20-60)mg。
[0020]具体的，聚丙烯酸纳米聚合物微球的制备过程可以为:取单口瓶，加入乙腈、丙烯酸单体(AA)，以及偶氮二异丁腈(AIBN)作为引发剂，将体系慢慢升温至沸腾状态，保持状态，并蒸馏出大部分乙腈，结束反应，得到粒径均一的聚丙酸聚合物纳米微球;超声、离心、 洗涤、干燥，备用;丙稀酸单体、偶氮二异丁腈的比例为(l-5)ml: (20-60)mg。
[0021]优选的技术方案中，步骤(1)中制备过程为:将聚丙酸聚合物纳米微球超声分散在乙腈中，之后加入功能性单体2-乙基(叔丁氧羰基)氨基)乙基甲基丙烯酸酯(bocAmEMA)、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(E⑶MA)以及引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，将体系慢慢升温至沸腾状态，保持状态，并蒸馏出约大部分乙腈，结束反应，将得到的双层聚合物纳米微球离心，洗涤，干燥，备用。[〇〇22]聚丙酸聚合物纳米微球、2-乙基(叔丁氧羰基)氨基)乙基甲基丙烯酸酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮二异丁腈的比例为:(80-120)mg: (7.5-9.6)mmol: (2-3)ml: (120-160)mg〇
[0023]在本发明技术方案中，步骤(1)的制备过程还包括:取双层高分子复合纳米微球超声分散在氯仿中，滴入三氟乙酸，室温下搅拌，之后加入过量的碳酸氢钠水溶液和去离子水，搅拌中和，离心，洗涤，干燥备用。
[0024]在本发明技术方案中，步骤(2)的制备过程为:将步骤(1)得到的复合纳米微球与干燥四氢呋喃以及过量的甲醇钠混合，排除空气，密封，通入并保持足量的高纯度的一氧化氮，避光反应，进行一氧化氮的负载，获得高负载密度的二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球。[〇〇25] 优选的，避光反应90_120h。
[0026]优选的技术方案中，步骤(2)的制备过程为:取空心聚合物纳米微球超声分散在 100%甲醇钠过量的干燥四氢呋喃中，将反应瓶置于反应釜中，通入氮气，排除空气，之后密封，常压下通入高纯度一氧化氮(99.99%及以上)，保持一氧化氮的供应，避光室温反应，反应结束后，用干燥的四氢呋喃快速洗涤、离心，真空干燥，即可获得高负载密度的二醇二氮稀鐵结构的空心聚合物纳米微球。
[0027]本发明所述方法中负载一氧化氮的过程在常温常压下即可进行，使得对反应条件和设备要求更低，利于将来大规模化生产过程。
[0028]其次，本发明公开了上述制备方法获得的高负载密度的二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球。
[0029]本发明所述空心聚合物纳米微球具有中空结构，整个纳米微球的直径在150? 200nm之间，分散度大约为1.05，聚合物壳层厚度约40-60nm，微球中二醇二氮稀鐵结构的负载密度达到约6.5mmol/g，二级胺功能位点转化效率可达到85%以上。
[0030]进一步的，本发明公开了上述制备方法获得的高负载密度的二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球可作为药物的用途。
[0031]具体的，本发明公开了一种药物组合物，其包含上述制备方法获得的高负载密度的二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球。[〇〇32]本发明取得了以下有益效果:
[0033](1)本发明的二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球作为一氧化氮供应源来满足机体需要，所具有的有益效果包括:作为一氧化氮供应源，属于新型作用机制类药物;超高负载量的一氧化氮负载体系，满足作为药物来使用的基本要求;结合了高分子聚合物纳米微球的机构特点和优势，方便后续加工和改造，为开发使用多种条件下的药物提供了方便(比如，长效缓释类药物)；原料广泛，可选用多种天然品种、有利于开发生物体相容性好和低排斥反应的药物；
[0034](2)本发明由于使用了聚丙烯酸纳米聚合物微球作为反应核心、不同的聚合引发剂、以及其他不同的原料(交联剂及单体)，使得其获得了更高的一氧化氮负载量(6.5mmol/ g)，利于将来作为高效药物来使用；
[0035](3)本发明采用聚丙烯酸纳米聚合物微球作为反应核心，为最终获得的空心聚合物纳米微球提供提条件，聚丙烯酸纳米聚合物微球制备原料低价，制作过程方便(单步聚合，无需后续修饰)，且后续的脱附过程简单(在后面的负载一氧化氮过程中，环境里强碱性的条件使得其可以溶解而自然脱附掉)的特点；
[0036](4)本发明高负载密度的二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球的制备方法过程中，负载一氧化氮的过程在常温常压下即可进行，使得对反应条件和设备要求更低，利于将来大规模化生产过程。【附图说明】
[0037]图1本发明实施例1得到的空心聚合物纳米微球的透射电镜图片【具体实施方式】
[0038]bocAmEMA的合成参考Tuanwei Liu et al，“Silica/polymer microspheres and hollow polymer microspheres as scaffolds for nitric oxide release in PBS buffer and bovine serum”，Polym.Chem.，2015,6，1512,该文献的内容在此一并引入本申请。[〇〇39]本发明所使用的其他试剂均采用市售试剂。
[0040]以下是本专利发明的具体实施案例，所述的实例是用于举例描述本发明，而不是限制本发明。[0041 ] 实施例1[0〇42] 取250ml的单口瓶，加入200ml的乙腈、2ml的丙稀酸单体(AA)，以及40mg的偶氮二异丁腈(AIBN)作为引发剂，20分钟之内，将体系慢慢升温至沸腾状态。保持状态，并蒸馏出约15 0 m 1的乙腈，结束反应，得到粒径均一的聚丙酸聚合物纳米微球。超声、离心、洗涤、干燥，备用。[〇〇43]取100mg聚丙酸聚合物纳米微球超声分散在200ml的乙腈中，之后加入功能性单体 (2-乙基(叔丁氧羰基)氨基)乙基甲基丙烯酸酯，b〇cAmEMA)8.46mm〇l、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)2.4ml以及引发剂偶氮二异丁腈(AIBN) 150mg(320分钟之内，将体系慢慢升温至沸腾状态。保持状态，并蒸馏出约150ml的乙腈，结束反应。将得到的双层聚合物纳米微球离心，洗涤，干燥，备用。[〇〇44]取260mg的双层聚合物纳米微球超声分散在30ml的氯仿中，滴入lml的三氟乙酸， 室温下搅拌10小时。之后加入过量的碳酸氢钠水溶液和去离子水，搅拌中和，离心，洗涤，干燥备用。[〇〇45]取200mg的上述纳米微球超声分散在100%甲醇钠过量的干燥四氢呋喃中，将反应瓶置于反应釜中，通入氮气，排除空气，之后密封，常压下通入高纯度一氧化氮(99.99%)， 保持一氧化氮的供应，避光室温反应约96小时。反应结束后，用干燥的四氢呋喃快速洗涤、 离心。真空干燥，即可获得具有高负载密度的二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球。零下20摄氏度的冰箱中密封保存。
[0046]中空纳米微球的检测同Tuanwei Liu et al，Polym.Chem.,2015,6,1512。所制得的整个纳米微球的直径在150?200nm之间，分散度大约为1.05，聚合物壳层厚度约50nm，微球中二醇二氮稀鐵结构的负载密度约为6.5mmol/g，二级胺功能位点转化效率可达到85 % 以上。[〇〇47] 实施例2[〇〇48] 取250ml的单口瓶，加入250ml的乙腈、5ml的丙烯酸单体(AA)，以及60mg的偶氮二异丁腈(AIBN)作为引发剂，30分钟之内，将体系慢慢升温至沸腾状态。保持状态，并蒸馏出约200ml的乙腈，结束反应，得到粒径均一的聚丙酸聚合物纳米微球。超声、离心、洗涤、干燥，备用。[〇〇49]取120mg聚丙酸聚合物纳米微球超声分散在250ml的乙腈中，之后加入功能性单体 (2-乙基(叔丁氧羰基)氨基)乙基甲基丙烯酸酯，b〇cAmEMA)9.6mm〇l、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)3ml以及引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)160mg<320分钟之内，将体系慢慢升温至沸腾状态。保持状态，并蒸馏出约150ml的乙腈，结束反应。将得到的双层聚合物纳米微球离心，洗涤，干燥，备用。
[0050] 取300mg的双层聚合物纳米微球超声分散在50ml的氯仿中，滴入1.5ml的三氟乙酸，室温下搅拌10小时。之后加入过量的碳酸氢钠水溶液和去离子水，搅拌中和，离心，洗涤，干燥备用。[0051 ]取200mg的上述纳米微球超声分散在100%甲醇钠过量的干燥四氢呋喃中，将反应瓶置于反应釜中，通入氮气，排除空气，之后密封，常压下通入高纯度一氧化氮(99.99%)， 保持一氧化氮的供应，避光室温反应约100小时。反应结束后，用干燥的四氢呋喃快速洗涤、 离心。真空干燥，即可获得具有高负载密度的二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球。零下20摄氏度的冰箱中密封保存。[〇〇52]所制得的整个纳米微球的直径在150?200nm之间，分散度大约为1.05,聚合物壳层厚度约55nm，微球中二醇二氮稀鐵结构的负载密度约为6.3mmol/g，二级胺功能位点转化效率可达到85%以上。
[0053] 实施例3[OOM] 取250ml的单口瓶，加入200ml的乙腈、3ml的丙稀酸单体(AA)，以及50mg的偶氮二异丁腈(AIBN)作为引发剂，20分钟之内，将体系慢慢升温至沸腾状态。保持状态，并蒸馏出约15 0 m 1的乙腈，结束反应，得到粒径均一的聚丙酸聚合物纳米微球。超声、离心、洗涤、干燥，备用。[〇〇55]取100mg聚丙酸聚合物纳米微球超声分散在250ml的乙腈中，之后加入功能性单体 (2-乙基(叔丁氧羰基)氨基)乙基甲基丙烯酸酯，b〇cAmEMA)8.5mm〇l、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)3ml以及引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)150mg<320分钟之内，将体系慢慢升温至沸腾状态。保持状态，并蒸馏出约150ml的乙腈，结束反应。将得到的双层聚合物纳米微球离心，洗涤，干燥，备用。[〇〇56] 取300mg的双层聚合物纳米微球超声分散在50ml的氯仿中，滴入1.5ml的三氟乙酸，室温下搅拌10小时。之后加入过量的碳酸氢钠水溶液和去离子水，搅拌中和，离心，洗涤，干燥备用。
[0057]取200mg的上述纳米微球超声分散在100%甲醇钠过量的干燥四氢呋喃中，将反应瓶置于反应釜中，通入氮气，排除空气，之后密封，常压下通入高纯度一氧化氮(99.99%)， 保持一氧化氮的供应，避光室温反应约100小时。反应结束后，用干燥的四氢呋喃快速洗涤、 离心。真空干燥，即可获得具有高负载密度的二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球。零下20摄氏度的冰箱中密封保存。
【主权项】
1.一种高负载密度的二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球的制备方法，所述方法 包括:(1)采用聚丙烯酸纳米聚合物微球作为反应核心，加入功能性单体2-乙基(叔丁氧羰 基)氨基)乙基甲基丙烯酸酯(bocAmEMA)、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(E⑶MA)以及引发 剂偶氮二异丁腈(AIBN)进行反应，获得核壳结构的双层高分子复合纳米微球；(2)双层高分子复合纳米微球通过碱溶解脱除聚丙烯酸纳米聚合物微球，得空心聚合 物纳米微球;将得到的空心聚合物纳米微球，与一氧化氮反应进行一氧化氮的负载，获得高 负载密度的二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，聚丙烯酸纳米聚合物微球 是指丙烯酸作为单体进行聚合得到的聚丙烯酸纳米聚合物微球。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中聚丙烯酸纳米聚合物微球 通过丙烯(AA)做单体、偶氮二异丁腈(AIBN)做引发剂，发生自由基聚合反应进行制备。4.根据权利要求1或2任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中制备过程为:将 聚丙酸聚合物纳米微球超声分散在乙腈中，之后加入功能性单体2-乙基(叔丁氧羰基)氨 基)乙基甲基丙烯酸酯(bocAmEMA)、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)以及引发剂偶氮 二异丁腈(AIBN)，将体系慢慢升温至沸腾状态，保持状态，并蒸馏出约大部分乙腈，结束反 应，将得到的双层聚合物纳米微球离心，洗涤，干燥，备用。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)的制备过程还包括:取双层高 分子复合纳米微球超声分散在氯仿中，滴入三氟乙酸，室温下搅拌，之后加入过量的碳酸氢 钠水溶液和去离子水，搅拌中和，离心，洗涤，干燥备用。6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)的制备过程为:将步骤(1) 得到的复合纳米微球与干燥四氢呋喃以及过量的甲醇钠混合，排除空气，密封，通入并保持 足量的高纯度的一氧化氮，避光反应，进行一氧化氮的负载，获得高负载密度的二醇二氮烯 鑰结构的空心聚合物纳米微球。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)的制备过程为:取步骤(1)得 到的复合纳米微球超声分散在100%甲醇钠过量的干燥四氢呋喃中，将反应瓶置于反应釜 中，通入氮气，排除空气，之后密封，常压下通入高纯度一氧化氮，保持一氧化氮的供应，避 光室温反应，反应结束后，用干燥的四氢呋喃快速洗涤、离心，真空干燥，即可获得高负载密 度的二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物纳米微球。8.权利要求1 _7任一项制备方法获得的高负载密度的二醇二氮烯鑰结构的空心聚合物 纳米微球。9.权利要求8所述高负载密度的二醇二氮稀鐵结构的空心聚合物纳米微球在制备一氧 化氮供体药物中的用途。10.—种药物组合物，其包含权利要求8所述高负载密度的二醇二氮烯鑰结构的空心聚 合物纳米微球。
【文档编号】C08F222/14GK105968256SQ201610459596
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】刘团伟, 张志德, 胡晶晶
【申请人】山东师范大学