专利名称：一氧化氮供体型白杨素衍生物、制备方法及医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物化学领域，具体涉及一氧化氮供体型白杨素衍生物，它们的制备方法，以及这些化合物医药用途，特别是作为治疗糖尿病、糖尿病心血管并发症和代谢综合征及其相关疾病药物的用途。
背景技术：
黄酮类化合物是一类低分子天然植物成分，广泛存在于蔬菜、水果和药用植物中，毒副作用小，具有广泛的药理作用。通过抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶、类胰岛素样作用、抑制小肠对糖的吸收以及抗病毒感染等途径起到防治糖尿病的作用，并能抵抗血小板凝集、微血管病变和蛋白质非酶糖基化等作用起到防治糖尿病并发症的作用。
白杨素(chrysin)是一种黄酮类化合物，化学名称为5，-二羟基黄酮，具有抗氧化、抗焦虑、抑制芳香酶、抗肿瘤、化疗增敏等药理作用。Villar等(Villar et al.Effectsof chrolic chrysin treatment of spontaneous hypertension rats Letter planta med200268847-50.)研究发现，在自发性高血压大鼠(SHR)，小剂量(20mg/Kg.d)口服给予白杨素，6周后高血压大鼠收缩压下降大约9％，并能改善自发性高血压大鼠心脏肥大和内皮功能。而对血压正常的WKY大鼠血压没有影响。其心血管保护作用被认为是其抗氧化作用所致。Joon-Su Shin等(Joon-Su Shin，Kyoung-Soon Kim，etal.SYNTHESIS AND HYPOGLYCEMIC EFFECT OF CHRYSIN DERIVATIVES Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 9(1999)869-874.)对白杨素做了一些结构改造，发现7位羟基烷基化后，部分衍生物具有降低链脲佐菌素所致1型糖尿病大鼠血糖的作用。以10mg/kg.d剂量口服给予7位羟基丁烷取代产物，连续7天，可使链脲佐菌素所致1型糖尿病大鼠血糖下降达53.7％。而白杨素本身未出现降糖作用。当一次给予500mg/kg的丁烷取代产物，未出现急性毒性反应。
Wallace JL等(Wallace JL，Reuter BK，Cirino G.Nitric oxide-releasingnon-steroidal anti-inflammatory drugsa novel approach for reducinggastrointestinal toxicity.J Gastroenterol Hepatol.1994；9Suppl1S40-4.)研究发现非甾体类抗炎药阿司匹林连接一氧化氮供体后其衍生物较之母体化合物具有更强的抗凝作用，更强的心血管保护作用，肾脏保护作用，促进伤口愈合作用。Yong-Qi Li等(Yong-Qi Li et al Nitric oxide donors and angiotensin-converting enzymeinhibitors act in concert to inhibit human angiotensin-converting enzymeactivity and platelet aggregation in vitro European Journal of Pharmacology2000.15-23.)把一氧化氮供体连接到血管紧张素转化酶抑制剂替米沙坦上做成一新化合物，发现其新化合物抗高血压作用较替米沙坦增强，且能减缓高糖高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠体重的增加，改善其葡萄糖耐量。被认为可能成为有效的抗高血压和抗糖尿病心血管并发症的药物。Kazuo等(Kazuo et al Pharmacological and biochemicalstudies on the possible role of nitric oxide in stress adaptation in ratsEuropean Journal of Pharmacology 493(2004)111-115.)研究发现，在饮水中补充亚硝酸钠能改善糖尿病微血管并发症糖尿病性肾病的早期肾小球损伤，降低微白蛋白尿，改善肾功能。Wang J等(Wang J，Shang F，Jiang R，Liu L，Wang S，Hou J，HuanM，Mei Q.Nitric oxide-donating genistein prodrugdesign，synthesis，andbioactivity on MC3T3-E1cells.J Pharmacol Sci.2007May；104(1)82-9.)把一氧化氮供体连接到黄酮类化合物金雀异黄酮(4’，5，7-三羟基异黄酮，被称为植物雌激素)上做成一新的金雀异黄酮衍生物用于对抗绝经后骨质疏松症，该衍生物在溶液中可持续低剂量释放NO达5小时，该衍生物可促进MC3T3-E1成骨细胞增殖，分化以及钙盐沉积，较之母体化合物对抗绝经后骨质疏松症作用明显增强且不良反应下降，被认为是一种很有前景的抗绝经后骨质疏松症药物。
目前，NO供体药物研究的趋势主要是利用前药原理将NO供体与生效药物结合起来形成一种更有效的结合型新药物。这种药物设计方式的优点在于提高药物的生物利用度、增加药物稳定性、减小毒副作用、促使药物长效化等。同时，它具有NO供体的特征，提供一种依赖于NO的生物活性。这种结合型新药物主要包括亚硝基硫醇/药物的结合物；硝酸盐/药物的结合物；呋咱氮氧化物/药物的结合物，其中不少获得专利并在临床上得到应用。
糖尿病〔Diabetes mellitus，DM〕是一种与遗传因素相关联的全身性慢性分泌代谢疾病，是由于体内胰岛素的绝对或相对不足而引起糖、脂肪、蛋白质的代谢紊乱。其主要特点是高血糖和尿糖，临床常表现为多饮、多尿、多食及疲乏等。糖尿病常以综合病症的形式出现，即患者常伴有其他慢性疾病，如动脉粥样硬化、高血压等。据世界卫生组织(WHO)统计，在全世界，1985年诊断患糖尿病的人数为3000万，1995年上升到1.35个亿。WHO预测在2025年将有3亿人患此疾病。增长的主要原因是随着物质生活的提高，人们的环境因素、饮食习惯和其他生活方式发生改变所致。
按照第16届国际糖尿病联盟会议的建议，糖尿病分为2种类型1型糖尿病，又称胰岛素依赖性糖尿病(insulin dependent diabetes mellitus，IDDM)；2型糖尿病，又称非胰岛素依赖性糖尿病(noninsulin dependent diabetes mellitus，NIDDM)。2型糖尿病约占糖尿病病人总数的90％，发病年龄多在35岁以后，起病缓慢、隐匿，部分病人是在检查其他疾病时才发现的。目前，全世界糖尿病的发病率为2％-3％；北美为5％；中国内地为3.21％；香港地区为6.7％。随着生活水平的提高和人口老龄化，糖尿病的发病率也在逐渐提高，目前，全世界糖尿病患者数目年增长率为4％-5％。据美国糖尿病协会(ADA)报道，1997年美国花费在糖尿病病人上的费用为980亿美元，其中440亿美元直接用于药物和疾病的治疗。
随着患糖尿病时间的延长，体内代谢紊乱如得不到很好的控制，常引发糖尿病血管病变，可导致视网膜病变、高血压、肾脏病变、冠心病、下肢血管病变、脑血管病变、神经病变等慢性并发症，以致最终发生失明、下肢坏疽、尿毒症、脑中风或心肌梗死，甚至危及生命。
血管病变是糖尿病(DM)慢性并发症之一，是影响糖尿病人健康和生命的重要因素。其发病机理被认为与血管内皮细胞损伤、血小板激活、凝血及纤溶异常等有关。而内皮功能的损伤被认为是血管病变发生的始动环节。内皮损伤参与了糖尿病血管病变的发生、发展，内皮损伤的程度可反映糖尿病血管病变的程度。许多学者在其研究中发现糖尿病时机体一氧化氮合酶活性及结构改变，导致一氧化氮(NO)合成减少，而糖尿病时高血糖引起机体内产生过多的氧自由基，导致NO失活增多及血管内皮细胞的损伤，损伤的内皮细胞对NO的反应性减弱，这些因素都会导致血管内皮依赖性舒张功能减退。
糖尿病大血管病变主要指中等或较大的动脉发生粥样硬化导致血管腔狭窄或闭塞而导致心、脑、肾及周围血管缺血性病变，严重者可引起功能衰竭，在糖尿病患者中动脉硬化发生率高，发病年龄相对轻，发展过程快，病情重，病死率高，是2型糖尿病患者致残、致死的主要原因。
缺血性血管病变是糖尿病常见血管病变，据报道，50岁以上的糖尿病患者下肢血管病变的发病率为25％-30％(Muhs BE，Gagne P，Sheehan P.Peripheral arterialdiseaseclinical assessment and indications for revascularization in thepatient with diabetes.Curr Diab Rep.2005Feb；5(1)24-9.Review.)。缺血性下肢血管病变是引起糖尿病足溃疡、坏疽、截肢的重要因素。
糖尿病和高血压并存是临床常见的现象。据统计，发达国家的糖尿病患者群约有30％～50％合并高血压.我国糖尿病患者群高血压的患病率为55.4％。糖尿病合并高血压患者，临床预后明显恶化，心脑血管疾病、糖尿病肾病、糖尿病眼底病变发生率明显增加。5年内冠心病死亡率和总死亡率明显高于未合并高血压的患者，分别高达25.8％和50％，且临床预后与血压水平成正比(Grossman E，Messerli FH，Goldbourt U.high bloodpressure and diabetes mellitus[J].Arch Intern Med，2000，160(6)2447-2452.)。
2型糖尿病往往有甘油三酯(TG)偏高、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)偏低与脂蛋白组成异常，2型糖尿病与高血压、高血脂共同组成了“代谢综合征”的主要成分，也是心血管疾病的主要危险因素。肥胖和NIDDM患者脂肪组织储存TG能力下降，脂解作用增强。其释出的游离脂肪酸(FFA)通过门脉系统进入肝脏，降低胰岛素的清除，增加脂质的合成，导致外周高胰岛素血症，空腹血糖升高和高脂血症。慢性FFA水平升高和胰岛细胞内脂质含量增加，可影响胰岛素合成和葡萄糖刺激下的胰岛素分泌，并使胰岛素β细胞凋亡增加。高甘油三酯(HTG)人群，胰岛素的敏感性显著低于非HTG人群。HTG状态下已经出现胰岛素抵抗和胰岛素分泌异常。
发明内容
本发明公开了一系列一氧化氮供体型白杨素衍生物，具有通式I结构
I 其中，R2为H、-CH3、-CH2CH3或
R1为以下II，III，IV，V结构中任意一个
，其中，n为小于18的偶数；
其中，n为小于18的偶数；
其中A选自
R2为
R1为II结构-(CH2)nONO2或R2为H，R1为II，III，IV，V结构中任意一个
，其中，n为小于18的偶数；
其中，n为小于18的偶数；
其中A选自
本发明还提供了一氧化氮供体型白杨素衍生物的制备方法，对白杨素7位进行修饰，所述修饰为将白杨素先在7位烷基化再硝基化；或先将白杨素7位羧甲基化，再烷基化连接烷基链，然后硝基化；或先将白杨素7位羧甲基化，得到羧甲基化白杨素，再与呋咱氧化物或呋咱氧化物连接羟基苯甲醇的化合物酯化。
上述方法中所述烷基化为白杨素7位羟基与二溴烷烃Br(CH2)nBr反应，硝基化采用硝酸银为硝化剂；所述羧甲基化为白杨素7位羟基先与溴乙酸酯反应，酯再进行水解；所述呋咱氧化物结构为
所述羟基苯甲醇包括邻位、对位或间位羟基苯甲醇。
对白杨素7位进行修饰后，可再对5位进行修饰，形成烷氧基或酯基。
上述对白杨素5位的修饰为羟基与醋酐进行酯化。
通式II化合物的制备过程如下 白杨素(1)0.01mol，无水碳酸钾0.005mol及丙酮150ml，加热至沸直至溶液变澄清，再逐滴加入二溴烷烃0.05mol，回流24h。抽滤，取滤液浓缩得黄色固体，将此固体依次用石油醚，1％的氢氧化钠水溶液，水洗数次，干燥，得中间产物(2系列)；中间产物(2系列)0.005mol和无水乙腈50ml，加热至50℃，再加入硝酸银0.025mol的乙腈溶液20ml，继续升温至70℃，避光反应1h。抽滤除去溴化银沉淀，滤液浓缩，得浅黄色固体，水洗数遍至滤液澄清，干燥，然后用二氯甲烷溶解，弃掉不溶物，浓缩溶剂得黄色固体(3系列)；取该固体(3系列)0.001mol，无水碳酸钾0.001mol，无水丙酮50ml于烧瓶中，加热开始回流，滴加0.005mol醋酐，继续回流反应24h，抽滤去滤渣，滤液蒸干得淡黄色沉淀，用乙醇洗涤，乙酸乙酯重结晶等米黄色固体产物(4系列)。
n＝2，4，6，等小于18的偶数 通式III化合物的制备过程如下 白杨素(1)0.01mol，无水碳酸钾0.005mol及丙酮150ml，加热至沸直至溶液变澄清，滴加入溴乙酸乙酯，0.02mol，回流24h。抽滤，滤液浓缩得黄色固体，固体依次用石油醚洗，1％的氢氧化钠水溶液，水洗数次，干燥，得浅黄色固体(5)；用此浅黄色固体(5)0.005mol，甲醇30ml，氢氧化钾0.032mol，加热回流，搅拌8h，得到不溶于甲醇的黄色固体。减压蒸出甲醇，加水溶解，用1mol/L盐酸调PH至2。抽滤得黄色固体，水洗3次，干燥，得浅黄色固体(6)；用浅黄色固体(6)0.05mol，三乙胺0.015mol，丙酮60ml，回流30min，再加入二溴烷烃0.025mol，继续加热回流5h，抽滤除去季铵盐的沉淀，滤液浓缩得固体，固体依次用石油醚，乙醇洗2次，得黄色固体，用二氯甲烷溶解，弃掉不溶物，所得固体再用乙酸乙酯-石油醚重结晶得淡黄色固体(7系列)；用该淡
n＝2，4，6，等小于18的偶数 黄色固体(7系列)0.005mol和无水乙腈30ml，加热至50℃，再加入硝酸银0.0025mmol的无水乙腈溶液20ml，继续升温至70℃，避光反应1h。抽滤除去溴化银沉淀，滤液浓缩，得浅黄色固体，将此固体用水洗数遍至滤液澄清，干燥，然后用二氯甲烷溶解弃掉不溶物，浓缩溶剂得黄色固体产物(8系列)。通式IV化合物的制备过程如下 7-羧甲基白杨素(6)0.005mol悬浮于60ml无水二氯甲烷中，呋咱氧化物(10)0.005mol，DCC，0.005mol和DMAP 0.002mol，25℃搅拌过夜，生成白色沉淀。滤去沉淀，取滤液浓缩得深黄色微粘固体。加入适量二氯甲烷溶解，再加入石油醚析出淡黄色粉末状固体，并依次用5％的碳酸钾溶液，水各洗3次，干燥所得固体再用乙酸乙酯-石油醚重结晶得淡黄色固体(9)
通式 V化合物的制备过程如下 呋咱氧化物(10)0.02mol溶于50ml无水二氯甲烷中，加入2ml无水吡啶，于冰浴下逐滴加入二氯亚砜5ml和二氯甲烷10ml的混合溶液，加完温度上升到25℃并搅拌过夜。将反应液倒入100ml冰水中，分出二氯甲烷层，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗2次，饱和食盐水洗1次，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，得浅黄色油状物(11)，备用。将羟基苯甲醇0.02mol溶于50ml乙腈中，加入无水碳酸钾0.06mol，碘化钾0.02mol，剧烈搅拌下加入溶有上述油状物(11)的乙腈溶液50ml，25℃下搅拌4h，抽滤，浓缩，残留物用乙醚(150ml)溶解，依次用饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水各洗2次，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，得黄色固体，用乙酸乙酯-石油醚重结晶得白色粉末状固体(12系列)，供下一步使用。7-羧甲基白杨素(5)，0.005mol悬浮于无水二氯甲烷35ml中，加入上述白色粉末状固体(12系列)0.005mol，DCC，0.005mol和DMAP 0.002mol，25℃搅拌过夜，生成白色沉淀。滤去沉淀，取滤液浓缩得深黄色微粘固体。加入适量二氯甲烷溶解，再加入石油醚析出淡黄色粉末状固体，并依次用5％的碳酸钾溶液，水各洗3次，干燥所得固体再用乙酸乙酯-石油醚重结晶得产品(13系列)。
上述一氧化氮供体型白杨素衍生物在制备治疗糖尿病、糖尿病心血管并发症、代谢综合症或其相关疾病药物中的用途。
上述糖尿病心血管并发症、代谢综合征或其相关疾病是高血压、缺血性血管病变、脑血栓、粥样硬化、冠心病、血脂紊乱或肥胖。
本发明提供的一氧化氮供体型白杨素衍生物在体内能缓慢释放一氧化氮和白杨素衍生物，发挥降糖、降压、促进血管生成和改善血管内皮功能以及脂质代谢异常的作用，可开发用来治疗糖尿病、糖尿病心血管并发症和代谢综合征及其相关疾病等。
图1是本发明化合物3即7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素MTT实验检测细胞活性实验结果； 图2是本发明化合物3即7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs-12)24小时对细胞培养液中NO含量的影响； 图3是本发明化合物3即7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素降低2型糖尿病大鼠空腹血糖实验结果； 图4是本发明化合物3即7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素降低2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗实验结果，HOMA-IR＝空腹血胰岛素(μU/ml)×空腹血糖(mmol/l)/22.5； 图5是本发明化合物3即7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素降低2型糖尿病大鼠空腹血甘油三脂实验结果； 图6是本发明化合物3即7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素升高2型糖尿病大鼠空腹血高密度脂蛋白实验结果； 图7是本发明化合物3即7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素降低2型糖尿病大鼠空腹血总胆固醇实验结果； 图8是本发明化合物3即7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素降低2型糖尿病大鼠空腹血低密度脂蛋白实验结果； 图9是本发明化合物3即7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素降低2型糖尿病大鼠空腹丙二醛实验结果； 图10是本发明化合物3即7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素改善2型糖尿病大鼠血管内皮依赖性舒张功能实验结果； 图11是本发明化合物3即7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素降低自发性高血压(SHR)大鼠血压实验结果； 图12是本发明化合物3即7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素改善自发性高血压(SHR)大鼠血管内皮依赖性舒张功能实验结果； 图13是本发明化合物3即7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素促进鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成实验结果，A是对照；B是0.3％DMSO；C是0.01mmol/LNCh；D是0.03mmol/LNCh；E是0.1mmol/LNCh；F是0.1mmol/L白杨素；G是0.1mmol/L硝普钠。
具体实施例方式 实施例1
白杨素(1)0.01mol，无水碳酸钾0.005mol及丙酮150ml，加热至沸直至溶液变澄清，再逐滴加入1，2-二溴丁烷0.05mol，回流24h。抽滤，取滤液浓缩得黄色固体，将此固体依次用石油醚洗，1％的氢氧化钠，水洗数次，干燥，得中间产物，浅黄色固体(2)；产率74.5％，mp 146～147℃。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)12.71(s，1H)，7.87～7.89(m，2H)，7.52～7.56(m，3H)，6.74(s，1H)，6.49～6.50(d，1H)，6.361～6.367(d，1H)，4.07～4.10(m，2H))，3.48～3.51(m，2H)，1.98～2.12(m，4H)。中间产物(2)0.005mol和无水乙腈50ml，加热至50℃，再加入硝酸银0.025mol的乙腈溶液20ml，继续升温至70℃，避光反应1h。抽滤除去溴化银沉淀，滤液浓缩，得浅黄色固体，水洗数遍至滤液澄清，干燥，然后用二氯甲烷溶解弃掉不溶物，浓缩溶剂得黄色固体(3)。产率93％，mp 122～123℃。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)12.73(s，1H)，7.87～7.89(m，2H)，7.52～7.54(d，3H)，6.67(s，1H)，6.490～6.495(d，1H)，6.354～6.359(d，1H)，4.56(s，2H)，4.09(s，2H)，1.96(s，4H)。EIMS m/z371。取该固体(3)0.001mol，无水碳酸钾0.001mol，无水丙酮50ml于烧瓶中，加热开始回流，滴加0.005mol醋酐，继续回流反应24h，抽率去虑渣，虑液蒸干得淡黄色沉淀，用乙醇洗涤，乙酸乙酯重结晶等米黄色固体产物(4)。产率51％，mp 106～107℃。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)7.85～7.86(d，2H)，7.52(s，3H)，6.87(s，1H)，6.61(s，2H)，4.56(s，2H)，4.11(s，2H)，2.44(s，3H)，1.97(s，4H)。EIMSm/z413。
实施例2
白杨素(1)0.01mol，无水碳酸钾0.005mol及丙酮150ml，加热至沸直至溶液变澄清，滴加入溴乙酸乙酯，0.02mol，回流24h。抽滤，滤液浓缩得黄色固体，固体依次用石油醚洗，1％的氢氧化钠，水洗数次，干燥，得浅黄色固体(5)。产率71％.mp160℃。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)12.75(s，1H)，7.87-7.89(m，2H)，7.51-7.57(m，3H)，6.68(s，1H)，6.52-6.53(d，1H)，6.372-6.377(d，1H)，4.7(s，2H)，4.27-4.32(m，2H)，1.30-1.34(m，3H)。用此浅黄色固体(5)0.005mol，甲醇30ml，氢氧化钾0.032mol，加热回流，搅拌8h，得到不溶于甲醇的黄色固体。减压蒸出甲醇，加水溶解，用1mol/L盐酸调PH至2。抽滤得黄色固体，水洗3次，干燥，得浅黄色固体(6)；收率90％。mp284-285℃。1HNMR(CDCl3)δ(ppm)12.78(s，1H)，8.08-8.09(d，2H)，7.55-7.63(m，3H)，7.03(s，1H)，6.80-6.81(d，1H)，6.38-6.39(d，1H)，4.83(s，2H)。用浅黄色固体(6)0.05mol，三乙胺0.015mol，丙酮60ml，回流30min，再加入1，2-二溴丁烷0.025mol，继续加热回流5h，抽滤除去季铵盐的沉淀，滤液浓缩得固体，固体依次用石油醚，乙醇洗2次，得黄色固体，用二氯甲烷溶解，弃掉不溶物，所得固体再用乙酸乙酯-石油醚重结晶得淡黄色固体(7)；用该淡黄色固体(7)0.005mol和无水乙腈30ml，加热至50℃，再加入硝酸银0.0025mmol的无水乙腈溶液20ml，继续升温至70℃，避光反应1h。抽滤除去溴化银沉淀，滤液浓缩，得浅黄色固体，将此固体用水洗数遍至滤液澄清，干燥，然后用二氯甲烷溶解弃掉不溶物，浓缩溶剂得黄色固体产物(8)。收率75.2％，mp122～123℃。1HNMR(CDCl3)δ(ppm)12.78(s，1H)，7.88～7.90(d，2H)，7.53～7.57(m，3H)，6.69(s，1H)，6.53(s，1H)，6.36(s，1H)，4.72(s，2H)，4.47(s，2H)，4.28(m，2H)，1.81(s，4H)。
实施例3
将7-羧甲基白杨素(6)0.005mol悬浮于60ml无水二氯甲烷中，呋咱氧化物(10)0.005mol，DCC，0.005mol和DMAP 0.002mol，25℃搅拌过夜，生成白色沉淀。滤去沉淀，取滤液浓缩得深黄色微粘固体。加入适量二氯甲烷溶解，再加入石油醚析出淡黄色粉末状固体，并依次用5％的碳酸钾溶液，水各洗3次，干燥所得固体再用乙酸乙酯-石油醚重结晶得淡黄色固体(9)。收率63％，mp174-175℃，1H NMR(CDCl3)δ(ppm)12.76(s，1H)，7.87-7.89(m，2H)，7.63-7.65(m，2H)，7.49-7.57(m，6H)，6.68(s，1H)，6.46-6.47(d，1H)，6.32-6.33(d，1H)，5.31(s，2H)，4.76(s，2H)。
实施例4
呋咱氧化物(10)0.02mol溶于50ml无水二氯甲烷中，加入2ml无水吡啶，于冰浴下逐滴加入二氯亚砜5ml和二氯甲烷10ml的混合溶液，加完温度上升到25℃并搅拌过夜。将反应液倒入100ml冰水中，分出二氯甲烷层，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗2次，饱和食盐水洗1次，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，得浅黄色油状物(11)，备用。将对羟基苯甲醇0.02mol溶于50ml乙腈中，加入无水碳酸钾0.06mol，碘化钾0.02mol，剧烈搅拌下加入溶有上述油状物(11)的乙腈溶液50ml，25℃下搅拌4h，抽滤，浓缩，残留物用乙醚(150ml)溶解，依次用饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水各洗2次，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，得黄色固体，用乙酸乙酯-石油醚重结晶得白色粉末状固体(12)，供下一步使用。7-羧甲基白杨素(6)，0.005mol悬浮于无水二氯甲烷35ml中，加入上述白色粉末状固体(12)0.005mol，DCC，0.005mol和DMAP 0.002mol，25℃搅拌过夜，生成白色沉淀。滤去沉淀，取滤液浓缩得深黄色微粘固体。加入适量二氯甲烷溶解，再加入石油醚析出淡黄色粉末状固体，并依次用5％的碳酸钾溶液，水各洗3次，干燥所得固体再用乙酸乙酯-石油醚重结晶得产品(13)。收率68％，mp155-156℃，1HNMR(CDCl3)δ(ppm)12.76(s，1H)，7.87(s，4H)，7.55(s，6H)，7.32(s，1H)，6.97-7.02(d，3H)，6.69(s，1H)，6.53(s，1H)，6.39(d，1H)，5.25(s，2H)，5.10(s，2H)，4.80(s，2H)。
实施例5 本发明部分化合物的药理实验及结果如下 1、体外实验 1.1MTT实验检测细胞活性取人脐静脉内皮细胞株(HUVECs-12)解冻复苏后，无菌条件下移入细胞培养瓶中加入含10％新生小牛血清和双抗的低糖DMEM培养基置CO2培养箱中37℃静置培养。每隔2d换培养液1次，待细胞生长亚融合后弃去细胞培养液，加入适量0.25％胰蛋白酶消化吹打分散细胞后，再加入上述培养液制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×105/ml，每孔按0.2ml接种于96孔细胞培养板。待细胞生长融合后换用不同条件的培养液进行实验。实验分为11组。正常对照组不含任何药物的培养液，葡萄糖浓度为5.5mmol/L；高糖损伤组葡萄糖终浓度为35.5mmol/L；渗透压对照组终浓度为30mmol/L蔗糖及5.5mmol/L葡萄糖；7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素组(浓度为1、3、10、30mmol/L)及高糖组，高糖组葡萄糖终浓度为35.5mmol/L；加入各处理因素后继续培养24h，再每孔加20μl MTT(5mg/ml)，37C，5％CO2孵育4小时，吸去上清，每孔加入150μl DMSO，震荡混匀后酶标仪上测定546nm的OD值。此实验结果表明1-10μmol/L7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素剂量依赖地促进人脐静脉内皮细胞增殖活性，而30μmol/L及以上浓度7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素则抑制人脐静脉内皮细胞增殖。所以后面细胞实验7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素的剂量都用1-10μmol/L浓度。结果如图1所示，1-10μmol/L 7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素剂量依赖地促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs-12)增殖活性，3，10μmol/L两个浓度与对照组比较具有统计学意义。35.5mmol/L葡萄糖抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs-12)增殖活性，1-10μmol/L 7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素剂量依赖地保护高糖对人脐静脉内皮细胞(HUVECs-12)增殖活性的抑制作用，3，10μmol/L两个浓度与高糖对照组比较具有统计学意义。1-10μmol/L对羟基苯甲醇呋咱类白杨素(化合物13，结果未列出)促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs-12)增殖活性作用类似7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素，但效价强度较低一些。
1.2细胞培养液中NO含量测定常规培养人脐静脉内皮细胞株(HUVECs-12)，待细胞生长亚融合后消化吹打分散细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，每孔按1ml接种于24孔细胞培养板。待细胞生长融合后换用不同条件的培养液进行实验。实验分为12组。正常对照组不含任何药物的培养液，葡萄糖浓度为5.5mmol/L；高糖损伤组葡萄糖终浓度为35.5mmol/L；7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素组(浓度为1、3、10mmol/L)及高糖组，一氧化氮合酶抑制剂N硝基L-精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methylester，L-NAME，浓度为1mmol/L)组及高糖组；L-NAME(浓度为1mmol/L)加7-[4(硝基氧基)丁氧基]-白杨素(浓度为10mmol/L)组及高糖组；以上高糖组葡萄糖终浓度均为35.5mmol/L，L-NAME均提前1小时加入。加入各处理因素后继续培养24h。收集各组细胞培养液，硝酸还原酶法测定细胞培养液中NO的含量。结果如图2所示，1-10μmol/L7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素剂量依赖地促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs-12)释放NO，3，10μmol/L两个浓度与对照组比较具有统计学意义。35.5mmol/L葡萄糖抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs-12))释放NO，1-10μmol/L 7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素剂量依赖地保护高糖对人脐静脉内皮细胞(HUVECs-12))NO释放的抑制作用，10μmol/L浓度与高糖对照组比较具有统计学意义。用一氧化氮合酶抑制剂L-NAME预处理人脐静脉内皮细胞1小时，可减少7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素对人脐静脉内皮细胞释放NO的促进作用，但比单用L-NAME释放NO增多。表明7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素能提供外源性NO及促进人脐静脉内皮细胞内源性NO的释放。1-10μmol/L对羟基苯甲醇呋咱类白杨素(化合物13，结果未列出)促进NO释放作用类似7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素。
2、2型糖尿病大鼠的制备和实验分组 雄性SD大鼠80只，体重200±20g，本实验室普通饮食饲养7d后，随机分为正常对照组(10只)和模型组(70只)。对照组始终饲以普通饮食。模型组饲以高脂饮食(普通饲料49.5％，猪油10％，蔗糖20％，猪胆盐0.5％，胆固醇1％)，随意饮水，人工光照明暗各12小时。4周后模型组予以腹腔注射35mg/kg链尿佐菌素(STZ)，继续高脂饮食。2周后测大鼠空腹血糖，大鼠空腹血糖＞7mmol/被认为是2型糖尿病模型成功大鼠，模型成功大鼠56只，再随机分为糖尿病模型组；20％乙醇溶媒组；7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素(NCh)高(20mg/kg)、中(10mg/kg)、低(5mg/kg)剂量治疗组；对羟基苯甲醇呋咱类白杨素(化合物13，浓度为20mg/kg，实验结果未附图)和罗格列酮(5mg/kg)治疗组，每组各8只，继续饲以高脂饮食，正常对照组(8只)始终饲以普通饮食。溶媒组及治疗组同时以20％乙醇或治疗药物灌胃，模型组及正常对照组以等体积蒸馏水灌胃，每天上午10点灌胃，每天一次，连续给药2周。给药结束后第二天，测八组大鼠的空腹血糖、血脂、血浆中胰岛素、一氧化氮、丙二醛含量和离体血管内皮依赖性舒张功能检测。结果如图3-9所示，图3显示，5-20mg/kg7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素剂量依赖地降低2型糖尿病大鼠空腹血糖，高(20mg/kg)、中(10mg/kg)、低(5mg/kg)三个剂量组与2型糖尿病组比较均具有统计学意义。高(20mg/kg)剂量组降糖作用强于罗格列酮(5mg/kg)阳性药物组。图4显示，5-20mg/kg7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素剂量依赖地降低2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗，高(20mg/kg)、中(10mg/kg)、低(5mg/kg)三个剂量组与2型糖尿病组比较均具有统计学意义。中(10mg/kg)、高(20mg/kg)剂量组降低2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗作用强于罗格列酮(5mg/kg)阳性药物组。图5显示，5-20mg/kg7[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素剂量依赖地降低2型糖尿病大鼠空腹血甘油三酯水平，高(20mg/kg)、中(10mg/kg)、低(5mg/kg)三个剂量组与2型糖尿病组比较均具有统计学意义。图6显示，5-20mg/kg7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素增高2型糖尿病大鼠空腹血高密度脂蛋白水平，高(20mg/kg)、低(5mg/kg)两个剂量组与2型糖尿病组比较均具有统计学意义。高(20mg/kg)、中(10mg/kg)、低(5mg/kg)三个剂量组增高2型糖尿病大鼠空腹血高密度脂蛋白作用强于罗格列酮(5mg/kg)阳性药物组。图7显示，5-20mg/kg7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素剂量依赖地降低2型糖尿病大鼠空腹血总胆固醇水平，高(20mg/kg)、中(10mg/kg)、低(5mg/kg)三个剂量组与2型糖尿病组比较均具有统计学意义。图8显示，5-20mg/kg7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素降低2型糖尿病大鼠空腹血低密度脂蛋白水平，高(20mg/kg)、中(10mg/kg)、低(5mg/kg)三个剂量组与2型糖尿病组比较均具有统计学意义。高(20mg/kg)、低(5mg/kg)两个剂量组降低2型糖尿病大鼠空腹血低密度脂蛋白作用强于罗格列酮(5mg/kg)阳性药物组。图9显示，5-20mg/kg7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素降低2型糖尿病大鼠血丙二醛水平，高(20mg/kg)、中(10mg/kg)、低(5mg/kg)三个剂量组与2型糖尿病组比较均具有统计学意义。高(20mg/kg)、中(10mg/kg)、低(5mg/kg)三个剂量组降低2型糖尿病大鼠血丙二醛作用强于罗格列酮(5mg/kg)阳性药物组。20mg/kg对羟基苯甲醇呋咱类白杨素(化合物13，结果未列出)作用类似7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素，其降低2型糖尿病大鼠空腹血糖及改善2型糖尿病大鼠脂类代谢异常的效价强度较7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素低一些，但其降低2型糖尿病大鼠血丙二醛水平作用较7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素强。
3、自发性高血压大鼠实验分组 自发性高血压(SHR)大鼠及SD大鼠各10只，饲以普通饮食，随意饮水，人工光照明暗各12小时。取SHR大鼠7只和SD大鼠5只，给予7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素(NCh)20mg/kg灌胃，剩余大鼠给予溶媒羧甲基纤维素钠灌胃，每天上午10点灌胃，每天一次，连续给药1周，全部大鼠每天定时监测血压变化。结果如图11所示，图11显示，20mg/kg7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素能降低自发性高血压(SHR)大鼠收缩压，与自发性高血压(SHR)大鼠模型组比较具有统计学意义。20mg/kg7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素对SD大鼠降压作用与SD大鼠模型组比较不具有统计学意义。
4、离体血管内皮依赖性舒张功能检测 各实验组大鼠(2型糖尿病实验大鼠和自发性高血压实验大鼠)在戊巴比妥钠(30mg/kg，腹腔注射)麻醉下开胸，迅速分离、剪取胸主动脉段，置于充以95％O2和5％CO2混合气体的改良克氏液中，小心剪去血管周围结缔组织，清除血管内血液，剪成3-4mm长的血管环进行离体血管张力实验。血管环一端固定于盛有20ml的充满95％02和5％CO2混合气体的改良克氏液的水浴槽(37℃)中，另一端与张力换能器相连，调节静息张力为2g，每隔15min更换克氏液1次，平衡60min，加用KCL(60mmol/L)收缩血管，收缩达最大张力后冲洗2～3次后，重新平衡血管环30min，用苯肾上腺素(10-6mol/L)收缩血管，待稳定后观察累积浓度的乙酰胆碱(3×10-9～10-6mol/L)诱导血管内皮依赖性舒张，观察各组动物血管内皮依赖性舒张功能。结果如图10及12所示，图12显示，自发性高血压(SHR)大鼠血管内皮依赖性舒张功能明显下降，20mg/kg7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素能改善自发性高血压(SHR)大鼠血管内皮依赖性舒张功能，与自发性高血压(SHR)大鼠模型组比较具有统计学意义。20mg/kg7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素能增强SD大鼠血管内皮依赖性舒张功能，与SD大鼠模型组比较具有统计学意义。图10显示，2型糖尿病大鼠血管内皮依赖性舒张功能明显下降，5-20mg/kg7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素能改善2型糖尿病大鼠血管内皮依赖性舒张功能，高(20mg/kg)、中(10mg/kg)、低(5mg/kg)三个剂量组与2型糖尿病大鼠模型组比较均具有统计学意义。20mg/kg对羟基苯甲醇呋咱类白杨素(化合物13，结果未列出)作用类似7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素，能改善2型糖尿病大鼠血管内皮依赖性舒张功能，与2型糖尿病大鼠模型组比较具有统计学意义。
5、鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验 取孵化第7天的胚蛋，酒精消毒后用镊子在气室端开-0.5×0.5cm2大小口，去除气室膜，可观察到CAM膜上血管网的分布，7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素(NCh)(浓度为0.01、0.03、0.1mmol/L)；PBS(假手术组)；0.3％DMSO(溶媒)以及白杨素(chrysin0.1mmol/L)和硝普钠(SNP 0.1mmol/L)以10μl的体积加到灭菌定性滤纸上风干后，用镊子轻轻将载样滤纸置于CAM血管较少的部位，然后用灭菌透明胶封口，继续孵育48小时。孵育结束后，撕开封口透明胶带，穿刺CAM膜，注入适量10％甲醛溶液，固定10分钟，剪下CAM膜，在倒置显微镜下观察并拍照。结果如图13所示，图13显示，0.01、0.03、0.1mmol/L7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素和硝普钠(SNP 0.1mmol/L)能促进鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成，与0.3％DMSO溶媒组比较具有统计学意义。0.03、0.1mmol/L两个剂量组7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素促进鸡胚绒毛尿囊膜血管生成作用较硝普钠(SNP 0.1mmol/L)强。白杨素(0.1mmol/L)不具有促进鸡胚绒毛尿囊膜血管生成作用。0.01、0.03、0.1mmol/L对羟基苯甲醇呋咱类白杨素(化合物13，结果未列出)作用类似7-[4-(硝基氧基)丁氧基]-白杨素，具有较强的促进鸡胚绒毛尿囊膜血管生成作用。
表1各组2型糖尿病大鼠对10-9-10-6累积浓度乙酰胆碱舒张效应
权利要求
1.一氧化氮供体型白杨素衍生物，其特征在于，具有通式I结构
I
其中，R2为H、-CH3、-CH2CH3或
R1为以下II，III，IV，V结构中任意一个
其中，n为小于18的偶数；
其中，n为小于18的偶数；
其中A选自
2.根据权利要求1所述的一氧化氮供体型白杨素衍生物，其特征在于，R2为
R1为II结构-(CH2)nONO2或R2为H，R1为II，III，IV，V结构中任意一个
其中，n为小于18的偶数；
其中，n为小于18的偶数；
其中A选自
3.权利要求1或2所述的一氧化氮供体型白杨素衍生物的制备方法，其特征在于，对白杨素7位进行修饰，所述修饰为将白杨素先在7位烷基化再硝基化；或先将白杨素7位羧甲基化，再烷基化连接烷基链，然后硝基化；或先将白杨素7位羧甲基化，得到羧甲基化白杨素，再与呋咱氧化物或呋咱氧化物连接羟基苯甲醇的化合物酯化。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述烷基化为白杨素7位羟基与二溴烷烃Br(CH2)nBr反应，硝基化采用硝酸银为硝化剂；所述羧甲基化为白杨素7位羟基先与溴乙酸酯反应，酯再进行水解；所述呋咱氧化物结构为
所述羟基苯甲醇包括邻位、对位或间位羟基苯甲醇。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，对白杨素7位进行修饰后，再对5位进行修饰，形成烷氧基或酯基。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，对白杨素5位的修饰为羟基与醋酐酯化。
7.权利要求1至2之一所述的一氧化氮供体型白杨素衍生物在制备治疗糖尿病、糖尿病心血管并发症、代谢综合症或内皮功能受损性疾病药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述糖尿病心血管并发症、代谢综合征或内皮功能受损性疾病是高血压、缺血性血管病变、脑血栓、粥样硬化、冠心病、血脂紊乱或肥胖。
全文摘要
本发明涉及药物化学领域，具体提供了一系列一氧化氮供体型白杨素衍生物，由白杨素在7位和5位进行修饰制备得到，在体内能释放一氧化氮和白杨素衍生物，发挥降糖、降压、促进血管生成和改善血管内皮功能以及脂质代谢异常的作用，具有在制备治疗糖尿病、糖尿病心血管并发症和代谢综合征及内皮功能受损性疾病药物中的用途。
文档编号C07D311/30GK101768145SQ20081018987
公开日2010年7月7日 申请日期2008年12月31日 优先权日2008年12月31日
发明者邹晓青, 彭圣明, 李元建, 姜德建, 邓汉武 申请人:中南大学